The effects of administration of a nuclear factor kappa-B inhibitor on pulmonary endothelial dysfunction after cardiopulmonary bypass: impact on oxygenation and hemodynamics and development of therapeutic and preventive modalities in a porcine model

Introduction: La circulation extracorporelle (CEC) peut entraîner une dysfonction endothéliale pulmonaire et l’hypertension pulmonaire. Le SN50 agit au niveau de la signalisation cellulaire pour prévenir ces réactions à la CEC et pourrait renverser la dysfonction endothéliale pulmonaire post-CEC sans effets néfastes sur l’hémodynamie. Méthodes: Quatre groups de porcs ont reçu un parmi quatre traîtements avant de subir 90 minutes de CEC et 60 minutes de reperfusion: (1) milrinone nébulisé; (2) sildenafil nébulisé; (3) placebo nébulisé; et (4) SN-50 intraveineux. Un monitoring hémodynamique invasif a été utilisé. La réactivité vasculaire des artères pulmonaires de deuxième ordre a été évaluée face à l’acétylcholine et la bradykinine. Résultats: Le sildénafil produit une augmentation significative de la pression de l’artère pulmonaire (PAP) moyenne à 60 minutes de reperfusion par rapport au début de la chirurgie. Les relaxations dépendantes de l’endothélium face à la bradykinine étaient meilleurs dans les groupes milrinone et SN-50 et surtout dans le groupe sildénafil par rapport au groupe placébo. Le SN-50 produisait de moins bonnes relaxations dépendantes de l’endothélium face à l’acétylcholine que les autres traitements incluant placébo. Conclusion: Le sildénafil prévient mieux la dysfonction endothéliale pulmonaire que les autres traitements. Les bénéfices du SN-50 sont possiblement sous-estimés vu que la dose n’a pas pu être ajustée à la durée de CEC. Le sildenafil inhalé mérite une étude plus importante chez l’humain et le SN-50 dans un model de CEC animal.

Expression of steroidogenic proteins and genes in bovine placenta from conventional and somatic cell nuclear transfer (SCNT) gestations

Pendant la grossesse, les hormones stéroïdes jouent un rôle indispensable dans la régulation des principales manifestations physiologiques telles que la reconnaissance maternelle de la gestation, la réceptivité de l'endomètre, le début du développement embryonnaire ainsi que le maintien de la gestation. Cependant, on sait très peu sur la production de ces hormones et les principaux facteurs des voies intracellulaires impliqués dans le processus de stéroïdogenèse dans le placenta bovin pendant les stades initiaux et plus avancés de la gestation. Par ailleurs, certaines anomalies du placenta chez les bovins suite à une mauvaise production de stéroïdes n'ont pas encore été démontrées. Les objectifs de cette thèse étaient donc de : 1) déterminer la présence et la localisation des principales protéines stéroïdiennes dans le placenta de bovins provenant de gestations de 50 à 120 jours, 2) comparer l'expression placentaire d'une série de gènes et de protéines stéroïdiennes entre une gestation impliquant un transfert de noyaux de cellules somatiques (SCNT) et une gestation non-clonale; 3) étudier l'impact des hormones trophiques et des seconds messagers sur la stéroïdogenèse dans le placenta bovin à 140 +10 jours de gestation. L’utilisation de techniques d’immunohistochimie, d’immunobuvardage et de PCR quantitatif nous a permis d’évaluer la présence d'un large éventail de gènes stéroïdiens (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 et SCARB1) qui participent au transport du cholestérol et dans la production de différents types de stéroïdes. Dans cette thèse, nous avons démontré la capacité du placenta bovin d’initier la stéroïdogenèse au début de la gestation et nous avons également déterminé les principales cellules impliquées dans ce processus. Nous avons constaté que les tissus maternels expriment les principaux marqueurs de stéroïdogenèse suggérant une plus grande capacité stéroïdogénique que les tissus fœtaux. En outre, un modèle d'expression des protéines complémentaires stéroïdogéniques entre la caroncule et le cotylédon a été observé, indiquant que la stéroïdogenèse placentaire exige une communication cellule à cellule entre les cellules de la mère et du fœtus. Après avoir démontré les principales cellules impliquées dans la synthèse des hormones stéroïdiennes dans le placenta bovin en début de gestation, nous avons ensuite étudié les modifications possibles de la stéroïdogenèse dans les tissus SCNT cotylédonaires à 40 jours de gestation. Nous avons identifié d'importantes modifications dans l'expression des gènes STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, et SULT1E1. Conséquemment, nous postulons que l'expression réduite des gènes stéroïdiens peut provoquer une insuffisance de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes, ce qui pourrait contribuer à un développement anormal du placenta et du fœtus dans les gestations SCNT à court ou long terme. Finalement, nous avons développé un modèle efficace de culture d’explants de placentome qui nous a permis d'explorer les mécanismes sous-jacents spécifiques à la stéroïdogenèse placentaire. Nous avons exploré l'effet stimulant des hormones trophiques et différents messagers secondaires sur l'expression de différentes protéines stéroïdogéniques ainsi que le taux de progestérone (P4) dans les explants de placentome. En utilisant les techniques de RIA et de PCR quantitatif, nous avons constaté que même si les analogues de l'hormone lutéinisante (hCG) ont un effet stimulant sur plusieurs gènes stéroïdiens, le calcium ionophore est le principal modulateur dans la synthèse de la P4. Ces résultats suggèrent que dans le placenta bovin, la synthèse de la P4 est modulée principalement par l'afflux de calcium intracellulaire, et apparemment les nucléotides cycliques ne semblent pas contrôler ce processus. En conclusion, cette étude contribue de manière significative à une meilleure compréhension des mécanismes d'entraînement de la synthèse des stéroïdes placentaires au début de la gestation et permet aussi d’apporter de nouveaux éclairages sur l'importance des stéroïdes placentaires dans la régulation du développement du placenta et du fœtus.

Effects of hypothermia on brain glucose metabolism in acute liver failure: a H/C-nuclear magnetic resonance study.

Mild hypothermia has a protective effect on brain edema and encephalopathy in both experimental and human acute liver failure. The goals of the present study were to examine the effects of mild hypothermia (35°C) on brain metabolic pathways using combined 1H and 13C-Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy, a technique which allows the study not only of metabolite concentrations but also their de novo synthesis via cell-specific pathways in the brain. :1H and 13C NMR spectroscopy using [1-13C] glucose was performed on extracts of frontal cortex obtained from groups of rats with acute liver failure induced by hepatic devascularization whose body temperature was maintained either at 37°C (normothermic) or 35°C (hypothermic), and appropriate sham-operated controls. At coma stages of encephalopathy in the normothermic acute liver failure animals, glutamine concentrations in frontal cortex increased 3.5-fold compared to sham-operated controls (P < 0.001). Comparable increases of brain glutamine were observed in hypothermic animals despite the absence of severe encephalopathy (coma). Brain glutamate and aspartate concentrations were respectively decreased to 60.9% ± 7.7% and 42.2% ± 5.9% (P < 0.01) in normothermic animals with acute liver failure compared to control and were restored to normal values by mild hypothermia. Concentrations of lactate and alanine in frontal cortex were increased to 169.2% ± 15.6% and 267.3% ± 34.0% (P < 0.01) respectively in normothermic rats compared to controls. Furthermore, de novo synthesis of lactate and alanine increased to 446.5% ± 48.7% and 707.9% ± 65.7% (P < 0.001), of control respectively, resulting in increased fractional 13C-enrichments in these cytosolic metabolites. Again, these changes of lactate and alanine concentrations were prevented by mild hypothermia. Mild hypothermia (35°C) prevents the encephalopathy and brain edema resulting from hepatic devascularization, selectively normalizes lactate and alanine synthesis from glucose, and prevents the impairment of oxidative metabolism associated with this model of ALF, but has no significant effect on brain glutamine. These findings suggest that a deficit in brain glucose metabolism rather than glutamine accumulation is the major cause of the cerebral complications of acute liver failure.

The orphan nuclear receptor, liver receptor homolog-1 (LRH-1, NR5A2) regulates decidualization

La période de réceptivité endométriale chez l’humain coïncide avec la différentiation des cellules stromales de l’endomètre en cellules hautement spécifiques, les cellules déciduales, durant le processus dit de décidualisation. Or, on sait qu’une transformation anormale des cellules endométriales peut être à l’origine de pertes récurrentes de grossesses. LRH-1 est un récepteur nucléaire orphelin et un facteur de transcription régulant de nombreux évènements relatif à la reproduction et comme tout récepteur, son activation promouvoit l’activité transcriptionnelle de ses gènes cibles. Nous avons déjà montré que LRH-1 et son activité sont essentiels pour la décidualisation au niveau de l’utérus chez la souris et nous savons qu’il est présent dans l’utérus chez l’humain au moment de la phase de prolifération mais aussi de sécrétion du cycle menstruel, et que son expression augmente dans des conditions de décidualisation in vitro. Notre hypothèse est alors la suivante : LRH-1 est indispensable à la décidualisation du stroma endométrial, agissant par le biais de la régulation transcriptionnelle de gènes requis pour la transformation de cellules stromales en cellules déciduales. Afin d’explorer le mécanisme moléculaire impliqué dans la régulation transcriptionnelle effectuée par l’intermédiaire de ce récepteur, nous avons mis en place un modèle de décidualisation in vitro utilisant une lignée de cellules stromales de l’endomètre, cellules humaines et immortelles (hESC). Notre modèle de surexpression développé en transfectant les dites cellules avec un plasmide exprimant LRH-1, résulte en l’augmentation, d’un facteur 5, de l’abondance du transcriptome de gènes marqueurs de la décidualisation que sont la prolactine (PRL) et l’insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). En outre, la sous-régulation de ce récepteur par l’intermédiaire de petits ARN interférents (shRNA) abolit la réaction déciduale, d’un point de vue morphologique mais aussi en terme d’expression des deux gènes marqueurs cités ci-dessus. Une analyse par Chromatin ImmunoPrécipitation (ou ChIP) a démontré que LRH-1 se lie à des régions génomiques se trouvant en aval de certains gènes importants pour la décidualisation comme PRL, WNT 4, WNT 5, CDKN1A ou encore IL-24, et dans chacun de ces cas cités, cette capacité de liaison augmente dans le cadre de la décidualisation in vitro. Par ailleurs, des études structurelles ont identifié les phospholipides comme des ligands potentiels pour LRH-1. Nous avons donc choisi d’orienter notre travail de façon à explorer les effets sur les ligands liés à LRH-1 de traitements impliquant des agonistes et antagonistes à notre récepteur nucléaire. Les analyses par q-PCR et Western blot ont montré que la modulation de l’activité de LRH-1 par ses ligands influait aussi sur la réaction déciduale. Enfin, des études récentes de Salker et al (Salker, Teklenburg et al. 2010) ont mis en évidence que les cellules stromales humaines décidualisées sont de véritables biocapteurs de la qualité embryonnaire et qu’elles ont la capacité de migrer en direction de l’embryon. La série d’expériences que nous avons réalisée à l’aide de cellules hESC placées en co-culture avec des embryons de souris confirme que la migration cellulaire est bien dirigée vers les embryons. Cette propriété quant à l’orientation de la migration cellulaire est notoirement diminuée dans le cas où l’expression de LRH-1 est déplétée par shRNA dans les hESC. Nos données prouvent donc que LRH-1 régule non seulement la transcription d’un ensemble de gènes impliqués dans le processus de décidualisation mais agit aussi sur la motilité directionnelle de ces cellules hESC décidualisées in vitro.

Patient-specific model of a scoliotic torso for surgical planning

A method for the construction of a patient-specific model of a scoliotic torso for surgical planning via inter- patient registration is presented. Magnetic Resonance Images (MRI) of a generic model are registered to surface topography (TP) and X-ray data of a test patient. A partial model is first obtained via thin-plate spline registration between TP and X-ray data of the test patient. The MRIs from the generic model are then fit into the test patient using articulated model registration between the vertebrae of the generic model’s MRIs in prone position and the test patient’s X-rays in standing position. A non-rigid deformation of the soft tissues is performed using a modified thin-plate spline constrained to maintain bone rigidity and to fit in the space between the vertebrae and the surface of the torso. Results show average Dice values of 0.975 ± 0.012 between the MRIs following inter-patient registration and the surface topography of the test patient, which is comparable to the average value of 0.976 ± 0.009 previously obtained following intra-patient registration. The results also show a significant improvement compared to rigid inter-patient registration. Future work includes validating the method on a larger cohort of patients and incorporating soft tissue stiffness constraints. The method developed can be used to obtain a geometric model of a patient including bone structures, soft tissues and the surface of the torso which can be incorporated in a surgical simulator in order to better predict the outcome of scoliosis surgery, even if MRI data cannot be acquired for the patient.