9 resultados para osteogenic differentiation
em Université de Montréal, Canada
Resumo:
BACKGROUND: The role of ss-catenin signaling in mesodermal lineage formation and differentiation has been elusive. METHODOLOGY: To define the role of ss-catenin signaling in these processes, we used a Dermo1(Twist2)(Cre/+) line to target a floxed beta-catenin allele, throughout the embryonic mesenchyme. Strikingly, the Dermo1(Cre/+); beta-catenin(f/-) conditional Knock Out embryos largely phenocopy Pitx1(-/-)/Pitx2(-/-) double knockout embryos, suggesting that ss-catenin signaling in the mesenchyme depends mostly on the PITX family of transcription factors. We have dissected this relationship further in the developing lungs and find that mesenchymal deletion of beta-catenin differentially affects two major mesenchymal lineages. The amplification but not differentiation of Fgf10-expressing parabronchial smooth muscle progenitor cells is drastically reduced. In the angioblast-endothelial lineage, however, only differentiation into mature endothelial cells is impaired. CONCLUSION: Taken together these findings reveal a hierarchy of gene activity involving ss-catenin and PITX, as important regulators of mesenchymal cell proliferation and differentiation.
Resumo:
Les lymphocytes B et T sont issus de cellules prognitrices lymphodes de la moelle osseuse qui se diffrencient grce laction de facteurs de transcription, cytokines et voies de signalisation, dont linterleukine-7 (IL-7)/IL-7 rcepteur (IL-7R). Le facteur de transcription c-Myc est exprim par les cellules lymphodes et contrle leur croissance et leur diffrenciation. Cette rgulation transcriptionnelle peut tre coordonne par le complexe c-Myc/Myc-Interacting Zinc finger protein-1 (Miz-1). Le but de ce projet tait de comprendre les mcanismes qui impliquent Miz-1 et le complexe c-Myc/Miz-1 dans le dveloppement des lymphocytes B et T. Pour raliser ce projet, des souris dficientes pour le domaine de transactivation de Miz-1 (Miz-1POZ) et des souris allles mutantes pour c-MycV394D, mutation qui empche linteraction avec Miz-1, ont t gnres. La caractrisation des souris Miz 1POZ a dmontr que linactivation de Miz-1 perturbe le dveloppement des lymphocytes B et T aux stades prcoces de leur diffrenciation qui dpend de lIL-7. Lanalyse de la cascade de signalisation IL-7/IL-7R a montr que ces cellules surexpriment la protine inhibitrice SOCS1 qui empche la phosphorylation de STAT5 et perturbe la rgulation la hausse de la protine de survie Bcl-2. De plus, Miz-1 se lie directement au promoteur de SOCS1 et contrle son activit. En plus de contrler laxe IL-7/IL-7R/STAT5/Bcl-2 spcifiquement aux stades prcoces du dveloppement afin dassurer la survie des progniteurs B et T, Miz-1 rgule laxe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B afin de coordonner les signaux ncessaires pour la diffrenciation des cellules immatures. La caractrisation des souris c-MycV394D a montr, quant elle, que les fonctions de Miz-1 dans les cellules B et T semblent indpendantes de c-Myc. Les cellules T des souris Miz-1POZ ont un dfaut de diffrenciation additionnel au niveau de la -slection, tape o les signaux initis par le TCR remplacent ceux induits par IL-7 pour assurer la prolifration et la diffrenciation des thymocytes en stades plus matures. cette tape du dveloppement, une forme fonctionnelle de Miz-1 semble tre requise pour contrler le niveau dactivation de la voie p53, induite lors du processus de rarrangement V(D)J du TCR. Lexpression de gnes pro-apoptotiques PUMA, NOXA, Bax et du rgulateur de cycle cellulaire p21CIP1 est rgule la hausse dans les cellules des souris Miz-1POZ. Ceci provoque un dbalancement pro-apoptotique qui empche la progression du cycle cellulaire des cellules TCR-positives. La survie des cellules peut tre rtablie ce stade de diffrenciation en assurant une coordination adquate entre les signaux initis par lintroduction dun TCR transgnique et dun transgne codant pour la protine Bcl-2. En conclusion, ces tudes ont montr que Miz-1 intervient deux niveaux du dveloppement lymphode: lun prcoce en contrlant la signalisation induite par lIL-7 dans les cellules B et T, en plus de laxe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B; et lautre tardif, en coordonnant les signaux de survie issus par le TCR et p53 dans les cellules T. tant donn que les thymocytes et lymphocytes B immatures sont sujets plusieurs rondes de prolifration, ces tudes serviront mieux comprendre limplication des rgulateurs du cycle cellulaire comme c-Myc et Miz-1 dans la gnration des signaux ncessaires la diffrenciation non aberrante et la survie des ces cellules. Enfin, les modles exprimentaux, souris dficientes ou allles mutantes, utiliss pour ce travail permettront de mieux dfinir les bases molculaires de la transformation maligne des lymphocytes B et T et de rvler les mcanismes conduisant au lymphome.
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Les modifications post-transcriptionnelles de lARN messager (ARNm), comme lpissage alternatif, jouent un rle important dans la rgulation du dveloppement embryonnaire, de la fonction cellulaire et de limmunit. De nouvelles vidences rvlent que lpissage alternatif serait galement impliqu dans la rgulation de la maturation et de lactivation des cellules du systme hmatopotique. Le facteur hnRNP L a t identifi comme tant le principal rgulateur de lpissage alternatif du gne codant pour le rcepteur CD45 in vitro. Le rcepteur CD45 est une tyrosine phosphatase exprime par toutes les cellules du systme hmatopotique qui contrle le dveloppement et lactivation des lymphocytes T. Dans un premier temps, nous avons tudi la fonction du facteur hnRNP L dans le dveloppement des lymphocytes T et dans lpissage de lARNm de CD45 in vivo en utilisant des souris dont le gne de hnRNP L a t supprim spcifiquement dans les cellules T. La dltion de hnRNP L dans les thymocytes rsulte en une expression aberrante des diffrents isoformes de CD45 avec une prdominance de l'isoforme CD45RA qui est gnralement absent dans le thymus. Une consquence de la dltion de hnRNP L est une diminution de la cellularit du thymus cause par un blocage partiel du dveloppement des cellules pr-T au stade DN4. Cette rduction du nombre de cellules dans le thymus nest pas lie une hausse de la mort cellulaire. Les thymocytes dficients pour hnRNP L dmontrent plutt une prolifration augmente compare aux thymocytes sauvages due une hyper-activation des kinases Lck, Erk1/2 et Akt. De plus, la dltion de hnRNP L dans le thymus cause une perte des cellules T en priphrie. Les rsultats des expriences in vitro suggrent que cette perte est principalement due un dfaut de migration des thymocytes dficients pour hnRNP L du thymus vers la priphrie en rponse aux chimiokines. Lpissage alternatif de CD45 ne peut expliquer ce phnotype mais lidentification de cibles par RNA-Seq a rvl un rle de hnRNP L dans la rgulation de lpissage alternatif de facteurs impliqus dans la polymrisation de lactine. Dans un second temps, nous avons tudi le rle de hnRNP L dans lhmatopose en utilisant des souris dont la dltion de hnRNP L tait spcifique aux cellules hmatopotiques dans les foies ftaux et la moelle osseuse. Lablation de hnRNP L rduit le nombre de cellules prognitrices incluant les cellules prognitrices lymphocytaires (CLPs), mylodes (CMPs, GMPs) et mgakaryocytes-rythrocytaires (MEPs) et une perte des cellules hmatopotiques matures. loppos des cellules prognitrices multipotentes (MPPs) qui sont affectes en absence de hnRNP L, la population de cellules souches hmatopotiques (HSCs) nest pas rduite et prolifre plus que les cellules contrles. Cependant, les HSCs nexprimant pas hnRNP L sont positives pour l'Annexin V et expriment CD95 ce qui suggre une mort cellulaire prononce. Comme pour les thymocytes, une analyse par RNA-Seq des foies ftaux a rvl diffrents gnes cibles de hnRNP L appartenant aux catgories relies la mort cellulaire, la rponse aux dommages lADN et ladhsion cellulaire qui peuvent tous expliquer le phnotype des cellules nexprimant pas le gne hnRNP L. Ces rsultats suggrent que hnRNP L et lpissage alternatif sont essentiels pour maintenir le potentiel de diffrenciation des cellules souches hmatopotiques et leur intgrit fonctionnelle. HnRNP L est aussi crucial pour le dveloppement des cellules T par la rgulation de lpissage de CD45 ainsi que pour leur migration.
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Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral.
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Les cellules T CD8+ jouent un rle primordial dans le contrle des infections virales en limitant la dissmination des cellules infectes. Lors de linfection chronique par le virus HIV, les cellules T CD8+ HIV-spcifiques ne se diffrencient pas en cellules effectrices fonctionnelles capables de tuer les cellules infectes par le virus ; ces cellules ne sont plus capables de prolifrer ou de produire l IL-2. Ces cellules expriment PD-1 et lengagement de PD-1, par son ligand, aboutit a plusieurs de ces dficits fonctionnels des cellules T . Le rle de PD-1 dans la rgulation d'vnements transcriptionnels contrlant la diffrentiation et l'obtention des fonction effectrices des cellules T CD8+ reste dmontrer. Id2 joue un rle central dans la diffrenciation des cellules T CD8+ effectrices. Nous avons mis lhypothse que le dfaut de maturation observ chez les cellules T CD8+ PD-1 high HIV-spcifiques (CD8+PD-1hi) au cours de linfection chronique par le virus HIV pouvait tre li la diminution dexpression du rgulateur Id2. Nous avons ainsi dmontr que l'engagement de PD-1 contribuait une diminution d'expression de Id2 et de ses cibles transcriptionnelles. La surexpression de Id2 de ces cellules a permis de restaurer l'expression de marqueurs tels que Granzyme B et Bcl-2 et diminuir lexpression du marqueur de maturation de CD27. La famille des cytokines chaine gamma joue un rle clef dans la survie et lhomostasie des cellules T. Dans ce travail, nous avons dmontr que lIL-15 tait unique grce ses capacits de stimulation de lexpression dId2 et ses proprits favorisant la survie ainsi que la diffrenciation des cellules T CD8+ effectrices. lIL-15 induit la prolifration de toutes les populations de cellules T mmoires provenant de donneurs sains. Laddition de cette cytokine aux sous-populations cellulaires Ttm et Tem a permis leur diffrenciation en cellules effectrices capables de produire Granzyme B alors que la stimulation par lIL-15 des cellules Tcm ne favorise pas leur diffrenciation. Un test de cytotoxiciti par cytomtrie en flux nous a permis de confirmer que la stimulation de cellules T CD8+ HIV spcifiques par lIL-15 favorisait lexpression de Id2 et restaurait les fonctions cytotoxiques des cellules T CD8+ HIV spcifiques. En conclusion, nous avons pour la premire fois dans cette thse dfini les mcanismes molculaires impliqus dans la modulation de lexpression du rgulateur transcriptionnel Id2 par lIL-15. Nous avons galement rvl comment lengagement de PD-1 conduisait a une altration de lexpression et de la fonction dId2 et favorisait la diminution des fonctions effectrices des cellules T CD8-HIV spcifiques. Une perspective de traitement avec des agents tels que lIL-15 ou le bloquage de PD-1, en combinaison avec les traitements conventionnels, pourrait contribuer une meilleure stimulation des rponses immunes favorisant ainsi la ractivation des cellules T CD8+ et permettant la destruction de cellules T CD4+ infectes de manire latente.
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Induced pluripotent stem cells (iPSC) have the capacity to self renew and differentiate into a myriad of cell types making them potential candidates for cell therapy and regenerative medicine. The goal of this thesis was to determine the characteristics of equine iPSC (eiPSC) that can be harnessed for potential use in veterinary regenerative medicine. Trauma to a horses limb often leads to the development of a chronic non-healing wound that lacks a keratinocyte cover, vital to healing. Thus, the overall hypothesis of this thesis was that eiPSC might offer a solution for providing wound coverage for such problematic wounds. Prior to considering eiPSC for clinical applications, their immunogenicity must be studied to ensure that the transplanted cells will be accepted and integrate into host tissues. The first objective of this thesis was to determine the immune response to eiPSC. To investigate the immunogenicity of eiPSC, the expression of major histocompatibility complex (MHC) molecules by the selected lines was determined, then the cells were used in an intradermal transplantation model developed for this study. While transplantation of allogeneic, undifferentiated eiPSC elicited a moderate cellular response in experimental horses, it did not cause acute rejection. This strategy enabled the selection of weakly immunogenic eiPSC lines for subsequent differentiation into lineages of therapeutic importance. Equine iPSC offer a potential solution to deficient epithelial coverage by providing a keratinocyte graft with the ability to differentiate into other accessory structures of the epidermis. The second objective of this thesis was to develop a protocol for the differentiation of eiPSC into a keratinocyte lineage. The protocol was shown to be highly efficient at inducing the anticipated phenotype within 30 days. Indeed, the eiPSC derived vi keratinocytes (eiPSC-KC) showed both morphologic and functional characteristics of primary equine keratinocytes (PEK). Moreover, the proliferative capacity of eiPSC-KC was superior while the migratory capacity, measured as the ability to epithelialize in vitro wounds, was comparable to that of PEK, suggesting exciting potential for grafting onto in vivo wound models. In conclusion, equine iPSC-derived keratinocytes exhibit features that are promising to the development of a stem cell-based skin construct with the potential to fully regenerate lost or damaged skin in horses. However, since eiPSC do not fully escape immune surveillance despite low MHC expression, strategies to improve engraftment of iPSC derivatives must be pursued.
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By the end of 2004, the Canadian swine population had experienced a severe 2 increase in the incidence of Porcine circovirus-associated disease (PCVAD), a problem that was 3 associated with the emergence of a new Porcine circovirus-2 genotype (PCV-2b), previously 4 unrecovered in North America. Thus it became important to develop a diagnostic tool that could 5 differentiate between the old and new circulating genotypes (PCV-2a and -2b, respectively). 6 Consequently, a multiplex real-time quantitative polymerase chain reaction (mrtqPCR) assay that 7 could sensitively and specifically identify and differentiate PCV-2 genotypes was developed. A 8 retrospective epidemiological survey that used the mrtqPCR assay was performed to determine if 9 cofactors could affect the risk of PCVAD. From 121 PCV-2positive cases gathered for this 10 study, 4.13%, 92.56% and 3.31% were positive for PCV-2a, PCV-2b, and both genotypes, 11 respectively. In a data analysis using univariate logistic regressions, PCVAD compatible 12 (PCVAD/c) score was significantly associated with the presence of Porcine reproductive and 13 respiratory syndrome virus (PRRSV), PRRSV viral load, PCV-2 viral load, and PCV-2 14 immunohistochemistry (IHC) results. Polytomous logistic regression analysis revealed that 15 PCVAD/c score was affected by PCV-2 viral load (P = 0.0161) and IHC (P = 0.0128), but not by 16 the PRRSV variables (P > 0.9); suggesting that mrtqPCR in tissue is a reliable alternative to IHC. 17 Logistic regression analyses revealed that PCV-2 increased the odds ratio of isolating 2 major 18 swine pathogens of the respiratory tract, Actinobacillus pleuropneumoniae and Streptococcus 19 suis serotypes 1/2, 1, 2, 3, 4, and 7, which are serotypes commonly associated with clinical 20 diseases.
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Afin deffectuer des tudes fonctionnelles sur le gnome de la souris, notre laboratoire a gnr une bibliothque de clones de cellules souches embryonnaires (ESC) prsentant des suppressions chromosomiques chevauchantes alatoires la bibliothque DELES. Cette bibliothque contient des dltions couvrant environ 25% du gnome murin. Dans le laboratoire, nous comptons identifier de nouveaux dterminants du destin des cellules hmatopotiques en utilisant cet outil. Un crible primaire utilisant la benzidine pour dmontrer la prsence d'hmoglobine dans des corps embryodes (EBS) a permis didentifier plusieurs clones dlts prsentant un phnotype hmatopotique anormal. Comme cet essai ne vrifie que la prsence d'hmoglobine, le but de mon projet est d'tablir un essai in vitro de diffrenciation des ESC permettant de mesurer le potentiel hmatopotique de clones DELES. Mon hypothse est que lessai de diffrenciation hmatopotique publi par le Dr Keller peut tre import dans notre laboratoire et utilis pour tudier l'engagement hmatopotique des clones DELES. laide dessais de RT-QPCR et de FACS, jai pu contrler la cintique de diffrenciation hmatopotique en suivant lexpression des gnes hmatopotiques et des marqueurs de surface comme CD41, c-kit, RUNX1, GATA2, CD45, -globine 1 et TER-119. Cet essai sera utilis pour valider le potentiel hmatopotique des clones DELES candidats identifis dans le crible principal. Mon projet secondaire vise utiliser la mme stratgie rtro-virale a base de Cre-loxP utilise pour gnrer la bibliothque DELES pour gnrer une bibliothque de cellules KBM-7 contenant des suppressions chromosomiques chevauchantes. Mon but ici est de tester si la ligne cellulaire leumique humaine presque haplode KBM-7 peut tre exploite en utilisant l'approche DELES pour crer cette bibliothque. La bibliothque de clones KBM-7 servira dfinir les activits molculaires de drogues anti-leucmiques potentielless que nous avons identifies dans le laboratoire parce quelles inhibent la croissance cellulaire dans plusieurs chantillons de leucmie mylode aigu drivs de patients. Elle me permettra galement d'identifier les voies de signalisation molculaires qui, lorsque gntiquement perturbes, peuvent confrer une rsistance ces drogues.
