Endothelin-1 and H2O2-induced signaling in vascular smooth muscle cells : modulation by CaMKII and Nitric oxide

L’endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoactif extrêmement puissant qui possède une forte activité mitogénique dans les cellules du muscle lisse vasculaire (VSMCs). Il a été démontré que l’ET-1 est impliquée dans plusieurs maladies cardio-vasculaires, comme l’athérosclérose, l'hypertension, la resténose après l'angioplastie, l’insuffisance cardiaque et l'arythmie. L’ET-1 exerce ses effets via plusieurs voies de signalisation qui incluent le Ca2+, les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPKs) y compris les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB). Plusieurs études ont démontré que les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) peuvent jouer un rôle important dans la signalisation d’ERK1/2 et de PKB induite par plusieurs facteurs de croissance et hormones. Nous avons précédemment montré que l'ET-1 produit des ROS qui agissent comme médiateur de la signalisation cellulaire induite par l’ET-1. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), une molécule qui appartient à la famille des ROS, peut activer les voies de la MAPK et de la PKB dans les VSMCs. Par ailleurs, nos résultats suggèrent également que le Ca2+ et la calmoduline (CaM) sont essentiels pour la phosphorylation d’ERK1/2, de p38 et de PKB induite par le H2O2 dans les VSMCs. La Ca2+/CaM-dependent protein kinases II (CaMKII) est une sérine/thréonine protéine kinase multifonctionnelle activée par le Ca2+/CaM. Il a été montré que la CaMKII est impliquée dans les voies de signalisation induite par le H2O2 dans les cellules endothéliales. Cependant, le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de la proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) induite par l’ET-1 et le H2O2, de même que son rôle dans l’effet hypertrophique et prolifératif de l’ET-1 dans les VSMCs demeure inexploré. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule vasoactive impliquée dans la régulation de plusieurs réponses hormonales. Le NO peut moduler la signalisation contrôlant la croissance cellulaire induite par plusieurs agonistes d’où son rôle protecteur dans le système vasculaire. Des études ont montré que le NO peut inhiber la voie de Ras/Raf/ERK1/2 et la voie de PKB induite par le facteur de croissance endothélial (EGF) et l’angiotensine II (Ang II). Beaucoup d’autres travaux ont mis en évidence un cross-talk entre les voies de signalisation activées par l’ET-1 et le NO. La capacité du NO à inhiber la signalisation intracellulaire induite par l’ET-1 dans les VSMCs demeure inconnue. Le travail présenté dans cette thèse vise à déterminer le rôle du système Ca2+-CaM-CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 et le H2O2 ainsi que son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire induites par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également testé le rôle du NO dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 ainsi que la synthèse protéique induite par l’ET-1. Dans la première partie de notre étude, nous avons examiné le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs en utilisant trois approches différentes i.e. l'usage d'inhibiteurs pharmacologiques, un peptide auto-inhibiteur de la CaMKII (CaMKII AIP) et la technique de siRNA. Nous avons démontré que la CaMKII est impliquée dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Des études précédentes ont montré à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques comme le KN-93 que l'Ang II et les agents induisant une augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire comme l’ionomycine, provoquent la phosphorylation d’ERK1/2 via la CaM dans les VSMCs. Cependant, en utilisant différentes approches, nos études ont montré pour la première fois une implication de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également rapporté pour la première fois, un rôle crucial de la CaMKII dans la pathophysiologie vasculaire associée à l’ET-1 puisque l’activation de la CaMKII joue un rôle important dans l’hypertrophie et la croissance cellulaire. Dans la deuxième partie, à la lumière des études précédentes qui montraient que les ROS agissent comme médiateurs de la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs, nous avons examiné si la CaMKII est également impliquée dans l’activation des voies d’ERK1/2 et de PKB induite par le H2O2. En utilisant des approches pharmacologiques et moléculaires, nous avons montré, comme pour l’ET-1, que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par le H2O2. Nous avons précédemment montré que la transactivation du récepteur de type I de l’insulin-like growth factor (IGF-1R) est nécessaire à l’activation de PKB induite par le H2O2. Pour cette raison, nous avons examiné l'effet de l'inhibition de la CaMKII par l’inhibiteur pharmacologique ou par le knock-down de la CaMKII sur la phosphorylation d’IGF-1R induite par le H2O2. Les résultats démontrent que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et d’IGF-1R induite par le H2O2. Dans la troisième partie de notre étude, nous avons également examiné le mécanisme moléculaire par lequel le NO exerce ses effets anti-mitogéniques et anti-hypertrophiques dans la signalisation induite par l’ET-1. En testant l'effet de deux différents donneurs de NO (S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), sodium nitroprusside (SNP)) et un inhibiteur de NO synthase, le N (G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1, nous avons observé que le NO a un effet inhibiteur sur la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Par ailleurs, le 8-Br-GMPc, un analogue du GMPc, a un effet similaire à celui des deux donneurs du NO, tandis que l’oxadiazole quinoxaline (ODQ), un inhibiteur de la guanylate cyclase soluble, inverse l'effet inhibiteur du NO. Nous concluons que le NO diminue la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 d’une manière dépendante du GMPc. Le NO inhibe aussi les effets hypertrophiques de l’ET-1 puisque le traitement avec le SNAP diminue la synthèse des protéines induite par l’ET-1. En résumé, les études présentées dans cette thèse démontrent que l’ET-1 et le H2O2 sont des activateurs de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 dans les VSMCs et que la CaMKII s’avère nécessaire pour ce processus, en agissant en amont de l’activation de IGF-1R induite par le H2O2 dans les VSMCs. Elles montrent également que le NO inhibe la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1. Enfin, nos travaux suggèrent aussi que l’activation de la CaMKII stimule la synthèse des protéines et de l’ADN induites par l’ET-1 alors que le NO inhibe la synthèse des protéines induite par ET-1. Mots clés: Endothéline ; Peroxyde d'hydrogène ; CaMKII ; Monoxyde d’azote ; Système vasculaire ; PKB; ERK1/2; IGF-1R; Hypertrophie.

Contribution of tachykinin and kinin receptors in central autonomic control of blood pressure and behavioural activity in hypertensive rats

This work aims at studing the role of tachykinin NK-3 receptor (R) and kinin B1R in central autonomic regulation of blood pressure (BP) and to determine whether the B1R is overexpressed and functional in rat models of hypertension by measuring the effect of a B1R agonist on behavioural activity. Assumptions: (1) NK-3R located in the ventral tegmental area (VTA) modulates the mesolimbic dopaminergic system and has a tonic activity in hypertension; (2) B1R is overexpressed in the brain of hypertensive rats and has a tonic activity, which contributes to hypertension via a dopamine mechanism; (3) the inhibition of NK-3R and B1R with selective antagonists, reduces central dopaminergic hyperactivity and reverses hypertension. A model of genetic hypertension and a model of experimental hypertension were used: spontaneously hypertensive rats (SHR, 16 weeks) and Wistar-Kyoto (WKY) rats infused for 14 days with angiotensin II (Ang II) (200 ng / kg / min, subcutaneous (s.c.) with Alzet mini pump). The age-matched untreated WKY rats served as common controls. In the first study (article # 1), the cardiovascular response in SHR was evaluated following intracebroventricular (i.c.v.) and/or intra-VTA injection of an agonist (senktide) and antagonists (SB222200 and R-820) of NK-3R. These responses have also been characterized using selective dopamine antagonists DA-D1R (SCH23390), DA-D2R (raclopride) or non-selective dopamine DA-D2R (haloperidol). Also the VTA has been destroyed by ibotenic acid. The pressor response induced by senktide and the anti-hypertensive response induced by SB222200 or R-820 were more pronounced by intra-VTA. These responses were prevented by pre-treatment with raclopride and haloperidol. The lesion of the VTA has prevented the pressor response relayed by senktide (i.c.v.) and the anti-hypertensive effect of R-820 (i.c.v.). In addition, SB222200 (intra-VTA) prevented the pressor response of senktide (i.c.v.) and conversely, senktide (i.c.v.) prevented the antihypertensive effect of SB222200 (intra-VTA). The second study (article # 2) showed that the B1R antagonist (SSR240612) administered by gavage or i.c.v. reverses hypertension in both models. This anti-hypertensive effect was prevented by raclopride and haloperidol. In contrast, the two B1R antagonists (R-715 and R-954) injected s.c., which do not cross the blood-brain barrier reduced weakly blood pressure in hypertensive rats. In the third study (article # 3), the i.c.v. injection of a selective kinin B1R agonist Sar[DPhe8][des-Arg9]BK caused behavioural responses in SHR and Ang II-treated rats and had no effect in control WKY rats . The responses elicited by B1R agonist were blocked by an antagonist of NK-1 (RP67580), an antagonist of NMDA glutamate receptor (DL-AP5), an inhibitor of nitric oxide synthase (NOS) (L -NNA) as well as raclopride and SCH23390.The responses were modestly affected by the inhibitor of inducible NOS (iNOS). The B1R mRNA (measured by RT-PCR) was significantly increased in the hypothalamus, the VTA and the nucleus accumbens of hypertensive animals (SHR and treated with Ang II) compared with control rats. These neuropharmacological studies suggest that: (1) the NK-3R from the VTA is involved in the maintenance of hypertension in SHR by increasing DA transmission in the midbrain; (2) the B1R in SHR and Ang II-treated rats contributes to hypertension via a central mechanism involving DA-D2R; (3) the central B1R increases locomotor activity and nocifensive behaviours via the release of substance P (NK-1), DA and nitric oxide in both rat models of hypertension. Thus, the brain tachykinin NK-3R and kinin B1R represent potential therapeutic targets for the treatment of hypertension. The modulation of the mesolimbic/mesocortical dopaminergic pathway by these receptors suggests their involvement in other physiological functions (pleasure, motor activity, coordination of the response to stress) and pathophysiology (anxiety, depression).

Role of histone methylation in the regulation of COX-2, iNOS, and mPGES-1 gene expression in human chondrocytes: Implication for Osteoarthritis

L'arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative, classée comme la forme la plus fréquente au monde. Elle est caractérisée par la dégénérescence du cartilage articulaire, l’inflammation de la membrane synoviale, et le remodelage de l’os sous-chondral. Ces changements structurels et fonctionnels sont dues à de nombreux facteurs. Les cytokines, les prostaglandines (PG), et les espèces réactives de l'oxygène sont les principaux médiateurs impliqués dans la pathophysiologie de l'OA. L'interleukine-1β (IL-1β) est une cytokine pro-inflammatoire majeure qui joue un rôle crucial dans l'OA. L'IL-1β induit l'expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2), la microsomale prostaglandine E synthase-1 (mPGES-1), la synthase inductible de l'oxyde nitrique (iNOS), ainsi que leurs produits la prostaglandine E2 (PGE2) et l'oxyde nitrique (NO). Ce sont des médiateurs essentiels de la réponse inflammatoire au cours de l'OA qui contribuent aux mécanismes des douleurs, de gonflement, et de destruction des tissus articulaires. Les modifications épigénétiques jouent un rôle très important dans la régulation de l’expression de ces gènes pro-inflammatoires. Parmi ces modifications, la méthylation/ déméthylation des histones joue un rôle critique dans la régulation des gènes. La méthylation/ déméthylation des histones est médiée par deux types d'enzymes: les histones méthyltransférases (HMT) et les histones déméthylases (HDM) qui favorisent l’activation et/ou la répression de la transcription. Il est donc nécessaire de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’expression des gènes de la COX-2, la mPGES-1, et l’iNOS. L'objectif de cette étude est de déterminer si la méthylation/déméthylation des histones contribute à la régulation de l’expression des gènes COX-2, mPGES-1, et iNOS dans des chondrocytes OA humains induits par l'IL-1β. Nous avons montré que la méthylation de la lysine K4 de l'histone H3 (H3K4) par SET-1A contribue à l’activation des gènes COX-2 et iNOS dans les chondrocytes humains OA induite par l'IL-1β. Nous avons également montré que la lysine K9 de l’histone H3 (H3K9) est déméthylée par LSD1, et que cette déméthylation contribue à l’expression de la mPGES-1 induite par IL-1β dans les chondrocytes humains OA. Nous avons aussi trouvé que les niveaux d'expression des enzymes SET-1A et LSD1 sont élevés au niveau du cartilage OA. Nos résultats montrent, pour la première fois, l'implication de la méthylation/ déméthylation des histones dans la régulation de l’expression des gènes COX-2, mPGES-1, et iNOS. Ces données suggèrent que ces mécanismes pourraient être une cible potentielle pour une intervention pharmacologique dans le traitement de la physiopathologie de l'OA.

Influence du chondroïtine sulfate (CS) sur l’activité et l’expression de plusieurs isoformes du cytochrome P450 et de la NADPH P450 réductase

Le CS fait partie de la famille des SYSADOA (SYmptomatic Slow Acting Drugs for OsteoArthritis) et est utilisé par les patients avec de l’ostéoarthrose de façon chronique pour ses propriétés anti-inflammatoires. Étant donné que ces patients reçoivent d’autres médicaments, il était intéressant de documenter les effets du CS sur le cytochrome P450 et la NADPH-réductase (NADPH). Pour cette étude, deux modèles ont été utilisés: des lapins témoins (LT) et des lapins avec une réaction inflammatoire (LRI) afin de diminuer l’activité et l’expression du CYP. Six groupes contenant chacun cinq lapins ont été utilisés: un groupe sans CS et deux groupes qui ont pris oralement dans l’eau approximativement 20.5 mg/kg/jour de CS pendant 20 et 30 jours; les lapins des trois groupes restants ont pris du CS comme décrit plus haut, mais ont reçu 5 ml sous-cutanées de térébenthine afin de produire une réaction inflammatoire aseptique (RIA) deux jours avant leur sacrifice, c’est-à-dire aux jours -2, 18 et 28. Les hépatocytes ont été isolés pour évaluer l’activité et l’expression du CYP3A6, CYP1A2 et NADPH et aussi le ARNm de ces protéines. In vitro, nous avons étudié l’effet de différentes concentrations de CS-disaccharides sulfatés, 4S, 6S, et 4,6S de CS, sur l’activité et l’expression du CYP1A2 et du CYP3A6. Pour documenter la présence de la réaction inflammatoire, nous avons mesure les mucoprotéines, dans le sérum des lapins avec une réaction inflammatoire. Aussi nous avons mesuré la présence de l’oxide nitrique (NO) chez les hépatocytes de lapins contrôles et chez les hépatocytes des lapins avec une réaction inflammatoire. La translocation nucléaire du NF-κB a été etudiée par fluorescence chez les hépatocytes. Par comparaison aux lapins témoins, l’administration du CS pendant 20 et 30 jours n’affecte pas l’activité du CYP3A6 et du CYP1A2. La RIA a augmenté les mucoprotéines à 95,1±5,7 vs 8,4±1,6 mg/dl dans les lapins témoins (p<0,05). La RIA a diminué l’activité du CYP3A6 de 62% et l’activité du CYP 1A2 de 54%. Le CS n’empêché pas la diminution du CYP1A2 produite par la RIA. Par ailleurs, le CS n’affecte pas l’activité ni l’expression de la NADPH. La translocation nucléaire de NF-κB a été empêche par l’administration chronique de CS aux lapins avec RIA; en plus, la concentration de l’oxide nitrique n’a pas démontré une augmentation en présence de CS; par contre, CS n’empêche pas l’augmentation des séromucoïdes. Au contraire, CS affecte la diminution du CYP3A6 en fonction de temps et secondaire à la RIA. Dans ce group, CS a rétabli le niveau des protéines du CYP3A6 observé dans le group de lapins témoins. Pourtant cette croissance été independante de mRNA qui garde un niveau trés bas. Le plus remarcable a été la manière dont CS a augmenté la protéine du CYP3A6, sans avoir rétabli l’activité de cet isoforme. Finalement, in vitro, CS et ses trois disaccharides sulfatés (4S, 6S et 4,6S) n’affectent ni l’activité ni l’expression de CYP1A2, CYP3A6 et de la NADPH. En conclusion, l’administration chronique de CS n’affecte pas l’activité ni l’expression du CYP1A2, ou la diminution du CYP1A2 produite par la réaction inflammatoire. Le CS n’affecte pas l’activité ni l’expression du NADPH. Cependant, CS empêche la diminution du CYP3A6 en fonction de temps et secondaire à la RIA.

Effets d'agents morphogénétiques sur la prolifération et la différenciation neuronales et épithéliales chez la pensée de mer Renilla koellikeri

La présence d’un récepteur de type RXR a récemment été rapporté chez la pensée de mer, Renilla koellikeri, de même que chez d’autres anthozoaires, et le NO semble jouer des différents rôles physiologiques, chez plusieurs cnidaires. L’acide rétinoïque (AR) et le monoxyde d’azote (NO) sont connus pour leur implication dans l’induction de la croissance des neurites chez les vertébrés ainsi que chez les invertébrés. Mais jusqu’à présent, aucun rôle de ces agents n’a encore été identifié chez ce phylum ancien des invertébrés. Dans le but de montrer que ces agents morphogénétiques ont un rôle dans le développement neuronal chez ces ancêtres des métazoaires bilatéraux, nous avons utilisé des cultures primaires de cellules du cnidaire anthozoaire Renilla koellikeri (pensée de mer), doté d’un système nerveux des plus primitif. Nous avons trouvé que les deux types d’acide rétinoïque, 9-cis et 11-trans, induisent une prolifération cellulaire dose-dépendante en fonction du temps dans les boîtes de pétri enduites de polylysine. Les cultures cellulaires exposées à l’acide rétinoïque dans les boîtes sans polylysine montrent une différenciation en des cellules épithéliales. D’autre part, le NO induit exclusivement une différenciation neuronale dans les boîtes enduites de polylysine. Aucun autre type de cellules subit un différenciation en présence de NO et la densité des cellules dédifférenciées a diminué. Les prolongements des neurones différenciés semblent s’enchevêtrer et former un réseau neuronal assez dense. L’ensemble de ces observations suggère que l’acide rétinoïque, contrairement à NO, est associé à l’activité mitotique, et que l’acide rétinoïque et le NO sont impliqués différemment dans la spécification cellulaire, respectivement épithéliale et neuronale, chez la pensée de mer. Le type d’action déclenchée, qu’il soit la mitogénèse ou la différenciation (épithéliale ou neuronale), varie alors selon l’état d’adhésion des cellules au substrat. Comme les données moléculaires et paléontologiques rapprochent les cnidaires, telle la pensée de mer, des ancêtres des eumétazoaires, nos résultats suggèrent que le rôle morphogénétique de l’acide rétinoïque et du NO est enraciné dans l’ancêtre commun de tous les métazoaires.

Le syndrome métabolique chez les congéniques du rat Dahl : influence de la diète et rôle du récepteur de l'ANP

L’hypertension artérielle et l’obésité sont deux composantes conjointement reliées du syndrome métabolique. Les récepteurs de l’ANP (GCA) et de l’oxyde nitrique (GCs) ont des propriétés diurétiques, natriurétiques, vasodilatatrices et sont liés au contrôle de la pression. Des études récentes ont démontré leur implication dans l’obésité. Hypothèse : Une différence génétique au niveau du gène GCA pourrait contribuer à des différences physiologiques. La composante lipidique et/ou sodique de la diète pourrait influencer la fonction rénale, cardiaque et les valeurs anthropométriques différemment chez les souches congéniques. Objectifs : (1) Déterminer l’effet de la composante lipidique et sodique des diètes; (2) Évaluer l’influence de GCA sur la réponse physiologique des souches congéniques; (3) Expliquer les mécanismes physiologiques procurant une réduction de la pression artérielle chez la souche SM9. Méthodologie : Des modèles congéniques du rat Dahl (DSS) hypertendu, nourri avec une diète riche en gras (HF) ou normale (NF), ont été utilisés pour démontrer l’impact d’un segment chromosomique d’origine normotendue. Résultats : La souche SM9 a une prise de poids plus importante que SM12 et DSS sur diète HF malgré un apport alimentaire équivalent. La souche SM9 présente également un ratio masse adipeuse/masse maigre plus élevé que SM12 et DSS. Nous n’avons observé aucune augmentation de la pression artérielle en réponse à la diète HF pour les 3 souches malgré une augmentation du dommage rénal pour les 3 souches. Le dommage rénal est plus important chez DSS que pour les 2 congéniques. La réponse diurétique à l’ANP est plus élevée chez SM9 et est influencée par le contenu en sel dand la diète. La perte glomérulaire plus importante chez le rat DSS semble compensée par une augmentation de la réponse à l’ANP par les glomérules résiduels. Il y a une corrélation entre l’activité de GCA en réponse à l’ANP, les niveaux d’ARNm et le nombre de répétition du dinucléotide TA dans son promoteur. Le rat DSS présente une hypertrophie cardiaque plus importante que les deux souches congénique et ceci n’est pas modifié par la diète HF. Conclusion : Nos études ont permis de mettre en évidence un effet génétique impliquant le segment chromosomique normotendu contenant GCA dans la réponse à une diète HF chez le rat DSS.

Rôle de l’acétylation/déacétylation des histones dans la régulation de l’expression des gènes de la COX-2, iNOS et mPGES-1 dans les tissus articulaires.

L’arthrose ou ostéoarthrose (OA) est l’affection rhumatologique la plus fréquente au monde. Elle est caractérisée principalement par une perte du cartilage articulaire et l’inflammation de la membrane synoviale. L’interleukine (IL)-1ß, une cytokine pro-inflammatoire, joue un rôle très important dans la pathogenèse de l’OA. Elle exerce son action en induisant l’expression des enzymes cyclo-oxygénase 2 (COX-2), prostaglandine E synthétase microsomale 1 (mPGES-1) et l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) ainsi que la production de la prostaglandine E2 (PGE2) et de l’oxyde nitrique (NO). Ces derniers (PGE2 et NO) contribuent à la synovite et la destruction du cartilage articulaire par leurs effets pro-inflammatoires, pro-cataboliques, anti-anaboliques, pro-angiogéniques et pro-apoptotiques. Les modifications épigénétiques, telles que la méthylation de l’ADN, et l’acétylation et la méthylation des histones, jouent un rôle crucial dans la régulation de l’expression des gènes. Parmi ces modifications, l’acétylation des histones est la plus documentée. Ce processus est contrôlé par deux types d’enzymes : les histones acétyltransférases (HAT) qui favorisent la transcription et les histones déacétylases (HDAC) qui l’inhibent. L’objectif de ce travail est d’examiner le rôle des enzymes HDAC dans la régulation de l’expression de la COX-2, mPGES-1 et iNOS. Nous avons montré qu’au niveau des chondrocytes, les inhibiteurs des HDAC (iHDAC), trichostatine A (TSA) et butyrate de sodium (NaBu), suppriment l’expression de la COX-2 et iNOS au niveau de l’ARNm et protéique, ainsi que la production de la PGE2 et du NO, induites par l’IL-1ß. L’effet inhibiteur à lieu sans affecter l’activité de liaison à l’ADN du facteur de transcription NF-κB (nuclear factor κ B). La TSA et le NaBu inhibent également la dégradation induite par l’IL-1ß des protéoglycanes au niveau du cartilage. Nous avons également montré, qu’au niveau des fibroblastes synoviaux, les iHDAC, TSA, NaBu et acide valproïque (VA), suppriment l’expression de la mPGES-1 ainsi que la production de la PGE2 induites par l’IL-1ß. En utilisant diverses approches expérimentales, nous avons montré que HDAC4 est impliquée dans l’induction de l’expression de la mPGES-1 par l’IL-1ß. HDAC4 exerce son action, via son activité déacétylase, en augmentant l’activité transcriptionnelle de Egr-1 (early growth factor 1), facteur de transcription principal de l’expression de la mPGES-1. L’ensemble de ces résultats suggère que les inhibiteurs des HDAC pourraient être utilisés dans le traitement de l’OA.

Rôle de l’axe CD40L/CD40 dans les cellules endothéliales progénitrices

Les cellules endothéliales progénitrices («Endothelial Progenitor Cells», EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui possèdent un potentiel considérable dans la réparation et la régénération vasculaire. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, la compréhension du rôle des EPCs dans la régulation de la thrombogenèse et la réparation endothéliale est pertinente et nécessaire pour comprendre leur potentiel thérapeutique. Nous avons rapporté que les EPCs interagissent avec les plaquettes via la P-sélectine et inhibent l’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation de thrombus. Plus récemment, nous avons démontré que les EPCs expriment le récepteur inflammatoire CD40 et il est bien connu que les plaquettes constituent la source principale de la forme soluble de son agoniste le CD40L («soluble CD40 Ligand», sCD40L). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse principale que l’axe CD40L/CD40 dans les EPCs influence leurs fonctions anti-thrombotique et pro-angiogénique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réussi à générer des «early» et «late» EPCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique («Peripheral Blood Mononuclear Cells», PBMCs) en culture. Nous avons mis en évidence l’existence de l’axe CD40L/CD40 dans ces EPCs en démontrant l’expression des protéines adaptatrices, nommées les facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale («TNF Receptor Associated Factors», TRAFs). Dans une première étude, nous avons investigué l’effet du sCD40L sur la fonction des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. En effet, nous avons démontré que le sCD40L renverse leur effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, et ce sans avoir un effet significatif sur la sécrétion de prostacycline (PGI2) et d’oxyde nitrique («Nitric Oxide», NO) par ces cellules. De plus, aucun effet du sCD40L n’a été noté sur l’apoptose et la viabilité de ces cellules. Par contre, nous avons noté une augmentation importante du stress oxydatif dans les «early» EPCs suite à leur stimulation avec le sCD40L. L’inhibition du stress oxydatif renverse l’effet du sCD40L sur les «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. Ces résultats pourraient expliquer, en partie, la fonction réduite des EPCs chez les individus présentant des niveaux élevés de sCD40L en circulation. Dans une deuxième étude, nous avons étudié l’effet de sCD40L dans la fonction des «early» EPCs en relation avec l’angiogenèse. Nous avons identifié, dans un premier temps,les métalloprotéinases de la matrice («Matrix Metalloproteinases», MMPs) qui sont sécrétées par ces cellules. Nous avons trouvé que les «early» EPCs relâchent principalement la MMP-9 et que cette relâche est augmentée par le sCD40L. Le sCD40L induit aussi la phosphorylation de la p38 MAPK qui contribue à augmenter la sécrétion de MMP-9. Des études fonctionnelles ont démontré que le prétraitement des «early» EPCs au sCD40L potentialise la réparation endothéliale des HUVECs. En conclusion, l’ensemble de nos travaux, dans le cadre de ce projet de doctorat, nous a permis d’élucider les mécanismes responsables de l’action du sCD40L sur les effets inhibiteur et angiogénique des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire et l’angiogenèse, respectivement. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur le rôle des EPCs et pourront constituer la base pour des études futures permettant de corréler les niveaux élevés du sCD40L circulant et l’incidence des maladies cardiovasculaires, particulièrement l’athérothrombose.

The role of transcription factor Nrf2 in osteoarthritis

Introduction: L'arthrose est caractérisée par une destruction progressive du cartilage, une inflammation synoviale, et un remodelage de l’os sous-chondral avec une production excessive des médiateurs inflammatoires et cataboliques. Nous avons démontré que le niveau du 4-hydroxynonénal (4-HNE), un produit de la peroxydation lipidique, est augmenté dans le cartilage humain arthrosique sans qu’on sache le mécanisme exacte impliqué dans l’augmentation de cette molécule. Des données de la littérature indiquent que l’accumulation du HNE est contrôlée par l’action de la glutathione S-transférase A4-4 (GSTA4-4), une enzyme impliquée dans la détoxification du HNE. Au niveau transcriptionel, l’expression de cette enzyme est régulée par la transactivation du facteur de transcription Nrf2. Objectif: L’objectif de cette étude vise à démontrer que l’augmentation du HNE dans le cartilage arthrosique est attribuée, en partie, à l’altération de l’expression de la GSTA4-4 et de Nrf2. Méthode: Le niveau d’expression de la GSTA4-4 et de Nrf2 a été mesurée par Western blot et par PCR en temps réel dans le cartilage humain arthrosique et dans le cartilage provenant des souris atteintes d’arthrose. Pour démontrer le rôle du Nrf2 dans l’arthrose, les chondrocytes humains arthrosiques ont été traités par l’interleukine 1beta (IL-1β) ou par le H2O2 en présence ou en absence des activateurs du Nrf2 tels que le Protandim®, AI, et du 6-Gingérol. Par ailleurs, les chondrocytes ont été transfectés par un vecteur d’expression de Nrf2 puis traités par l’IL-β. En utilisant le modèle d’arthrose chez la souris, les animaux ont été traités par voie orale de 10 mg/kg/jour de Protandim® pendant 8 semaines. Résultats: Nous avons observé une diminution significative de l’expression de la GSTA4-4 et de Nrf2 dans le cartilage humain et murin arthrosique. L'activation de Nrf2 bloque la stimulation de la métalloprotéinase-13 (MMP-13), la prostaglandine E2 (PGE2) et de l'oxyde nitrique (NO) par l’IL-1β. En outre, nous avons montré que l'activation Nrf2 protège les cellules contre la mort cellulaire induite par H2O2. Fait intéressant, l'administration orale de Protandim® réduit la production du HNE par l'intermédiaire de l’activation de la GSTA4. Nous avons démontré que le niveau d’expression de la GSTA4-4 et de Nrf2 diminue dans le cartilage provenant des patients et des souris atteints d’arthrose. De plus, la surexpression de ce facteur nucléaire Nrf2 empêche la production du HNE et la MMP-13 et l’inactivation de la GSTA4-4. Dans notre modèle expérimental d’arthrose induite par déstabilisation du ménisque médial chez la souris, nous avons trouvé que l'administration orale de Protandim® à 10 mg / kg / jour réduit les lésions du cartilage. Conclusion: Cette étude est de la première pour démontrer le rôle physiopathologique du Nrf2 in vitro et in vivo. Nos résultats démontrent que l’activation du Nrf2 est essentielle afin de maintenir l’expression de la GSTA4-4 et de réduire le niveau du HNE. Le fait que les activateurs du Nrf2 abolissent la production de la HNE et aussi un certain nombre de facteurs connus pour être impliqués dans la pathogenèse de l’arthrose les rend des agents cliniquement utiles pour la prévention de la maladie.

L’expression des cyclo-oxygénases et des oxydes nitriques synthases avec les protéines adaptatrices TRAFs dans les cellules progénitrices endothéliales

L’interaction du CD40L plaquettaire avec le CD40 exprimé par les mono-lymphocytaires, dont les cellules progénitrices endothéliales (EPCs), médie l’hémostase. Deux sous-types d’EPCs induisent la réparation vasculaire : les early outgrowth cells (EOCs) et les endothelial colony forming cells (ECFCs). Les EOCs expriment des protéines adaptatrices s’associant aux récepteurs du facteur de nécrose tumorale (TRAFs) nécessaires à la signalisation du CD40. L’association des TRAFs au CD40 contribuerait à la fonction antiplaquettaire d’EOCs prétraitées au CD40L, via la libération de prostacycline (PGI2) ou d'oxyde nitrique (NO). Toutefois, la contribution des TRAFs des ECFCs dans la libération de PGI2 et de NO via la régulation des cyclo-oxygénases (COX) et des NO synthases (NOS) demeure inexplorée. Cette étude vise à comprendre le rôle des TRAFs, COX et NOS dans les ECFCs. Nous avons différencié des EPCs via la culture de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMCs) dans un milieu à croissance endothéliale (EGM-2) et révélé, par microscopie optique et confocale, le phénotype monocytaire de nos EOCs et de cellules endothéliales (ECs) de nos ECFCs, incluant leurs caractéristiques endothéliales par cytométrie en flux. L’expression constitutive de l’eNOS, l’iNOS, la COX-1 et faiblement la COX-2 dans nos ECFCs et ECs, des enzymes absentes de nos EOCs, a été décelée par Western Blot. Le profil d'expression des TRAFs dans nos EOCs, ECFCs, PBMCs et ECs a démontré la présence variée du CD40 et celle des TRAF1, 2, 3, 5 et 6, selon le type cellulaire. En conclusion, nous avons révélé la présence de TRAFs, COX et NOS, ainsi que leur expression différentielle dans les EOCs et ECFCs. Des études portant sur l’association des TRAFs au CD40 éclaireront sur les mécanismes intracellulaires impliqués dans la régulation de la synthèse de PGI2 et de NO et la fonction antiplaquettaire des EPCs.

Régulation de l'expression de PPARγ dans l'arthrose

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative très répondue touchant les articulations. Elle est caractérisée par la destruction progressive du cartilage articulaire, l’inflammation de la membrane synoviale et le remodelage de l’os sous chondral. L’étiologie de cette maladie n’est pas encore bien définie. Plusieurs études ont été menées pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l’OA. Les effets protecteurs du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes gamma (PPARγ) dans l'OA sont bien documentés. Il a été démontré que PPARγ possède des propriétés anti-inflammatoires et anti-cataboliques. Aussi, plusieurs stimuli ont été impliqués dans la régulation de l’expression de PPARγ dans différents types cellulaires. Cependant, les mécanismes exacts responsables de cette régulation ainsi que le profil de l’expression de ce récepteur au cours de la progression de l’OA ne sont pas bien connus. Dans la première partie de nos travaux, nous avons essayé d’élucider les mécanismes impliqués dans l’altération de l’expression de PPARγ dans cette maladie. Nos résultats ont confirmé l’implication de l’interleukine-1β (IL-1β), une cytokine pro-inflammatoire, dans la réduction de l’expression de PPARγ au niveau des chondrocytes du cartilage articulaire. Cet effet coïncide avec l'induction de l’expression du facteur de transcription à réponse précoce de type 1 (Egr-1). En plus, la diminution de l'expression de PPARγ a été associée au recrutement d'Egr-1 et la réduction concomitante de la liaison de Sp1 au niveau du promoteur de PPARγ. Dans la deuxième partie de nos travaux, nous avons évalué le profil d’expression de ce récepteur dans le cartilage au cours de la progression de cette maladie. Le cochon d’inde avec OA spontanée et le chien avec OA induite par rupture du ligament croisé antérieur (ACLT) deux modèles animaux d’OA ont été utilisés pour suivre l’expression des trois isoformes de PPARs : PPAR alpha (α), PPAR béta (β) et PPAR gamma (γ) ainsi que la prostaglandine D synthase hématopoïétique (H-PGDS) et la prostaglandine D synthase de type lipocaline (L-PGDS) deux enzymes impliquées dans la production de l’agoniste naturel de PPARγ, la 15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandine J(2) (15d-PGJ2). Nos résultats ont démontré des changements dans l’expression de PPARγ et la L-PGDS. En revanche, l’expression de PPARα, PPARβ et H-PGDS est restée stable au fil du temps. La diminution de l’expression de PPARγ dans le cartilage articulaire semble contribuer au développement de l’OA dans les deux modèles animaux. En effet, le traitement des chondrocytes par de siRNA dirigé contre PPARγ a favorisé la production des médiateurs arthrosiques tels que l'oxyde nitrique (NO) et la métalloprotéase matricielle de type 13 (MMP-13), confirmant ainsi le rôle anti-arthrosique de ce récepteur. Contrairement à ce dernier, le niveau d'expression de la L-PGDS a augmenté au cours de la progression de cette maladie. La surexpression de la L-PGDS au niveau des chondrocytes humains a été associée à la diminution de la production de ces médiateurs arthrosiques, suggérant son implication dans un processus de tentative de réparation. En conclusion, l’ensemble de nos résultats suggèrent que la modulation du niveau d’expression de PPARγ, de la L-PGDS et d’Egr-1 au niveau du cartilage articulaire pourrait constituer une voie thérapeutique potentielle dans le traitement de l’OA et probablement d’autres formes d'arthrite.