Transcriptional activation by Sp1 and post-transcriptional repression by muscle-specific microRNA miR-133 of expression of human ERG1 and KCNQ1 genes and potential implication in arrhythmogenesis

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mass spectrometry as a tool to dissect the role of chromatin assembly factors in regulating nucleosome assembly

L'assemblage des nucléosomes est étroitement couplée à la synthèse des histones ainsi qu’à la réplication et la réparation de l’ADN durant la phase S. Ce processus implique un mécanisme de contrôle qui contribue soigneusement et de manière régulée à l’assemblage de l’ADN en chromatine. L'assemblage des nucléosomes durant la synthèse de l’ADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilité génomique. Cette thèse décrit la caractérisation par spectrométrie de masse(SM) des protéines jouant un rôle critique dans l’assemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus précisément, la phosphorylation de deux facteurs d’assemblage des nucléosome, le facteur CAF-1, une chaperone d’histone qui participe à l'assemblage de la chromatine spécifiquement couplée à la réplication de l'ADN, ainsi que le complexe protéique Hir, jouant de plus un rôle important dans la régulation transcriptionelle des gènes d’histones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l'ADN, a été examiné. La caractérisation des sites de phosphorylation par SM nécéssite la séparation des protéines par éléctrophorèse suivi d’une coloration a l’argent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration à l’argent induit un artéfact de sulfatation. Plus précisément, cet artéfact est causé par un réactif spécifiquement utilisé lors de la coloration. La sulfatation présente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, l’incrément de masse observé sur les peptides sulfatés et phosphorylés (+80 Da) nécéssite des instruments offrant une haute résolution et haute précision de masse pour différencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons d’abord démontré par SM que Cac1, la plus grande sous-unité du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intéréssant, certains de ces sites contiennent des séquences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces résultats fournissent les premières évidences que CAF-1 est potentiellement régulé par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifiés a ensuite été évaluée. Nous avons démontré que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle à la répréssion transcriptionelle des gènes au niveau des télomères. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas être nécéssaire pour d’autres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spécifiquement la fonction de CAF-1 aux structures hétérochromatiques des télomères. Ensuite, nous avons identifiés une intéraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des études in vitro ont également demontré que cette kinase phosphoryle spécifiquement Cac1 Ser-503, suggérant un rôle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans l’assemblage et la stabilité de la structure hétérochromatique aux télomères. Finalement, les analyses par SM nous ont également permi de montrer que la sous-unité Hpc2 du complexe Hir est phosphorylée sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM d’un site spécifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, s’est révélée être fortement induite suite à l’activation du point de contrôle de réplication (le “checkpoint”) suite au dommage a l’ADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshorylée par les kinases de point de contrôle de manière Mec1/Tel1- et Rad53-dépendante. Nos données préliminaires suggèrent ainsi que la capacité du complex Hir de réguler la répréssion transcriptionelle des gènes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en réponse au dommage de l'ADN est médiée par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux études mettent en évidence l'importance de la spectrométrie de masse dans la caractérisation des sites de phosphorylation des protéines, nous permettant ainsi de comprendre plus précisement les mécanismes de régulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthèse des histones.

The Role of MicroRNA Regulation of Cardiac Ion Channel in Arrhythmia

La fibrillation auriculaire (FA) est le trouble du rythme le plus fréquemment observé en pratique clinique. Elle constitue un risque important de morbi-mortalité. Le traitement de la FA reste un défi majeur en lien avec les nombreux effets secondaires associés aux approches thérapeutiques actuelles. Dans ce contexte, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la FA est essentielle pour le développement de nouvelles thérapies offrant un meilleur rapport bénéfice/risque pour les patients. La FA est caractérisée par i) un remodelage électrique délétère associé le plus souvent ii) à un remodelage structurel du myocarde favorisant la récurrence et le maintien de l’arythmie. La diminution de la période réfractaire effective au sein du tissu auriculaire est un élément clef du remodelage électrique. Le remodelage structurel, quant à lui, se manifeste principalement par une fibrose tissulaire qui altère la propagation de l’influx électrique dans les oreillettes. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la mise en place de ces deux substrats restent mal connus. Récemment, le rôle des microARNs (miARNs) a été pointé du doigt dans de nombreuses pathologies notamment cardiaques. Dans ce contexte les objectifs principaux de ce travail ont été i) d'acquérir une compréhension approfondie du rôle des miARNs dans la régulation de l’expression des canaux ioniques et ii) de mieux comprendre le rôle de ces molécules dans l’installation d’un substrat favorable a la FA. Nous avons, dans un premier temps, effectué une analyse bio-informatique combinée à des approches expérimentales spécifiques afin d’identifier clairement les miARNs démontrant un fort potentiel de régulation des gènes codant pour l’expression des canaux ioniques cardiaques humains. Nous avons identifié un nombre limité de miARNs cardiaques qui possédaient ces propriétés. Sur la base de ces résultats, nous avons démontré que l’altération de l'expression des canaux ioniques, observée dans diverse maladies cardiaques (par exemple, les cardiomyopathies, l’ischémie myocardique, et la fibrillation auriculaire), peut être soumise à ces miARNs suggérant leur implication dans l’arythmogénèse. La régulation du courant potassique IK1 est un facteur déterminant du remodelage électrique auriculaire associée à la FA. Les mécanismes moléculaires sous-jacents sont peu connus. Nous avons émis l’hypothèse que l'altération de l’expression des miARNs soit corrélée à l’augmentation de l’expression d’IK1 dans la FA. Nous avons constaté que l’expression de miR-26 est réduite dans la FA et qu’elle régule IK1 en modulant l’expression de sa sous-unité Kir2.1. Nous avons démontré que miR-26 est sous la répression transcriptionnelle du facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) et que l’activité accrue de NFATc3/c4, aboutit à une expression réduite de miR-26. En conséquence IK1 augmente lors de la FA. Nous avons enfin démontré que l’interférence in vivo de miR-26 influence la susceptibilité à la FA en régulant IK1, confirmant le rôle prépondérant de miR-26 dans le remodelage auriculaire électrique. La fibrose auriculaire est un constituant majeur du remodelage structurel associé à la FA, impliquant l'activation des fibroblastes et l’influx cellulaire du Ca2 +. Nous avons cherché à déterminer i) si le canal perméable au Ca2+, TRPC3, jouait un rôle dans la fibrose auriculaire en favorisant l'activation des fibroblastes et ii) étudié le rôle potentiel des miARNs dans ce contexte. Nous avons démontré que les canaux TRPC3 favorisent l’influx du Ca2 +, activant la signalisation Ca2 +-dépendante ERK et en conséquence activent la prolifération des fibroblastes. Nous avons également démontré que l’expression du TRPC3 est augmentée dans la FA et que le blocage in vivo de TRPC3 empêche le développement de substrats reliés à la FA. Nous avons par ailleurs validé que miR-26 régule les canaux TRPC3 en diminuant leur expression dans les fibroblastes. Enfin, nous avons montré que l'expression réduite du miR-26 est également due à l’activité augmentée de NFATc3/c4 dans les fibroblastes, expliquant ainsi l’augmentation de TRPC3 lors de la FA, confirmant la contribution de miR-26 dans le processus de remodelage structurel lié à la FA. En conclusion, nos résultats mettent en évidence l'importance des miARNs dans la régulation des canaux ioniques cardiaques. Notamment, miR-26 joue un rôle important dans le remodelage électrique et structurel associé à la FA et ce, en régulant IK1 et l’expression du canal TRPC3. Notre étude démasque ainsi un mécanisme moléculaire de contrôle de la FA innovateur associant des miARNs. miR-26 en particulier représente apres ces travaux une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour traiter la FA.

Etudes structurales et fonctionnelles des interactions de SUMO avec des proteines d'echafaudage modeles: TIF1beta, PIAS1 et PML

L’adaptation des cellules à leur environnement externe repose sur la transduction adéquate de signaux régulés par une pléthore d'événements moléculaires. Parmi ces événements moléculaires, les modifications post-traductionnelles (MPT) de protéines aident à intégrer, à traduire et à organiser de façon spatiotemporelle ces signaux pour que les cellules puissent réagir aux stimuli externes. Parmi les modifications post-traductionnelles, les petites protéines de la famille de l’Ubiquitine (Ublps, Ubiquitin-like proteins) jouent un rôle majeur dans presque toutes les voies de signalisation. Cette thèse rapporte des études fonctionnelles et structurales des interactions covalentes et non covalentes entre SUMO (Small Ubiquitin related MOdifier), un membre de la famille des Ublps, et trois protéines d'échafaudage, TIF1beta, le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc, PIAS1, une ligase E3 pour SUMO et PML, un suppresseur de tumeur. La première étude rapporte l'identification et la caractérisation biochimique des sites de SUMOylation de TIF1beta. Nous avons déterminé que la modification covalente de six résidus lysine par SUMO est essentielle à l’activité de répression de la transcription induit par TIF1beta. En outre, nous présentons des évidences indiquant que la SUMOylation de TIF1 exige non seulement sa capacité à homo-oligomériser, mais est aussi positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB des protéines à doigts de zinc. Partant de ce constat, nous postulons que les protéines KRAB-multidoigt de zinc recrutent leur corépresseur TIF1betaà des gènes cibles, mais aussi accentuent son activité répressive grâce à l'augmentation de sa SUMOylation. Notre seconde étude révèle qu’en plus de réprimer la transcription en tant que MPT covalente, SUMO joue aussi un rôle important dans la répression en tant que partenaire non covalent d’interactions protéine-protéine. Nous avons montré que SUMO interagit simultanément avec deux enzymes de la machinerie de SUMOylation, l’unique enzyme de conjugaison E2, UBC9, et la ligase E3 PIAS1 au sein d’un complexe ternaire répresseur. En outre, nous révélons que la formation du complexe ternaire PIAS1:SUMO:UBC9 est modulée par le niveau de phosphorylation de résidus sérine juxtaposés à un motif d’interaction avec SUMO (SIM) dans PIAS1. Ainsi, SUMO agit comme un adaptateur spécifique qui stabilise les interactions UBC9 E2: E3 PIAS1. Partant de ce constat, nous proposons que les enzymes E2 et E3 des autres systèmes Ublps exploitent des mécanismes similaires dans le cadre de leur fonction Enfin, notre troisième étude explore la régulation des interactions non covalentes de SUMO par la phosphorylation. En utilisant une combinaison d'études in vivo et in vitro, nous démontrons que l'interaction entre SUMO1 et PML est régi par la phosphorylation dépendant de CK2 sur quatre résidus sérine de PML. Les structures cristallographiques des complexes PML-SIM:SUMO1 révèlent que les phospho-sérines de PML contactent des résidus de la région basique de SUMO1. Sachant que la kinase CK2 peut être induite par des kinases activables par le stress, ces résultats suggèrent que les interactions non-covalentes avec SUMO sont modulées par le stress cellulaire. Sur la base de cette constatation, nous postulons que des événements analogues affectent des protéines contenant des séquences SIM ciblées par CK2. En résumé, cette étude révèle qu’en plus de son rôle de MPT, SUMO peut fonctionner comme un adaptateur permettant des interactions spécifiques entre protéines tel que pour les enzymes E3 et E2.

Homéostasie des histones en réponse au dommage à l’ADN et étude d’inhibiteurs de désacétylases d’importance clinique

La chromatine possède une plasticité complexe et essentielle pour répondre à différents mécanismes cellulaires fondamentaux tels la réplication, la transcription et la réparation de l’ADN. Les histones sont les constituants essentiels de la formation des nucléosomes qui assurent le bon fonctionnement cellulaire d’où l’intérêt de cette thèse d’y porter une attention particulière. Un dysfonctionnement de la chromatine est souvent associé à l’émergence du cancer. Le chapitre II de cette thèse focalise sur la répression transcriptionnelle des gènes d’histones par le complexe HIR (HIstone gene Repressor) en réponse au dommage à l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae. Lors de dommage à l’ADN en début de phase S, les kinases du point de contrôle Mec1, Tel1 et Rad53 s’assurent de bloquer les origines tardives de réplication pour limiter le nombre de collisions potentiellement mutagéniques ou cytotoxiques entre les ADN polymérases et les lésions persistantes dans l'ADN. Lorsque la synthèse totale d’ADN est soudainement ralentie par le point de contrôle, l’accumulation d'un excès d'histones nouvellement synthétisées est néfaste pour les cellules car les histones libres se lient de manière non-spécifique aux acides nucléiques. L'un des mécanismes mis en place afin de minimiser la quantité d’histones libres consiste à réprimer la transcription des gènes d'histones lors d'une chute rapide de la synthèse d'ADN, mais les bases moléculaires de ce mécanisme étaient très mal connues. Notre étude sur la répression des gènes d’histones en réponse aux agents génotoxiques nous a permis d’identifier que les kinases du point de contrôle jouent un rôle dans la répression des gènes d’histones. Avant le début de mon projet, il était déjà connu que le complexe HIR est requis pour la répression des gènes d’histones en phase G1, G2/M et lors de dommage à l’ADN en phase S. Par contre, la régulation du complexe HIR en réponse au dommage à l'ADN n'était pas connue. Nous avons démontré par des essais de spectrométrie de masse (SM) que Rad53 régule le complexe HIR en phosphorylant directement une de ses sous-unités, Hpc2, à de multiples résidus in vivo et in vitro. La phosphorylation d’Hpc2 est essentielle pour le recrutement aux promoteurs de gènes d’histones du complexe RSC (Remodels the Structure of Chromatin) dont la présence sur les promoteurs des gènes d'histones corrèle avec leur répression. De plus, nous avons mis à jour un nouveau mécanisme de régulation du complexe HIR durant la progression normale à travers le cycle cellulaire ainsi qu'en réponse aux agents génotoxiques. En effet, durant le cycle cellulaire normal, la protéine Hpc2 est très instable durant la transition G1/S afin de permettre la transcription des gènes d’histones et la production d'un pool d'histones néo-synthétisées juste avant l'initiation de la réplication de l’ADN. Toutefois, Hpc2 n'est instable que pour une brève période de temps durant la phase S. Ces résultats suggèrent qu'Hpc2 est une protéine clef pour la régulation de l'activité du complexe HIR et la répression des gènes d’histones lors du cycle cellulaire normal ainsi qu'en réponse au dommage à l’ADN. Dans le but de poursuivre notre étude sur la régulation des histones, le chapitre III de ma thèse concerne l’analyse globale de l’acétylation des histones induite par les inhibiteurs d’histone désacétylases (HDACi) dans les cellules normales et cancéreuses. Les histones désacétylases (HDACs) sont les enzymes qui enlèvent l’acétylation sur les lysines des histones. Dans plusieurs types de cancers, les HDACs contribuent à l’oncogenèse par leur fusion aberrante avec des complexes protéiques oncogéniques. Les perturbations causées mènent souvent à un état silencieux anormal des suppresseurs de tumeurs. Les HDACs sont donc une cible de choix dans le traitement des cancers engendrés par ces protéines de fusion. Notre étude de l’effet sur l’acétylation des histones de deux inhibiteurs d'HDACs de relevance clinique, le vorinostat (SAHA) et l’entinostat (MS-275), a permis de démontrer une augmentation élevée de l’acétylation globale des histones H3 et H4, contrairement à H2A et H2B, et ce, autant chez les cellules normales que cancéreuses. Notre quantification en SM de l'acétylation des histones a révélé de façon inattendue que la stœchiométrie d'acétylation sur la lysine 56 de l’histone H3 (H3K56Ac) est de seulement 0,03% et, de manière surprenante, cette stœchiométrie n'augmente pas dans des cellules traitées avec différents HDACi. Plusieurs études de H3K56Ac chez l’humain présentes dans la littérature ont rapporté des résultats irréconciliables. Qui plus est, H3K56Ac était considéré comme un biomarqueur potentiel dans le diagnostic et pronostic de plusieurs types de cancers. C’est pourquoi nous avons porté notre attention sur la spécificité des anticorps utilisés et avons déterminé qu’une grande majorité d’anticorps utilisés dans la littérature reconnaissent d’autres sites d'acétylation de l’histone H3, notamment H3K9Ac dont la stœchiométrie d'acétylation in vivo est beaucoup plus élevée que celle d'H3K56Ac. De plus, le chapitre IV fait suite à notre étude sur l’acétylation des histones et consiste en un rapport spécial de recherche décrivant la fonction de H3K56Ac chez la levure et l’homme et comporte également une évaluation d’un anticorps supposément spécifique d'H3K56Ac en tant qu'outil diagnostic du cancer chez l’humain.

Étude de l’interaction Ikaros/voie de signalisation Notch au cours de l'érythropoïèse

Tout au long de la vie d’un individu, il existe un nombre optimal de cellules à produire et de progéniteurs à conserver en réserve. On parle de maintien de l’homéostasie tissulaire. De façon générale, l’organisme a cinq possibilités pour réguler l’homéostasie : l’autorenouvellement et la quiescence, souvent utilisés pour maintenir un ‘pool’ fonctionnel de progéniteurs, la différenciation qui permet de produire des cellules effectrices, l’apoptose et la sénescence, qui permettent de limiter la production de cellules ou encore d’en faire diminuer le nombre quand elles sont en excès. La régulation de ces quatre mécanismes peut se faire de façon extrinsèque en passant par différentes voies de signalisation combinées à l’action intrinsèque de facteurs de transcription comme Ikaros et GATA1. Le facteur de transcription Ikaros joue un rôle critique dans le devenir des cellules progénitrices et la différenciation des lignages hématopoïétiques. Cependant, il demeure surtout connu pour son influence sur la voie Notch dans les cellules lymphoïdes, notamment les lymphocytes T. Les cellules érythroïdes sont hautement sensibles à l’environnement et donc, particulièrement adaptées à l’étude des régulations de l’homéostasie. Les résultats de différentes études ont permis de démontrer qu’Ikaros et la voie Notch influencent l’érythropoïèse. Cependant le détail de leurs actions demeure en grande partie inconnu à ce jour. Au cours de notre étude nous avons voulu déterminer l’action d’Ikaros dans le maintien de l’homéostasie des cellules érythroïdes et si son rôle passe par un dialogue avec la voie Notch. Nous avons voulu décrypter les mécanismes de régulation transcriptionnelle utilisés par Ikaros et par Notch au cours de l’érythropoïèse et leurs effets. Notre étude montre qu’Ikaros réprime à l’aide de GATA1 le gène Hes1, une cible importante de la voie Notch, en recrutant un complexe de la famille Polycomb, le PRC2 ii (Polycomb Repressive Complex 2). Cette répression permet la promotion de la différenciation des cellules érythroïdes. Au niveau du maintien de l’homéostasie par régulation de l’apoptose, Ikaros est connu pour cibler l’anti-apoptotique Bcl2l1 dans les lymphocytes. Puisque Gata-1, partenaire préférentiel d’Ikaros cible Bcl2l1 dans les cellules érythroïdes, nous avons caractérisé leur effet sur l’expression de Bcl2l1. Nous avons découvert qu’Ikaros active de façon directe Bcl2l1 et qu’il recrute sur le gène deux complexes partenaires d’élongation : un de la famille SET1/MLL, et le complexe P-TEFb-NuRD. En l’absence d’Ikaros, le fragment intracellulaire de Notch (NICD) et son cofacteur RBP-J remplacent Ikaros et favorisent l’hyper-activation de l’expression de Bcl2l1. Ceci est associé à la modification du complexe d’élongation recruté, ainsi qu’à la mise en place de modifications épigénétiques distinctes de celles observées avec Ikaros ce qui modifie l’élongation transcriptionnelle du gène. Ikaros et Notch sont fréquemment mutés ou présentent des fonctions altérées dans les leucémies. Notre étude montre un dialogue Ikaros/Notch influençant aussi bien la différenciation que l’apoptose et met en évidence l’existence d’un circuit génétique dont le dérèglement pourrait favoriser l’apparition d’une hématopoïèse maligne.

Propidium monoazide (PMA) and ethidium bromide monoazide(EMA) improve DNA array and high-throughput sequencing ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus identification

Pan-viral DNA array (PVDA) and high-throughput sequencing (HTS) are useful tools to identify novel viruses of emerging diseases. However, both techniques have difficulties to identify viruses in clinical samples because of the host genomic nucleic acid content (hg/cont). Both propidium monoazide (PMA) and ethidium bromide monoazide (EMA) have the capacity to bind free DNA/RNA, but are cell membrane-impermeable. Thus, both are unable to bind protected nucleic acid such as viral genomes within intact virions. However, EMA/PMA modified genetic material cannot be amplified by enzymes. In order to assess the potential of EMA/PMA to lower the presence of amplifiable hg/cont in samples and improve virus detection, serum and lung tissue homogenates were spiked with porcine reproductive and respiratory virus (PRRSV) and were processed with EMA/PMA. In addition, PRRSV RT-qPCR positive clinical samples were also tested. EMA/PMA treatments significantly decreased amplifiable hg/cont and significantly increased the number of PVDA positive probes and their signal intensity compared to untreated spiked lung samples. EMA/PMA treatments also increased the sensitivity of HTS by increasing the number of specific PRRSV reads and the PRRSV percentage of coverage. Interestingly, EMA/PMA treatments significantly increased the sensitivity of PVDA and HTS in two out of three clinical tissue samples. Thus, EMA/PMA treatments offer a new approach to lower the amplifiable hg/cont in clinical samples and increase the success of PVDA and HTS to identify viruses.