Nanopatterning and functionalization of phospholipid-based Langmuir-Blodgett and Langmuir-Schaefer films

Durant les dernières décennies, la technique Langmuir-Blodgett (LB) s’est beaucoup développée dans l’approche « bottom-up » pour la création de couches ultra minces nanostructurées. Des patrons constitués de stries parallèles d’environ 100 à 200 nm de largeur ont été générés avec la technique de déposition LB de monocouches mixtes de 1,2-dilauroyl-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine (DLPC) et de 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine (DPPC) sur des substrats de silicium et de mica. Afin d’amplifier la fonctionnalité de ces patrons, la 1-palmitoyl-2-(16-(S-methyldithio)hexadécanoyl)-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine (DSDPPC) et la 1-lauroyl-2-(12-(S-methyldithio)dodédecanoyl)-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine (DSDLPC) ont été employées pour la préparation de monocouches chimiquement hétérogènes. Ces analogues de phospholipide possèdent un groupement fonctionnel méthyldisulfide qui est attaché à la fin de l’une des chaînes alkyles. Une étude exhaustive sur la structure de la phase des monocouches Langmuir, Langmuir-Schaefer (LS) et LB de la DSDPPC et de la DSDLPC et leurs différents mélanges avec la DPPC ou la DLPC est présentée dans cette thèse. Tout d’abord, un contrôle limité de la périodicité et de la taille des motifs des stries parallèles de DPPC/DLPC a été obtenu en variant la composition lipidique, la pression de surface et la vitesse de déposition. Dans un mélange binaire de fraction molaire plus grande de lipide condensé que de lipide étendu, une vitesse de déposition plus lente et une plus basse pression de surface ont généré des stries plus continues et larges. L’addition d’un tensioactif, le cholestérol, au mélange binaire équimolaire de la DPPC/DLPC a permis la formation de stries parallèles à de plus hautes pressions de surface. La caractérisation des propriétés physiques des analogues de phospholipides a été nécessaire. La température de transition de phase de la DSDPPC de 44.5 ± 1.5 °C comparativement à 41.5 ± 0.3 °C pour la DPPC. L’isotherme de la DSDPPC est semblable à celui de la DPPC. La monocouche subit une transition de phase liquide-étendue-à-condensée (LE-C) à une pression de surface légèrement supérieure à celle de la DPPC (6 mN m-1 vs. 4 mN m-1) Tout comme la DLPC, la DSDLPC demeure dans la phase LE jusqu’à la rupture de la monocouche. Ces analogues de phospholipide existent dans un état plus étendu tout au long de la compression de la monocouche et montrent des pressions de surface de rupture plus basses que les phospholipides non-modifiés. La morphologie des domaines de monocouches Langmuir de la DPPC et de la DSDPPC à l’interface eau/air a été comparée par la microscopie à angle de Brewster (BAM). La DPPC forme une monocouche homogène à une pression de surface (π) > 10 mN/m, alors que des domaines en forme de fleurs sont formés dans la monocouche de DSDPPC jusqu’à une π ~ 30 mN m-1. La caractérisation de monocouches sur substrat solide a permis de démontrer que le patron de stries parallèles préalablement obtenu avec la DPPC/DLPC était reproduit en utilisant des mélanges de la DSDPPC/DLPC ou de la DPPC/DSDLPC donnant ainsi lieu à des patrons chimiquement hétérogènes. En général, pour obtenir le même état de phase que la DPPC, la monocouche de DSDPPC doit être comprimée à de plus hautes pressions de surface. Le groupement disulfide de ces analogues de phospholipide a été exploité, afin de (i) former des monocouches auto-assemblées sur l’or et de (ii) démontrer la métallisation sélective des terminaisons fonctionnalisées des stries. La spectrométrie de photoélectrons induits par rayons X (XPS) a confirmé que la monocouche modifiée réagit avec la vapeur d’or pour former des thiolates d’or. L’adsorption de l’Au, de l’Ag et du Cu thermiquement évaporé démontre une adsorption préférentielle de la vapeur de métal sur la phase fonctionnalisée de disulfide seulement à des recouvrements sub-monocouche.

Novel surface-tethered estrogen polymeric platforms in cardiovascular regenerative medicine

L’estradiol (E2) est une hormone femelle qui joue un rôle essentiel, à la fois dans la régulation et dans la détermination de certaines conditions physiologiques in vivo, telle que la différenciation et la prolifération cellulaire. Lorsque l’E2 est donné en supplément, par exemple dans le cas de thérapie hormonale, deux effets sont observés, un effet génomique et un effet non-génomique, de par son interaction avec les récepteurs à œstrogène du noyau ou de la membrane cellulaire, respectivement. L’effet non-génomique est plus difficile à étudier biologiquement parce que l’effet se produit sur une échelle de temps extrêmement courte et à cause de la nature hydrophobe de l’E2 qui réduit sa biodisponibilité et donc son accessibilité aux cellules cibles. C’est pourquoi il est nécessaire de développer des systèmes d’administration de l’E2 qui permettent de n’étudier que l’effet non-génomique de l’œstrogène. Une des stratégies employée consiste à greffer l’E2 à des macromolécules hydrophiles, comme de l’albumine de sérum bovin (BSA) ou des dendrimères de type poly(amido)amine, permettant de maintenir l’interaction de l’E2 avec les récepteurs d’œstrogène de la membrane cellulaire et d’éviter la pénétration de l’E2 dans le noyau des cellules. Toutefois, ces systèmes macromolécules-E2 sont critiquables car ils sont peu stables et l’E2 peut se retrouver sous forme libre, ce qui affecte sa localisation cellulaire. L’objectif de cette thèse est donc de développer de nouvelles plateformes fonctionnalisées avec de l’E2 en utilisant les approches de synthèses ascendantes et descendantes. Le but de ces plateformes est de permettre d’étudier le mécanisme de l’effet non-génomique de l’E2, ainsi que d’explorer des applications potentielles dans le domaine biomédical. L’approche ascendante est basée sur un ligand d’E2 activé, l’acide 17,α-éthinylestradiol-benzoïque, attaché de façon covalente à un polymère de chitosan avec des substitutions de phosphorylcholine (CH-PC-E2). L’estradiol est sous forme de pro-drogue attachée au polymère qui s’auto-assembler pour former un film. L’effet biologique de la composition chimique du film de chitosan-phosphorylcholine a été étudié sur des cellules endothéliales. Les films de compositions chimiques différentes ont préalablement été caractérisés de façon physicochimique. La topographie de la surface, la charge de surface, ainsi que la rhéologie des différents films contenant 15, 25, ou 40% molaires de phosphorylcholine, ont été étudiés par microscopie à force atomique (AFM), potentiel zêta, résonance plasmonique de surface et par microbalance à cristal de quartz avec dissipation (QCM-D). Les résultats de QCM-D ont montré que plus la part molaire en phosphorylcholine est grande moins il y a de fibrinogène qui s’adsorbe sur le film de CH-PC. Des cellules humaines de veine ombilicale (HUVECs) cultivées sur des films de CH-PC25 et de CH-PC40 forment des amas cellulaire appelés sphéroïdes au bout de 4 jours, alors que ce n’est pas le cas lorsque ces cellules sont cultivées sur des films de CH-PC15. L’attachement de l’estradiol au polymère a été caractérisé par plusieurs techniques, telles que la résonance magnétique nucléaire de proton (1H NMR), la spectroscopie infrarouge avec transformée de Fourier à réfraction totale atténuée (FTIR-ATR) et la spectroscopie UV-visible. La nature hydrogel des films (sa capacité à retenir l’eau) ainsi que l’interaction des films avec des récepteurs à E2, ont été étudiés par la QCM-D. Des études d’imagerie cellulaires utilisant du diacétate de diaminofluoresceine-FM ont révélé que les films hydrogels de CH-PC-E2 stimulent la production d’oxyde nitrique par les cellules endothéliales, qui joue un rôle protecteur pour le système cardiovasculaire. L’ensemble de ces études met en valeur les rôles différents et les applications potentielles qu’ont les films de type CH-PC-E2 et CH-PC dans le cadre de la médecine cardiovasculaire régénérative. L’approche descendante est basée sur l’attachement de façon covalente d’E2 sur des ilots d’or de 2 μm disposés en rangées et espacés par 12 μm sur un substrat en verre. Les ilots ont été préparés par photolithographie. La surface du verre a quant à elle été modifiée à l’aide d’un tripeptide cyclique, le cRGD, favorisant l’adhésion cellulaire. L’attachement d’E2 sur les surfaces d’or a été suivi et confirmé par les techniques de SPR et de QCM-D. Des études d’ELISA ont montré une augmentation significative du niveau de phosphorylation de la kinase ERK (marqueur important de l’effet non-génomique) après 1 heure d’exposition des cellules endothéliales aux motifs alternant l’E2 et le cRGD. Par contre lorsque des cellules cancéreuses sont déposées sur les surfaces présentant des motifs d’E2, ces cellules ne croissent pas, ce qui suggère que l’E2 n’exerce pas d’effet génomique. Les résultats de l’approche descendante montrent le potentiel des surfaces présentant des motifs d’E2 pour l’étude des effets non-génomiques de l’E2 dans un modèle in vitro.