Caractérisation du produit du gène sty4221, unique à Salmonella enterica sérovar Typhi

Salmonella enterica sérovar Typhi (Typhi) est une bactérie pathogène spécifique à l’homme. Typhi est l’agent étiologique de la fièvre typhoïde chez l’humain, causant plus de 16 millions de nouveaux cas par année et plus de 600 000 morts. Il a été démontré que pour causer une infection systémique, Salmonella doit nécessairement survivre dans les macrophages de l'hôte. Paradoxalement, S. enterica sérovar Typhimurium, très apparenté à Typhi (près de 90 % d’homologie), n’a pas la capacité de se disséminer dans l’organisme humain et peut infecter plusieurs espèces animales. Nous avons antérieurement identifié 36 gènes uniques à Typhi (absents chez Typhimurium) situés sur 15 régions différentes et exprimés sélectivement lors de l’infection de macrophages humains. Ainsi, l’une de ces régions a suscité notre attention, soit la région sty4217-4222 et plus particulièrement le produit du gène sty4221, une aminotransférase hypothétique. Ce dernier gène est d’intérêt dû à l’homologie qu’il détient avec une hémolysine connue (Hly) produite par Treponema denticola, possédant elle-même une activité d’aminotransférase. Chez T. denticola, Hly dégrade la cystéine et produit du H2S qui est toxique pour l’hôte. Notre hypothèse est que la spécificité d’hôte et la capacité de produire une infection systémique de Typhi sont dues à l’expression de gènes qui ne se retrouvent pas chez d’autres salmonelles. Le but de cette étude était donc de caractériser le gène sty4221 quant à son activité hémolytique, cytotoxique et tenter de déterminer son rôle dans la virulence de cette bactérie. Le gène sty4221 a été cloné sous le contrôle d’un promoteur inductible à l’arabinose et exprimé par E. coli. L’activité hémolytique du clone a été déterminée par simple observation sur gélose sang. Ce clone a également permis d’observer l’effet cytotoxique du surnageant de culture sur différentes lignées cellulaires, par quantification de la relâche de LDH. Le gène sty4221 a été muté chez la souche sauvage de Typhi, ISP1820, l’implication pathogénique du gène a ainsi pu être étudiée. Des tests de phagocytose, d’invasion et de survie dans des macrophages humains ont été effectués, ainsi que des tests d’adhésion et d’invasion sur des cellules HeLa. Par ailleurs, une première tentative de purification de la protéine a été entreprise. En somme, nous savons maintenant que STY4221 a des propriétés hémolytiques, augmentées par la présence de cystéine. De plus, STY4221 a un effet cytotoxique sur les macrophages THP-I, mais aucun effet sur les HeLa. Or, sty4221 ne semble pas impliqué dans les étapes d’adhésion, d’invasion, de phagocytose ou de survie. La caractérisation de sty4221 permettra sans doute d’approfondir nos connaissances sur les toxines trouvées uniquement chez Typhi.

Étude des interactions protéiques impliquant NPM-MLF1 dans la leucémie myéloïde aiguë.

Différentes translocations génomiques sont fréquemment associées à l'apparition de leucémies myéloïdes aiguës (LMA). Ces translocations génomiques résultent de l’assemblage de deux gènes conduisant à la production d'une protéine de fusion. C'est le cas de la translocation t (3; 5) (q25.1; q34) impliquant le suppresseur tumoral NPM et l'oncogène MLF1 donnant naissance à la protéine de fusion NPM-MLF1. Généralement, les gènes impliqués dans ces translocations contrôlent la croissance cellulaire, la différenciation ou la survie cellulaire. Cependant, pour NPM-MLF1 les causes du gain ou de la perte de fonction associée à la translocation demeurent inconnues car nous ne savons pas comment cette translocation peut favoriser ou participer à l'avènement de la LMA. Le but de ce travail est d’analyser le rôle de NPM-MLF1 dans le cancer et d’examiner comment son activité contribue à la leucémie en faisant des études d’interactions protéine/protéine. En effet, l’étude de la fonction d’une protéine implique souvent de connaître ses partenaires d’interactions. Pour ce faire, la technique de double hybride dans la souche de levure AH109 a été utilisée. Tout d’abord, les ADN complémentaires (ADNc) de MLF1, NPM1 et de NPM-MLF1, MLF1-Like (une partie de MLF1 de l’acide aminé 94 à 157) normaux et mutés du domaine MTG8-Like constitué des acides aminés (a.a.) 151 à 164 de MLF1 (excepté NPM) ont été clonés dans un vecteur d'expression de levure pGBKT7. Les ADNc de GFI-1, mSin3A, PLZF, HDAC1 et HDAC3 ont été clonés dans le plasmide pGADT7 de façon à créer des protéines de fusion synthétiques avec le domaine de liaison à l'ADN et de trans-activation de la protéine GAL4. Le plasmide pGBKT7 possède un gène TRP1 et pGADT7 un gène LEU2 qui permettent la sélection des clones insérés dans la levure. Aussi, le pGBKT7 a un épitope c-myc et pGADT7 un épitope HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage de type Western. Après la transformation des levures les interactions protéine/protéine ont été observées en vérifiant l’expression des gènes rapporteurs HIS3, LacZ, MEL1, ADE2 de la levure en utilisant des milieux de sélection YPD/-Leu/-Trp, YPD/-Leu/-Trp/-His, YPD/-Leu/-Trp/-His/-Ade, YPD/-Leu/-Trp/+ X-Gal, YPD/-Leu/-Trp/ + X-α-Gal. Ensuite, les interactions trouvées par double-hybride ont été vérifiées dans les cellules érythroleucémiques K562 par immuno-précipitation (IP) de protéines suivies de buvardages Westerns avec les anticorps appropriés. NPM-MLF1, MLF1, MTG8, MLF1-Like surexprimés dans les cellules K562 ont été clonés dans le plasmide pOZ-FH-N. pOZ-FH-N possède un récepteur IL-2 qui permet de sélectionner les cellules qui l’expriment ainsi qu’un tag Flag-HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage-Western. Les résultats du double-hybride suggèrent une interaction faible de NPM-MLF1 avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A ainsi qu’une interaction qui semble plus évidente entre NPM-MLF1 et PLZF, GFI-1. NPM interagit avec GFI-1 et mSin3A. Aussi, MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3, GFI-1, PLZF mais pas avec mSin3A. Les IP suggèrent que NPM-MLF1 interagit avec HDAC1, HDAC3, mSin3A et PLZF. MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A. L’interaction de NPM-MLF1 avec GFI-1, MLF1 et MLF1-Like avec PLZF et GFI-1 n’a pas encore été vérifiée par IP. Ainsi, nos observations permettent de suggérer que NPM-MF1, MLF1 et NPM pourraient jouer un rôle dans la transcription et la régulation de l’expression de certains gènes importants dans l’hématopoïèse et une variété de processus cellulaires parce qu’ils interagissent avec différents corépresseurs. En déterminant les partenaires protéiques de MLF1, NPM et NPM-MLF1, leurs fonctions et comment NPM-MLF1 influence et modifie le fonctionnement cellulaire normal; il sera possible de renverser le processus de LMA favorisé par la t (3; 5) NPM-MLF1 par la technologie d’interférence à l’ARN.

Plasticité présynaptique et gliale à long-terme en réponse à un changement chronique de l’activité synaptique,à la jonction neuromusculaire d’amphibien

La plasticité synaptique est une importante propriété du système nerveux, impliquée dans l’intégration de l’information. Cette plasticité a généralement été décrite par des changements aux niveaux pré et postsynaptiques. Notamment, l’efficacité présynaptique, soit la probabilité de libération de neurotransmetteurs associée au contenu quantique d’une synapse, peut être augmentée ou diminuée selon l’activité antérieure de la synapse. Malgré cette caractérisation, les mécanismes à l’origine de la détermination de l’efficacité présynaptique demeurent obscurs. Également, la plasticité synaptique reste encore mal définie au niveau glial, limitant, de ce fait, notre compréhension de l’intégration de l’information. Pourtant, la dernière décennie a mené à une redéfinition du rôle des cellules gliales. Autrefois reléguées à un rôle de support passif aux neurones, elles sont désormais reconnues comme étant impliquées dans la régulation de la neurotransmission. Notamment, à la jonction neuromusculaire (JNM), les cellules de Schwann périsynaptiques (CSPs) sont reconnues pour moduler l’efficacité présynaptique et les phénomènes de plasticité. Un tel rôle actif dans la modulation de la neurotransmission implique cependant que les CSPs soient en mesure de s’adapter aux besoins changeants des JNMs auxquelles elles sont associées. La plasticité synaptique devrait donc sous-tendre une forme de plasticité gliale. Nous savons, en effet, que la JNM est capable de modifications tant morphologiques que physiologiques en réponse à des altérations de l'activité synaptique. Par exemple, la stimulation chronique des terminaisons nerveuses entraîne une diminution persistante de l’efficacité présynaptique et une augmentation de la résistance à la dépression. À l’opposé, le blocage chronique des récepteurs nicotiniques entraîne une augmentation prolongée de l’efficacité présynaptique. Aussi, compte tenu que les CSPs détectent et répondent à la neurotransmission et qu’elles réagissent à certains stimuli environnementaux par des changements morphologiques, physiologiques et d’expression génique, nous proposons que le changement d'efficacité présynaptique imposé à la synapse, soit par une stimulation nerveuse chronique ou par blocage chronique des récepteurs nicotiniques, résulte en une adaptation des propriétés des CSPs. Cette thèse propose donc d’étudier, en parallèle, la plasticité présynaptique et gliale à long-terme, en réponse à un changement chronique de l’activité synaptique, à la JNM d’amphibien. Nos résultats démontrent les adaptations présynaptiques de l’efficacité présynaptique, des phénomènes de plasticité à court-terme, du contenu mitochondrial et de la signalisation calcique. De même, ils révèlent différentes adaptations gliales, notamment au niveau de la sensibilité des CSPs aux neurotransmetteurs et des propriétés de leur réponse calcique. Les adaptations présynaptiques et gliales sont discutées, en parallèle, en termes de mécanismes et de fonctions possibles dans la régulation de la neurotransmission. Nos travaux confirment donc la coïncidence de la plasticité présynaptique et gliale et, en ce sens, soulèvent l’importance des adaptations gliales pour le maintien de la fonction synaptique.

Désignation et récusation des arbitres: problèmes et perspectives

L'arbitrage a joué un rôle majeur dans l'élaboration d'un droit international ou «transnational», surtout par l'effort fourni au sein des institutions arbitrales qui se trouvent de nos jours partout dans le monde, et les conventions arbitrales qui jouent un rôle extraordinaire dans le domaine de la codification des principes et des dispositions internationales. Celles-ci visent entre autres à résoudre les problèmes liés aux désignations et récusations des arbitres. Il résulte que plusieurs ordres normatifs ont créé des règles pour régir les questions de nomination et de récusation des arbitres. Elles ont une importance proportionnelle qui dépend de l'organisme qui les établit, de sa réputation et de sa crédibilité parmi les commerçants. Nous pouvons trouver des règles sur des questions de nomination et de récusation des arbitres dans les lois étatiques, les conventions internationales, les lois types, et dans les règlements d'arbitrage. L'analyse de ces divers ordres normatifs qui ont disposé des règles pour résoudre les problèmes de désignation et de récusation des arbitres nous permet d'évaluer leur efficacité pour rendre des solutions appropriées aux problèmes rencontrés lors de la constitution du tribunal arbitral. Par ailleurs, nous savons que la finalité espérée de la sentence arbitrale est la possibilité d'être exécutoire, et que cette étape de la procédure est régie par la convention des Nations Unies de 1958, dite « convention de New York de 1958 » pour la reconnaissance et l'exécution des sentences arbitrales. Cette convention établit les conditions qu'on doit respecter - entre autres - lors de la constitution du tribunal arbitral pour qu'une sentence arbitrale puisse obtenir une force exécutoire, d'où nous observons que l'influence de l'irrégularité de la désignation des arbitres peut être très pénible, car, par l'application de l'article V de la convention de New York, la sentence peut être refusée par le juge étatique. En fait, quand les parties contractantes dans des contrats internationaux favorisent le choix de l'institution arbitrale pour régler les différends qui pourraient naître entre eux, cela veut dire que ces parties ont confiance envers cette institution de justice. Mais les problèmes rencontrés lors de la constitution du tribunal arbitral peuvent perturber la confiance de ces parties en cette institution de justice, d'où il sera nécessaire de trouver des solutions efficaces pour rendre l'étape de la constitution du tribunal sécuritaire pour pouvoir solliciter le recours à cette méthode de règlement de différends sans éprouver de crainte sur l'efficacité de la procédure de désignation, de récusation et de remplacement des arbitres. En somme, il est primordial d'assurer la nature privée et contractuelle du contrat d'arbitrage, et d'éviter les risques d'insécurité et d'imprévisibilité qui nuisent au bon développement des relations contractuelles internationales.

L’influence du développement durable à travers la formation universitaire en design industriel

Aujourd’hui, nous savons qu’environ 75 à 80% des impacts environnementaux des produits sont déterminés lors de la conception. Le rôle du designer industriel est donc crucial pour arriver à une forme de développement plus viable. Cette recherche tente de cibler les champs de connaissances qui devraient faire partie de la formation des professionnels du développement de produits pour y intégrer les aspects environnementaux. Après une recension de la littérature en design industriel, en pédagogie et en environnement, l’étude de terrain a été conduite en deux temps. Selon des critères prédéfinis, des programmes universitaires « spécialisés » en environnement/développement durable, au Québec, ainsi que des formations en éco-conception, offerts en France, ont été analysés. L’étude de terrain a été complétée par un entretien en profondeur semi-dirigé avec un consultant, qui aide des entreprises québécoises à intégrer l’environnement en développement de produits. L’analyse des informations recueillies met en évidence la nécessité de transformer rapidement les formations universitaires en conception de produits. Le nouveau cursus de design industriel devrait; 1. Intégrer les connaissances relatives aux impacts environnementaux; 2. Encourager le travail en équipes multidisciplinaires pour enrichir la collecte d’informations relative aux projets de développement; 3. Établir une collaboration étroite entre les établissements d’enseignement et les industries, ce qui est essentiel à la compréhension des enjeux de développement de produits et services (culture de l’entreprise, coût, délais, logistique, réglementation, etc.).

Dimensions des représentations du concept de Temps dans treize classes du préscolaire et du premier cycle du primaire au Québec

Depuis la rentrée scolaire de septembre 2002, les écoles primaires québécoises doivent composer avec une nouvelle organisation des programmes ainsi qu’avec de nouveaux contenus. Au premier cycle, en univers social, la compétence visée est « Construire sa représentation de l’espace, du temps et de la société » (MEQ, 2001). Or, nous savons que, pour bâtir un enseignement qui a pour but de guider un individu dans la construction de sa représentation, il est nécessaire d’avoir conscience de ses représentations initiales de l’objet. Mais, quelles sont les représentations du temps des élèves de maternelle et de premier cycle du primaire au Québec? C’est la question que nous nous posons dans cette thèse. Pour y répondre, nous avons cherché à circonscrire le temps dont il est question en proposant une réflexion théorique sur son essence et en analysant les sens qu’il prend dans le programme. Puis, nous avons mis en place une méthodologie et les outils lui étant nécessaires pour dégager les dimensions de représentations présentes dans les discours de 164 sujets de maternelle, de première et de deuxième année, répartis sur 13 classes d’écoles de la grande région montréalaise. À l’issue de cette recherche, nous pouvons proposer aux chercheurs et aux enseignants une nouvelle liste de dimensions de représentations du temps adaptée au contexte québécois actuel. Cette liste nous permet de dépeindre le paysage des représentations du temps des élèves des classes que nous avons visitées. Enfin, riche de nos résultats, nous pouvons émettre quelques remarques et principes pour l’enseignement du temps en classe.

Le site CjEd-8 : l'Archaïque supérieur au Témiscouata

Occupé depuis près de 10 000 ans, le Témiscouata est un lieu clé pour mieux comprendre la préhistoire du Québec, en raison de son emplacement stratégique entre l’Atlantique et la vallée du Saint-Laurent et de la cinquantaine de sites archéologiques connus dans la région. Le site CjEd-8 est le seul site associé à l’Archaïque supérieur (6 000 à 4 000 ans avant aujourd’hui) connu dans la région. Cette recherche palethnographique porte sur l’analyse de la collection lithique du site archéologique CjEd-8. Nos questions de recherche sont les suivantes : quel était le mode de vie et les activités des occupants du site CjEd-8? Quel était leur environnement et comment s’y sont-ils adapté? Comment l’espace était-il utilisé sur le site? Comment ce site se compare-t-il aux autres sites de l’Archaïque supérieur au Québec et dans le nord-est américain? Est-il possible de relier l’occupation du site CjEd-8 à un plus vaste cadre régional ou culturel, comme un réseau d’interaction, par exemple? Nous avons effectué une analyse techno-morphologique individuelle de tous les outils et du débitage de la collection. Nous avons pu constater que tous les stades de réduction lithique (initial, intermédiaire et final) sont présents sur le site CjEd-8. Les matières premières locales sont représentées dans tous ces stades de réduction, bien que les matières premières exotiques soient surtout présentes au sein du stade initial de réduction, davantage que les matières premières locales. Ceci laisse croire que le dégrossissement initial des blocs et galets de matière première locale se faisait ailleurs que sur le site, fort probablement sur les carrières de chert de la région, et que des matières exotiques ont aussi été travaillées sur le site. Des activités de taille ont eu lieu sur les deux zones du site, probablement autour de deux foyers distincts. Les quelques individus présents y sont demeurés très brièvement, semblent avoir effectué un nombre limité d’activités et sont peut-être repassés quelques temps après. L’Archaïque supérieur est caractérisé par une augmentation de la population et par l’intensification des interactions et de l’appartenance régionale. Or, il semblerait que ce soit l’inverse que l’on observe archéologiquement au Témiscouata. L’assemblage de CjEd-8 ne présente aucune ressemblance particulière avec les sites associés à l’Archaïque supérieur au Québec, bien que pour presque tous ces sites, on constate une exploitation importante des matières premières locales (même si ces dernières sont de qualité moyenne), combinée à l’exploitation de matières premières exotiques de sources très éloignées. L’industrie du quartz, importante dans la plupart des sites de l’Archaïque supérieur, se reflète très peu sur CjEd-8. Bien qu’il nous soit impossible d’associer l’occupation du site CjEd-8 à une tradition culturelle précise, cela ne signifie pas que ses occupants n’étaient pas en interaction avec l’une ou l’autre des entités culturelles de la fin de l’Archaïque, que ce soit avec les groupes de la région de Quoddy, de la Gaspésie, de la Vallée du Saint-Laurent, de l’Outaouais, de la Haute Côte nord, du Vermont, de l’État de New York et de l’intérieur du Maine. La question des modes de subsistance des occupants de CjEd-8 n’a pas été soulevée lors de nos analyses. Nous savons toutefois que les occupants du Témiscouata avaient alors accès à une faune riche et diversifiée.

L’œstrogène : un rôle potentiel dans la modulation de l’activation pro-inflammatoire des cellules endothéliales vasculaires par la voie du Toll-Like Receptor 2

Grâce aux nombreuses études sur le sujet, nous savons qu’une stimulation inflammatoire vasculaire excessive entraîne un débalancement des fonctions homéostatiques de l’endothélium. Ce débalancement est à l’origine d’une dysfonction endothéliale définie comme étant l’étape clé contribuant au développement de l’athérosclérose. Le Toll-like receptor-2 (TLR2) est impliqué dans l’activation cellulaire via la transcription des gènes liés à l’inflammation. Il reconnaît des molécules microbiennes mais également des facteurs endogènes non-infectieux tels que sécrétés par les tissus endommagés provenant de la dysfonction endothéliale. Ainsi, l’activation et la signalisation du TLR2 sont en étroite relation avec le développement de l’athérosclérose. Les études épidémiologiques ont confirmé le rôle athéroprotecteur de l’œstrogène via de nombreux mécanismes d’action. Ainsi, nous avons cherché à identifier de nouvelles cibles moléculaires permettant de mieux interpréter les bénéfices potentiels de l’œstrogène sur le système cardiaque. Pour la première fois chez les cellules endothéliales (CE) vasculaires de souris, nos travaux ont confirmé l’effet anti-inflammatoire de l’œstrogène via la diminution de l’expression et de l’activité du TLR2. Nous avons également déterminé l’influence de l’œstrogène sur le profil de la réponse inflammatoire de ce récepteur en mesurant les potentiels endothéliaux de migration et d’adhésion. De plus, nous avons caractérisé les voies de signalisation impliquées en démontrant l’influence négative de l’œstrogène sur la phosphorylation des kinases activées par le TLR2; illustrant l’interaction entre l’œstrogène et la signalisation de ce récepteur. Nos travaux amènent ainsi de nouvelles connaissances sur la régulation endothéliale du TLR2 et mettent en lumière les effets anti-inflammatoires et vasculaires rapides de l’œstrogène.

Rôle de l'axe CD40/CD40L dans la régulation de la fonction paquettaire

Le CD40 ligand (CD40L) est une molécule inflammatoire appartenant à la famille du Facteur de Nécrose Tumorale ("Tumor Necrosis Factor", TNF), originalement identifié au niveau des cellules immunitaires. L’interaction du CD40L avec son récepteur de haute affinité présent sur les cellules B, le CD40, est d’une importance cruciale à la production d’immunoglobulines lors de la réponse immunitaire. Aujourd’hui, nous savons que ces deux molécules qui constituent l’axe CD40/CD40L sont aussi exprimées au niveau des cellules du système vasculaire et occupent une place importante dans une variété de réactions inflammatoires, de sorte que le CD40L est présentement reconnu comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des évènements cardiovasculaires. Les plaquettes sont la principale source du CD40L soluble ("soluble CD40L", sCD40L) plasmatique et il fut démontré être impliqué dans l’activation plaquettaire, malgré que son impact exact sur la fonction plaquettaire et les mécanismes sous-jacents demeurent inconnus. Ainsi, le but de ce projet était de déterminer l’impact du sCD40L sur la fonction plaquettaire et d’élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. Les objectifs spécifiques étaient : 1) d’évaluer l’impact du sCD40L sur l’activation et l’agrégation plaquettaire in vitro; 2) de déterminer le récepteur cible (CD40 ou autre) impliqué dans ces effets; 3) de décortiquer les voies signalétiques intracellulaires et moléculaires induites par le sCD40L, impliquant la participation potentielle de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor", TRAF) et 4) d’analyser l’effet du sCD40L sur la formation du thrombus in vivo. Le sCD40L augmente fortement l’activation et l’agrégation plaquettaire induite par de faibles doses d’agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n’interagit pas avec le CD40 et les plaquettes de souris CD40 déficientes (CD40-/-) ne furent pas en mesure d’induire ces effets. De plus, nous démontrons la présence de plusieurs membres de la famille des TRAFs dans les plaquettes, parmi lesquels seulement TRAF-2 interagit avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Le sCD40L agit sur les plaquettes au repos par l’entremise de la protéine Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase activatrice du mitogène p38 ("Mitogen Activating Protein Kinase", MAPK). Ceci mène ultimement au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l’actine. Par ailleurs, il est intéressant de noter que les souris CD40-/- démontrent un défaut significatif de l’agrégation plaquettaire en réponse au collagène, ce qui souligne l’importance du CD40 dans les interactions plaquettes-plaquettes. Dans un deuxième temps, le sCD40L amplifie l’agrégation plaquettaire en sang complet, accélère les temps de thrombose in vitro mesurés à l’aide du système PFA-100 et augmente l’adhésion plaquettaire au collagène sous condition de flux, le tout par l’entremise du CD40. Finalement, dans un modèle de thrombose artérielle murin, l’infusion du sCD40L exacerbe la formation du thrombus chez les souris du type sauvage ("Wild Type", WT), mais non chez les souris CD40-/-. Ceci fut en plus associé à une augmentation significative du nombre de leucocytes au sein du thrombus des souris WT traitées à l’aide du sCD40L, tel que démontré par marquage immuno-histologique anti-CD45 et par quantification des coupes artérielles par microscopie optique. En résumé, ce projet identifie une nouvelle voie signalétique, TRAF-2/Rac1/p38 MAPK, en réponse au sCD40L et démontre ses effets sur l’activation et l’agrégation plaquettaire. De manière encore plus importante, nous démontrons pour la première fois la présence d’une corrélation positive entre les niveaux circulants du sCD40L et la thrombose artérielle, tout en soulignant l’importance du CD40 dans ce processus. Ainsi, le sCD40L constitue un activateur important des plaquettes, les prédisposant à une thrombose exacerbée en réponse au dommage vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer le lien étroit qui existe entre les niveaux circulants du sCD40L et l’incidence des maladies cardiovasculaires.

GREBP, un nouveau facteur de transcription contrôlant l’expression de la guanylate cyclase A, récepteur de l’ANP, via l’élément de réponse au cGMP

La découverte du système des peptides natriurétiques (NP), au début des années 80, fut une découverte majeure qui révéla le rôle endocrinien du cœur. Les connaissances sur la relaxation vasculaire, la diurèse et la natriurèse provoquées par ce système ont évolué vers un niveau de complexité insoupçonné à cette époque. Nous savons à présent que les NP sont impliqués dans plusieurs autres mécanismes dont la prolifération cellulaire, l’apoptose, l’inhibition du système rénine-angiotensine-aldostérone (RAAS) et le métabolisme des adipocytes. Le métabolisme des lipides est maintenant devenu une cible de choix dans la lutte contre l’obésité. Cette condition aux proportions pandémiques est un facteur de risque majeur dans l’apparition de l’hypertension et du syndrome métabolique (MetS). La compréhension des mécanismes et des défauts de la voie des NP pourrait avoir un impact positif sur le contrôle du MetS et de l’hypertension. L’expression du récepteur des peptides natriuretiques de type 1 (NPR1/GCA) est contrôlée par plusieurs agents incluant son propre ligand, le peptide natriurétique de l’oreillette (ANP). La découverte d’une boucle de retro-inhibition, dans les années 90, a été un événement majeur dans le domaine des NP. En effet, suite à une stimulation à l’ANP, le NPR1/GCA peut inhiber l’activité transcriptionnelle de son propre gène par un mécanisme dépendant du cGMP. Notre groupe a identifié un élément cis-régulateur responsable de cette sensibilité au cGMP et mon projet consistait à identifier la ou les protéine(s) liant cet élément de réponse au cGMP (cGMP-RE). Nous avons identifié un clone liant le cGMP-RE en utilisant la technique du simple hybride chez la levure et une banque d’ADN complémentaire (ADNc) de rein humain. Ce clone provient d’un ADNc de 1083-bp dont le gène est localisé sur le chromosome 1 humain (1p33.36) et codant pour une protéine dont la fonction était inconnue jusqu’ici. Nous avons nommé cette nouvelle protéine GREBP en raison de sa fonction de cGMP Response Element Binding Protein. Des essais de liaison à l’ADN ont montré que cette protéine possède une affinité 18 fois plus élevée pour le cGMP-RE que le contrôle, tandis que des expériences de retard sur gel (EMSA) ont confirmé la spécificité des interactions protéine-ADN. De plus, l’immuno-précipitation de la chromatine (ChIP) a prouvé que GREBP lie le cGMP-RE dans des conditions physiologiques. La liaison de GREBP au cGMP-RE inhibe l’expression du gène rapporteur luciférase sous contrôle du promoteur de npr1/gca. L’inhibition de GREBP à l’aide d’ARN interférant active le promoteur de npr1/gca. Dans les cellules NCI-H295R, l’ANP stimule l’expression de grebp de 60% après seulement 3 heures et inhibe l’expression de npr1/gca de 30%. GREBP est une protéine nucléaire surtout exprimée dans le cœur et ayant le facteur eIF3F comme partenaire. Les variations nucléotidiques du gène sont plus fréquentes chez les patients hypertendus que chez des patients normotendus ou hypertendus souffrant de MetS. Nous rapportons ici l’existence d’un gène spécifique à l’humain qui agit comme répresseur transcriptionnel de npr1/gca et potentiellement impliqué dans le développement de l’hypertension.

Génomique fonctionnelle des cellules corticotropes hypophysaires : contrôle génétique de la gestion systémique des stress

L'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) permet de maintenir l'homéostasie de l'organisme face à divers stress. Qu'ils soient de nature psychologique, physique ou inflammatoire/infectieux, les stress provoquent la synthèse et la libération de CRH par l'hypothalamus. Les cellules corticotropes hypophysaires perçoivent ce signal et en réaction, produisent et sécrètent l'ACTH. Ceci induit la synthèse des glucocorticoïdes (Gc) par le cortex surrénalien; ces stéroïdes mettent le système métabolique en état d’alerte pour la réponse au stress et à l’agression. Les Gc ont le rôle essentiel de contrôler les défenses de l'organisme, en plus d'exercer une rétro-inhibition sur l'axe HPA. L'ACTH est une petite hormone peptidique produite par le clivage d'un précurseur: la pro-opiomélanocortine (POMC). À cause de sa position critique dans la normalisation de l'homéostasie, le contrôle transcriptionnel du gène Pomc a fait l'objet d'études approfondies au cours des dernières décennies. Nous savons maintenant que la région promotrice du gène Pomc permet une expression ciblée dans les cellules POMC hypophysaires. L'étude du locus Pomc par des technologies génomiques m'a permis de découvrir un nouvel élément de régulation qui est conservé à travers l'évolution des mammifères. La caractérisation de cet enhancer a démontré qu'il dirige une expression restreinte à l'hypophyse, et plus particulièrement dans les cellules corticotropes. De façon intéressante, l'activité de cet élément dépend d'un nouveau site de liaison recrutant un homodimère du facteur de transcription Tpit, dont l'expression est également limitée aux cellules POMC de l'hypophyse. La découverte de cet enhancer ajoute une toute nouvelle dimension à la régulation de l'expression de POMC. Les cytokines pro-inflammatoires IL6/LIF et les Gc sont connus pour leur antagonisme sur la réaction inflammatoire et sur le promoteur Pomc via l'action des facteurs de transcription Stat3 et GR respectivement. L'analyse génomique des sites liés ii par ces deux facteurs nous a révélé une interrelation complexe et a permis de définir un code transcriptionnel entre ces voies de signalisation. En plus de leur action par interaction directe avec l’ADN au niveau des séquences régulatrices, ces facteurs interagissent directement entre eux avec des résultats transcriptionnels différents. Ainsi, le recrutement de GR par contact protéine:protéine (tethering) sur Stat3 étant lié à l'ADN provoque un antagonisme transcriptionnel. Inversement, le tethering de Stat3 sur GR supporte une action synergique, tout comme leur co-recrutement à l'ADN sur des sites contigus ou composites. Lors d'une activation soutenue, ce synergisme entre les voies IL6/LIF et Gc induit une réponse innée de défense cellulaire. Ainsi lors d'un stress majeur, ce mécanisme de défense est mis en branle dans toutes les cellules et tissus. En somme, les travaux présentés dans cette thèse définissent les mécanismes transcriptionnels engagés dans le combat de l'organisme contre les stress. Plus particulièrement, ces mécanismes ont été décrits au niveau de la réponse globale des corticotropes et du gène Pomc. Il est essentiel pour l'organisme d'induire adéquatement ces mécanismes afin de faire face aux stress et d'éviter des dérèglements comme les maladies inflammatoires et métaboliques.

Dissecting cell cycle protein complexes using the pptimized yeast cytosine deaminase protein-fragment complementation assay “You too can play with an edge”

Les protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices.

Spéciation chimique des nanoparticules d'argent dans les sols

À cause de leurs propriétés antibactériennes, les nanoparticules d’argent sont couramment utilisées dans un grand nombre de produits tels les tissus, les savons et les produits médicaux. Dans cette industrie en pleine croissance, ces nanoparticules sont produites en grandes quantités et s’accumuleront éventuellement dans l’environnement. Pour comprendre le destin, le transport et la biodisponibilité des nanomatériaux, il est essentiel de comprendre leurs propriétés physicochimiques. Entre autres, il est particulièrement important de quantifier la dissolution des nanoparticules à l’aide de mesures de spéciation chimique. En effet, l’objectif de cette recherche est de déterminer la spéciation chimique des nanoparticules d’argent dans différents sols. Pour y parvenir, différentes concentrations de nanoparticules d’argent ont été incorporées dans un sol et après un certain laps de temps, la forme ionique a été mesurée à l’aide d’une électrode sélective d’argent tandis que l’argent total est mesuré par absorption atomique ou par ICP-MS. L’analyse de la spéciation dans trois sols différents révèle que les caractéristiques des sols influencent grandement la spéciation chimique, plus particulièrement la quantité de matière organique ainsi que le pH du sol. Ainsi, la tendance des résultats semble indiquer que plus un sol est acide, il y aura plus d’ions argent libres tandis que la matière organique adsorbe fortement les ions argent les rendant ainsi moins disponibles en solution. L’observation de la spéciation chimique à long terme indique aussi que les nanoparticules tendent à éventuellement se dissocier et ainsi émettre un plus grand nombre d’ions dans l’environnement. Ces résultats ont des implications importantes dans la détermination des risques environnementaux des nanoparticules métalliques.

Innovations pédagogiques et culture disciplinaire en enseignement supérieur

Cette recherche qualitative porte sur les innovations pédagogiques utilisées à l’Université de Montréal en contexte de cultures disciplinaires. La recherche visait à étudier les innovations pédagogiques, entendues comme tout enseignement dispensé de manières différentes de la pratique traditionnelle du cours magistral, proposées par les professeurs dans une université fortement engagée en recherche. ll nous a paru utile de contribuer à compléter les savoirs existants dans ce domaine peu exploré, particulièrement lorsque nous savons que les innovations pédagogiques en contexte de cultures disciplinaires n’ont encore pas été étudiées à l’Université de Montréal. D’un point de vue social, la pertinence de cette recherche réside dans le cadre de la valorisation de l’enseignement universitaire souhaitée tant par les politiques, les institutions et la société que les professeurs et, au-delà, elle invite au rééquilibrage des deux piliers indispensables à l’université centrée sur la recherche qui laisse paraître une relation dichotomique marquée entre enseignement et recherche. Deux modes de cueillettes de données ont été privilégiés : les entrevues individuelles semi-structurées et un entretien de groupe auprès de trente-deux professeurs lauréats du Prix d’excellence en enseignement de l’Université de Montréal. Pour cette recherche, nous avons employé la théorisation ancrée comme méthode d’analyse de données recueillies selon d’autres approches. En d’autres mots, nous avons souhaité utiliser la théorisation ancrée comme un « processus » (Paillé, 1994, p. 149) d’analyse des données avec pour objectif d’approfondir l’objet de notre recherche par-delà la simple analyse descriptive sans pour autant prétendre à une théorisation avancée. En premier lieu, nos résultats nous ont permis de connaître les innovations pédagogiques utilisées dans l’enceinte de notre terrain de recherche, l’Université de Montréal et de dresser un portrait actualisé de leurs innovateurs. Nous avons aussi exploré les raisons qui amènent les professeurs à innover, décrit le processus nécessaire à l’innovation pédagogique et expliqué les freins s’opposant à cette dernière. En second lieu, nos résultats énumèrent les différences liées à la matière d’enseignement, au champ de recherche et soulignent le rapport de la discipline à l’innovation comme critère déterminant à son implication. En dernier lieu, nos résultats révèlent l’existence d’une expertise pédagogique partagée au sein de l’Université de Montréal qui permet de rompre la solitude des professeurs par un soutien entre pairs et favorise la transférabilité des innovations pédagogiques d’une culture disciplinaire à une autre. Finalement, nous présentons une théorisation actualisée des paramètres constituant une innovation pédagogique et détaillons les nouveaux paramètres qui influent sur la construction d’une innovation pédagogique. Nous concluons cette thèse par des recommandations et des pistes de recherches.

Étude de la variabilité spectroscopique d’un échantillon d’étoiles Wolf-Rayet de type WC9

Nous savons que la grande majorité des étoiles WC9 produit de la poussière à base de carbone. Cette dernière doit se former dans des zones de très haute densité afin de survivre à l’environnement hostile qu’est celui du vent d’une étoile WR. Les étoiles WC appartenant à un système binaire WR + O produisent de la poussière quand les vents des deux étoiles entrent en collision et forment une zone de choc pouvant augmenter la densité du gaz d’un facteur 1000. Par contre, plusieurs étoiles WC9 n’ont, à ce jour, montré aucun signe de la présence d’un compagnon. Le but du projet est de tenter d’identifier un mécanisme alternatif responsable de la formation de poussière dans les étoiles WC9 n’appartenant pas à un système binaire. Nous présentons les résultats d’une campagne d’observation visant à caractériser la variabilité spectroscopique d’un échantillon de huit étoiles WC9 et une étoile WC8d. Nos résultats indiquent que la majorité des étoiles montrent des variations à grande échelle dans la raie d’émission C III 5696, soit à un niveau d’au moins 5% du flux de la raie et que les structures dans le vent ont une dispersion de vitesses de l’ordre de 150-300 km/s. De manière générale, les variations de vitesse radiales sont anti-corrélées avec le coefficient d’asymétrie de la raie, ce qui semble infirmer la présence d’un compagnon. Des observations en photométrie de l’étoile WR103 montrent une période de 9.1 ± 0.6 jours qui s’accorde avec les variations spectroscopiques et qui ne semble pas, de manière évidente, d’origine binaire.