Inhibitory Killer Immunoglobulin-like receptors to self HLA-B and HLA-C ligands contribute differentially to Natural Killer cell functional potential in HIV infected Slow Progressors

Ce manuscrit est une pré-publication d'un article paru dans Clinical Immunology 2012; 143(3): 246-255 url: http://www.journals.elsevier.com/clinical-immunology/

Études sur la dérégulation des cytokines et des cellules Natural Killer chez les patients infectés par le VIH-1

La prolifération, la différenciation ainsi que les fonctions des cellules du système immunitaire sont contrôlées en partie par les cytokines. Lors de l’infection par le VIH-1, les défauts observés dans les fonctions, la maintenance, ainsi que la consistance des cellules du système immunitaire sont en large partie attribués à une production altérée des cytokines et à un manque d’efficacité au niveau de leurs effets biologiques. Durant ces études, nous nous sommes intéréssés à la régulation et aux fonctions de deux cytokines qui sont l’IL-18 et l’IL-21. Nous avons observé une corrélation inversée significative entre les concentrations sériques d’IL-18 et le nombre des cellules NK chez les patients infectés par le VIH-1. Nos expériences in vitro ont démontré que cette cytokine induit l’apoptose des cellules NK primaires et que cette mort peut être inhibée par des anticorps neutralisants spécifiques pour FasL et TNF-α. Cette mort cellulaire est due à l’expression de FasL sur les cellules NK et à la production de TNF-α par ces cellules. L’IL-18 augmente aussi la susceptibilité à la mort des cellules NK par un stimulus pro-apoptotique, en diminuant l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL. Nous démontrons aussi que, contrairement à l’IL-18, les niveaux d’IL-18BP sont plus faibles dans les sérum de patients infectés. Ceci résulte sur une production non coordonnée de ces deux facteurs, aboutissant à des niveaux élevés d’IL-18 libre et biologiquement active chez les patients infectés. L’infection de macrophages in vitro induit la production d’IL-18 et réduit celle d’IL-18BP. De plus, l’IL-10 et le TGF-β, dont les concentrations sont élevées chez les patients infectés, réduisent la production d’IL-18BP par les macrophages in vitro. Finalement, nous démontrons que l’IL-18 augmente la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Les niveaux élevés d’IL-18 libres et biologiquement actives chez les patients infectés contribuent donc à l’immuno-pathogénèse induite par le VIH-1 en perturbant l’homéostasie des cellules NK ainsi qu’en augmentant la réplication du virus chez les patients. Ces études suggèrent donc la neutralisation des effets néfastes de l’IL-18 en utilisant son inhibiteur naturel soit de l’IL-18BP exogène. Ceci permettrait de moduler l’activité de l’IL-18 in vivo à des niveaux souhaitables. L’IL-21 joue un rôle clef dans le contrôle des infections virales chroniques. Lors de ces études, nous avons déterminé la dynamique de la production d’IL-21 lors de l’infection par le VIH-1 et sa conséquence sur la survie des cellules T CD4+ et la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1. Nous avons démontré que sa production est compromise tôt au cours de l’infection et que les concentrations d’IL-21 corrèlent avec le compte de cellules T CD4+ chez les personnes infectées. Nos études ont démontré que le traitement antirétroviral restaure partiellement la production d’IL-21. De plus, l’infection par le VIH-1 de cellules T CD4+ humaines inhibe sa production en réduisant l’expression du facteur de transcription c-Maf. Nous avons aussi démontré que la fréquence des cellules T CD4+ spécifiques au VIH-1 qui produisent de l’IL-21 est réduite chez les patients virémiques. Selon nos résultats, l’IL-21 empêche l’apoptose spontanée des cellules T CD4+ de patients infectés et l’absence d’IL-21 réduit la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1 chez ces patients. Nos résultats démontrent que l'IL-21R est exprimé de façon égale sur tous les sous-types de cellules NK chez les donneurs sains et chez les patients infectés. L’IL-21 active les protéines STAT-3, MAPK et Akt afin d'augmenter les fonctions effectrices des cellules NK. L'activation de STAT-3 joue un rôle clef dans ces fonctions avec ou sans un traitement avec de l'IL-21. L'IL-21 augmente l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, augmente la viabilité des cellules NK, mais ne possède aucun effet sur leur prolifération. Nous démontrons de plus que l'IL-21 augmente l'ADCC, les fonctions sécrétrices et cytotoxiques ainsi que la viabilité des cellules NK provenant de patients chroniquement infectés par le VIH-1. De plus, cette cytokine semble présenter ces effets sans augmenter en contrepartie la réplication du VIH-1. Elle permet donc d'inhiber la réplication virale lors de co-cultures autologues de cellules NK avec des cellules T CD4+ infectées d'une manière dépendante à l'expression de perforine et à l'utilisation de la protéine LFA-1. Les niveaux d’IL-21 pourraient donc servir de marqueurs biologiques pour accompagner les informations sur le taux de cellules T CD4+ circulantes en nous donnant des informations sur l’état de fonctionnalité de ce compartiment cellulaire. De plus, ces résultats suggèrent l’utilisation de cette cytokine en tant qu’agent immunothérapeutique pour restaurer les niveaux normaux d’IL-21 et augmenter la réponse antivirale chez les patients infectés par le VIH-1.

Increased Degranulation of Natural Killer Cells during Acute HCV Correlates with the Magnitude of Virus-specific T cell Responses

Ce manuscrit est une pré-publication d'un article paru dans Journal of Hepatology 2010; 53(5): 805-816.

Nouvelle approche immunothérapeutique afin de traiter le neuroblastome réfractaire chez l’enfant

Malgré plusieurs chimiothérapies suivies d’une transplantation et d’une immunothérapie, 40% des patients avec un neuroblastome (NB) à haut risque subissent une progression de la maladie ou une rechute. L’échec de ces traitements est attribué à la présence de cellules initiatrices de tumeur (TIC) qui expriment le marqueur CD133 et qui sont souvent résistantes aux agents chimiothérapeutiques. Les cellules Natural Killer (NK), qui possèdent un effet anti-tumoral, peuvent être utilisées dans le cadre du développement de nouvelles approches immuno-thérapeutiques. Nous posons l’hypothèse que les cellules NK activées éliminent efficacement les TIC et contribuent à la réduction des risques de rechute. De plus, il est possible d’augmenter l’effet anti-tumoral des cellules NK contre le NB. L’activité cytotoxique des cellules NK est augmentée par des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) activées. A la suite de la stimulation de leurs récepteurs Toll-like les pDC produisent de grandes quantités d'interféron-alpha (IFN-α). Nous avons étudié les propriétés lytiques des cellules NK contre des lignées cellulaires de NB à la suite de leur activation par l’IFN-α ou des pDC activées. Nos résultats révèlent une augmentation de l’activité cytolytique des cellules NK contre ces lignées en réponse à une stimulation par les pDC activées. De plus, les cellules de NB CD133+ ou celles résistantes à l’immunothérapie dirigée contre le GD2 sont sensibles à la lyse médiée par les cellules NK stimulées par les pDC. Nous avons examiné les mécanismes cellulaires impliqués dans la lyse des cellules de NB. Nous montrons que cette cytotoxicité est médiée en partie par TRAIL induisant l'apoptose et en partie par la libération des granules cytotoxiques. Ainsi, ces résultats permettent de proposer une nouvelle approche immuno-thérapeutique complémentaire au traitement par l’anticorps anti-GD2 pour les patients atteints de NB à haut risque.

HIV-1 Vpr up-regulates expression of ligands for the activating NKG2D receptor and promotes NK cell-mediated killing

HIV upregulates cell-surface expression of specific ligands for the activating NKG2D receptor, including ULBP-1, -2, -3, but not MICA or MICB, in infected cells both in vitro and in vivo. However, the viral factor(s) involved in NKG2D ligand expression still remains undefined. HIV-1 Vpr activates the DNA damage/stress-sensing ATR kinase and promotes G2 cell-cycle arrest, conditions known to upregulate NKG2D ligands. We report here that HIV-1 selectively induces cell-surface expression of ULBP-2 in primary CD4+ T-lymphocytes by a process that is Vpr-dependent. Importantly, Vpr enhanced the susceptibility of HIV-1-infected cells to NK cell-mediated killing. Strikingly, Vpr alone was sufficient to upregulate expression of all NKG2D ligands and thus promoted efficient NKG2D-dependent NK cell-mediated killing. Delivery of virion-associated Vpr via defective HIV-1 particles induced analogous biological effects in non-infected target cells, suggesting that Vpr may act similarly beyond infected cells. All these activities relied on Vpr ability to activate the ATR-mediated DNA damage/stress checkpoint. Overall, these results indicate that Vpr is a key determinant responsible for HIV-1-induced upregulation of NKG2D ligands and further suggest an immunomodulatory role for Vpr that may not only contribute to HIV-1-induced CD4+ T-lymphocyte depletion but may also take part in HIV-1-induced NK cell dysfunction.

Études sur le rôle d’IL-18 dans l’immunopathogénèse du SIDA

Le virus de l’immunodéficience humaine ou VIH est l’agent qui cause le SIDA. Le VIH donne lieu à une dérégulation dans la production de certaines cytokines qui ont un rôle immunologique très important chez les patients infectés. L’IL-18, autrement nommé facteur inducteur d’IFN-γ, est une cytokine pro-inflammatoire qui affecte le système immunitaire de façon importante. Son activité est régulée par l’"IL-18 Binding Protein" (IL-18BP), une autre cytokine qui se lie avec l’IL-18 et inhibe son activité biologique. Des études ultérieures ont montré des niveaux élevés d’Il-18 chez les patients infectés par le VIH par rapport aux personnes saines. Cependant, aucune étude n’a été réalisée concernant la production d’IL-18BP chez ces patients. Due à sa relevance dans la régulation de l’IL-18, nous avons étudié l’effet de l’infection par le VIH sur l’équilibre entre ces deux facteurs et l’impact de cet équilibre sur l’homéostasie des cellules NK. Nous avons mesuré les taux de l’IL-18 et de l’IL-18BP circulantes dans les sérums des patients infectés par le VIH en les comparants avec le même nombre de personnes saines et séronégatives. Nous avons aussi déterminé le nombre total des différents sous-types de cellules NK et analysé l’activité des cellules NK (Natural Killer). Finalement nous avons cherché à déterminer si l’IL-18 pouvait induire l’apoptose des cellules NK en activant l’expression de Fas ligand. Nos résultats nous démontrent que les patients infectés par le VIH ont trois fois plus d’IL-18 que les donneurs sains. Cependant les niveaux d’IL-18BP sont plus bas chez les patients infectés comparés aux donneurs sains. Alors, le ratio IL-18/IL-18BP est augmenté chez les patients infectés, ce qui entraîne une grande quantité d’IL-18 libre et biologiquement active circulante dans leur organisme. Nos études démontrent que chez ces patients, les concentrations d’IL-18 sont en corrélation négative avec l’activité cytotoxique de leurs cellules NK. Nos études in vitro démontrent que le traitement des cellules NK par l’IL-18 induit de façon fratricide leur apoptose en augmentant l’expression de Fas ligand. Finalement, cette production non coordonnée de ces deux facteurs pourrait contribuer à une immunopathologie induite par l’IL-18 en entraînant une apoptose fratricide des cellules NK qui possèdent un rôle important dans la réponse antivirale. Le dérèglement de l’homéostasie des cellules NK pourrait donc contribuer à la pathogenèse induite par le VIH.

Définition des interactions entre l’immunité innée et adaptative pendant l’infection aiguë par le virus de l’hépatite C (VHC)

La majorité des individus exposés au virus de l’hépatite C (VHC) développent une infection chronique. Une réponse immunitaire adaptative forte et soutenue est associée avec la guérison spontanée du VHC, mais les mécanismes sous-jacents demeurent mal définis. Le rôle des cellules NK et des cellules dendritiques (DC) dans la guérison spontanée du VHC est encore méconnu. Les cellules NK sont la population effectrice la plus importante de l’immunité innée car elles tuent les cellules infectées et sécrètent diverses cytokines. Les DC reconnaissent des agents infectieux et elles sont les premières à initier et réguler l’immunité adaptative. Les cellules NK et les DC interagissent également entre elles afin de réguler l’immunité innée et adaptative. L’hypothèse du projet de doctorat est que l'activité des cellules NK pendant la phase aiguë de l'infection par le VHC module la fonction des DC afin que ces dernières puissent générer une réponse immunitaire adaptative capable d'éliminer le VHC. Le premier objectif était d’établir une corrélation entre l'activité des cellules NK et l'évolution de l'infection au VHC. Nous avons observé une augmentation de la cytotoxicité, mais une diminution de la sécrétion de cytokines par les cellules NK chez les patients chroniques et qui ont résolu spontanément pendant la phase aiguë en comparaison aux contrôles non infectés, démontrant alors une dissociation entre ces deux fonctions. Nos résultats suggèrent que les cellules NK sont activées pendant la phase aiguë indépendamment de l’évolution de l’infection. Le deuxième objectif était d’établir une corrélation entre le phénotype et la fonction des DC, et l'évolution de l'infection. Nous avons d’abord observé que les DC plasmacytoïdes de tous les patients infectés ont un phénotype plus immature que les contrôles, et que ce phénotype est plus prononcé chez les patients ayant résolu spontanément. De plus, en réponse à des stimulations, nous avons observé que pendant la phase aiguë précoce, les DC myéloïdes (mDC) de tous les patients infectés indépendamment de l’évolution de l’infection produisent davantage de cytokines en comparaison aux contrôles. Cependant, cette hyperréactivité n’est pas soutenue au cours de l’évolution chronique. Le troisième objectif était d’établir une corrélation entre les interactions NK/DC et l’évolution de l’infection. Nous avons étudié la capacité des cellules NK à lyser les DC potentiellement tolérogéniques, ainsi que la capacité des DC matures à activer les cellules NK, et nous avons observé aucune différence entre les patients infectés et les contrôles. Finalement, nous avons démontré pour la première fois la capacité des DC immatures à inhiber la fonction des cellules NK. En conclusion, nous avons démontré que les cellules NK sont activées pendant la phase aiguë de l’infection par le VHC indépendamment de l’évolution de l’infection. De plus, la capacité des cellules NK à éliminer les DC potentiellement tolérogéniques est intacte. Finalement, les mDC sont hyperréactives pendant la phase aiguë de l’infection, mais cette hyperréactivité n’est pas soutenue avec la persistance de l’infection. Cette perte d’hyperréactivité des mDC ne semble pas affecter la capacité des DC à activer les cellules NK, mais elle pourrait jouer un rôle dans l’inefficacité de l’immunité adaptative à éliminer le VHC.

Étude génétique et fonctionnelle des Interferon-producing Killer Dendritic Cells

L’idée qu’une cellule puisse effectuer la cytolyse de cellules transformées, comme une cellule Natural Killer (NK), tout en ayant la capacité de présenter des antigènes, comme une cellule dendritique (DC), peut sembler fantaisiste. Cependant, de telles cellules furent bel et bien identifiées chez la souris en 2006. Ces cellules, nommées Interferon-producing Killer Dendritic Cells (IKDC), furent l’objet d’une caractérisation extensive qui révéla leur énorme potentiel immunologique. La combinaison de fonctions associées à des cellules NK et à des DC a doté les IKDC d’un pouvoir antitumoral remarquable. D’ailleurs, il a été démontré que les IKDC sont plus efficaces que les cellules NK pour limiter la croissance tumorale. Ainsi, suite à leur découverte, les IKDC ont suscité beaucoup d’intérêt. Cependant, une controverse émergea sur la nature des IKDC. Plusieurs groupes indépendants tentèrent de reproduire les expériences attestant les fonctions de DC des IKDC, sans y parvenir. De plus, des études additionnelles révélèrent que les IKDC possèdent des similitudes très importantes avec les cellules NK. Ces observations ont mené la communauté scientifique à suggérer que les IKDC sont des cellules NK en état d’activation (aNK). Malgré cette controverse, les caractéristiques antitumorales des IKDC sont si uniques et considérables qu’il est primordial de poursuivre l’étude de ces cellules. Pour y arriver, il est essentiel de déterminer la nature des IKDC et de mettre fin à ce débat. Par la suite, il sera important d’identifier des façons de cibler spécifiquement les IKDC pour permettre leur usage dans le cadre de thérapies antitumorales. Ainsi, l’objectif de cette thèse est de définir l’identité des IKDC, puis de déterminer les facteurs génétiques responsables de la régulation de ces cellules. Nous avons démontré que les IKDC ne sont pas des cellules aNK, contrairement à ce qui avait été suggéré. Nous avons constaté que les IKDC prolifèrent activement et possèdent un phénotype unique, des caractéristiques associées à des cellules NK très immatures. Afin de déterminer si les IKDC peuvent acquérir un phénotype mature, nous avons effectué des expériences de transfert adoptif. Suite à leur injection in vivo, les IKDC acquièrent un phénotype de cellules matures, mais étonnamment, elles se différencient aussi en cellules NK. Ainsi, nous avons révélé que les IKDC sont un intermédiaire dans la différenciation des cellules NK. En parallèle, nous avons démontré que la proportion d’IKDC varie grandement entre des souris de fond génétique différent, indiquant que des facteurs génétiques sont impliqués dans la régulation de ces cellules. Nous avons alors effectué une analyse génétique qui a révélé que les IKDC sont régulées par des facteurs génétiques compris dans une région distale du chromosome 7. Les résultats présentés dans cette thèse constituent une avancée importante pour la recherche sur les IKDC. Ils ont permis de définir la nature des IKDC et d’identifier un intervalle génétique impliqué dans la régulation de ces cellules. Ces découvertes sont des connaissances précieuses pour l’identification des IKDC chez l’Homme et la création de nouvelles thérapies dans la lutte contre le cancer.

Rôle essentiel des cellules dendritiques dans l'immunité innée face a des streptocoques encapsulés

Streptococcus du Groupe B (GBS) et Streptococcus suis sont deux pathogènes encapsulés qui induisent des pathologies similaires dont la méningite et la septicémie chez les animaux et/ou les humains. Les sérotypes III et V du GBS et les sérotypes 2 et 14 du S. suis (utilisés dans cette étude) sont parmi les plus prévalents et/ou les plus virulents. La capsule polysaccharidique (CPS) définit le sérotype et est considérée comme un facteur de virulence essentiel pour les deux espèces bactériennes. Malgré que plusieurs études aient été réalisées au niveau des interactions entre ces streptocoques et les cellules de l’immunité innée, aucune information n’est disponible sur la régulation de la réponse immunitaire contre ces pathogènes par les cellules dendritiques (DCs) et leur interactions avec d’autres cellules, notamment les cellules ‘natural killer’ (NK). Dans cette étude, différentes approches (in vitro, ex vivo et in vivo) chez la souris ont été développées pour caractériser les interactions entre les DCs, les cellules NK et GBS ou S. suis. L’utilisation de mutants non encapsulés a permis d’évaluer l’importance de la CPS dans ces interactions. Les résultats in vitro avec les DCs infectées par GBS ou S. suis ont démontré que ces deux pathogènes interagissent différemment avec ces cellules. GBS est grandement internalisé par les DCs, et ce, via de multiples mécanismes impliquant notamment les radeaux lipidiques et la clathrine. Le mécanisme d’endocytose utilisé aurait un effet sur la capacité du GBS à survivre intracellulairement. Quant au S. suis, ce dernier est très faiblement internalisé et, si le cas, rapidement éliminé à l’intérieur des DCs. GBS et S. suis activent les DCs via différents récepteurs et favorisent la production de cytokines et chimiokines ainsi que l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation. Cette activation permet la production d’interferon-gamma (IFN-y) par les cellules NK. Cependant, GBS semble plus efficient à activer les DCs, et par conséquent, les cellules NK que S. suis. La production d’IFN-y, en réponse à la stimulation bactérienne, est principalement assurée par un contact direct entre les DCs et les cellules NK et ne dépend qu’en partie de facteurs solubles. De plus, nos résultats in vivo ont démontré que ces deux streptocoques induisent rapidement la libération d'IFN-y par les cellules NK lors de la phase aiguë de l'infection. Ceci suggère que les interactions entre les DCs et les cellules NK pourraient jouer un rôle dans le développement d’une réponse immune T auxiliaire de type 1 (T ‘helper’ 1 en anglais; Th1). Cependant, la capacité de S. suis à activer la réponse immunitaire in vivo est également plus faible que celle observée pour GBS. En effet, les CPSs de GBS et de S. suis jouent des rôles différents dans cette réponse. La CPS de S. suis empêche une activation optimale des DCs et des cellules NK alors que c’est l’opposé pour la CPS de GBS, indépendamment du sérotype évalué. En résumé, cette étude adresse pour la première fois la contribution des DCs et des cellules NK dans la réponse immunitaire innée lors d’une infection à GBS ou à S. suis et, par extension, dans le développement d’une réponse Th1. Nos résultats renforcent davantage le rôle central des DCs dans le contrôle efficace des infections causées par des bactéries encapsulées.

Innate immunity genes as determinants of resistance/susceptibility to human disease : studies in leukemia patients

La leucémie lymphoblastique aiguë des cellules Pré-B (B-ALL) reste le type de cancer le plus souvent diagnostiqué chez les enfants. Des études ont montré que des déterminants génétiques jouent un rôle important dans la susceptibilité/résistance au développement de ce cancer. À cet égard, les gènes Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor (KIR) sont d'une importance particulière. Ces gènes sont fortement polymorphiques et codent pour des récepteurs qui contrôlent l’activité fonctionnelle des cellules Natural Killer (NK). Notre hypothèse est que les gènes activateurs des KIR s’associent avec la résistance innée pour développer la B-ALL. Afin d'évaluer cette hypothèse, nous avons entrepris une étude de cas-contrôles chez des enfants canadiens-français dans laquelle nous avons utilisé l'ADN génomique de 100 patients atteints de B-ALL ainsi que l’ADN de 245 individus sains. La présence ou l'absence de chaque gène KIR a été détectée par PCR en utilisant des amorces de séquences spécifiques. Nous avons trouvé que la présence des gènes KIR activateurs est significativement diminuée chez les enfants leucémiques par rapport aux témoins. En outre, le nombre de ces gènes a aussi montré une association significative linéaire avec la résistance au développement d’une B-ALL. Cela suggère des effets additifs de ces gènes permettant de conférer une protection contre ce cancer. Ces résultats pourraient être utiles afin de déceler de façon précoce les enfants ayant un risque de développer cette leucémie. Enfin, des stratégies thérapeutiques basées sur les récepteurs KIR pourraient être envisagées et s'avérer utiles concernant le traitement de ce cancer chez les enfants.

Les cellules dendritiques plasmacytoides dans le sang de cordon et après greffe de sang de cordon

La greffe de sang de cordon est de plus en plus utilisée et a permis de traiter avec succès chez l’enfant des déficits immunitaires ainsi que des hémopathies malignes comme les leucémies. Malgré d’importants avantages tels que l’absence de risque pour le donneur ou la plus faible incidence de maladie du greffon contre l’hôte (GvHD), utiliser le sang de cordon comporte certains inconvénients. En effet, une reconstitution immunitaire retardée, des infections opportunistes en plus grand nombre et un risque de rechute sont des complications qui peuvent survenir et engendrer un risque pour le pronostic vital du patient. Par conséquent, de nouvelles stratégies d’immunothérapies doivent être envisagées. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes particulièrement intéressés aux cellules dendritiques plasmacytoides (pDC) dont les fonctions sont importantes pour l’initiation des réponses immunitaires innée et adaptative et particulièrement pour leur capacité à activer les cellules NK. Afin d’élucider le rôle et l’impact de ces cellules dans les greffes de sang de cordon, le nombre et la fonction des pDC et des NK a été suivi longitudinalement chez des patients ayant subi une greffe de sang de cordon comparativement à des patients transplantés avec de la moelle osseuse. Nous avons ainsi démontré que les pDC et les NK apparaissent précocement suite à une greffe de sang de cordon et que ces cellules sont fonctionnelles. Ces résultats mettent donc en lumière que ces cellules pourraient être de bons outils pour l’établissement d’une immunothérapie après greffe de sang de cordon. De plus, la caractérisation fonctionnelle des pDC du greffon de sang de cordon a permis de révéler une plus faible production d’IFN-α par les pDC, comparativement aux pDC de sang d’adulte. Cette différence pourrait jouer un rôle dans la plus faible incidence de GvHD après les greffes de sang de cordon. Dans le but de préciser les mécanismes moléculaires de régulation négative de la production d’IFN-α par les pDC de sang de cordon, nous avons étudié les protéines de la voie de signalisation TLR9-IRF7. L’expression similaire de l’ARN du TLR9, MyD88, IRAK1 et IRF7 contraste avec la plus faible expression des protéines correspondantes. De plus, l’expression des MicroARNs miR-146a et miR-155 est plus élevé dans les pDC de sang de cordon comparativement aux pDC de sang d’adultes. Ensemble, ces données pointent une régulation négative post-transcriptionnelle de la voie TLR9-IRF7 qui pourrait expliquer la plus faible production d’IFN-α des pDC du sang de cordon. L’ensemble des ces travaux suggère que les pDC pourraient représenter une cible de choix dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques dans les greffes de sang de cordon.

Melanosomal targeting sequences from gp100 are essential for MHC class II-restricted endogenous epitope presentation and mobilization to endosomal compartments

CD4+ T lymphocytes play an important role in CD8+ T cell-mediated responses against tumors. Considering that about 20% of melanomas express major histocompatibility complex (MHC) class II, it is plausible that concomitant antigenic presentation by MHC class I and class II complexes shapes positive (helper T cells) or negative (regulatory T cells) anti-tumor responses. Interestingly, gp100, a melanoma antigen, can be presented by both MHC class I and class II when expressed endogenously, suggesting that it can reach endosomal/MHC class II compartments (MIIC). Here, we demonstrated that the gp100 putative amino-terminal signal sequence and the last 70 residues in carboxy-terminus, are essential for MIIC localization and MHC class II presentation. Confocal microscopy analyses confirmed that gp100 was localized in LAMP-1+ endosomal/MIIC. Gp100-targeting sequences were characterized by deleting different sections in the carboxy-terminus (residues 590 to 661). Transfection in 293T cells, expressing MHC class I and class II molecules, revealed that specific deletions in carboxy-terminus resulted in decreased MHC class II presentation, without effects on MHC class I presentation, suggesting a role in MIIC trafficking for these deleted sections. Then, we used these gp100-targeting sequences to mobilize the green fluorescent protein (GFP) to endosomal compartments, and to allow MHC class II and class I presentation of minimal endogenous epitopes. Thus, we concluded that these specific sequences are MIIC targeting motifs. Consequently, these sequences could be included in expression cassettes for endogenously expressed tumor or viral antigens to promote MHC class II and class I presentation and optimize in vivo T cell responses, or as an in vitro tool for characterization of new MHC class II epitopes.

Caractérisation de DKK1 comme antigène tumoral et manipulation des lymphocytes T CD8 : utilisation de la voie de Wnt en immunothérapie du cancer

L’immunothérapie tumorale à médiation cellulaire est un traitement qui utilise le système immunitaire des patients afin d’induire une réponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette réponse est produite suite à la reconnaissance des antigènes par les T CD8+. Ces cibles sont appelées antigènes tumoraux (TAA) et définies comme des protéines exprimées par les cellules cancéreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifié Dickkopf-1 (DKK1), une protéine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothérapie à médiation cellulaire efficace requiert l’identification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothérapie pourrait également être améliorées par l’augmentation de la puissance d’action anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spécifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractérisation de l’expression de DKK1 dans les cancers communs et la détermination de son immunogénicité afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints d’un cancer commun, vers un phénotype moins différentié afin d’augmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractérisé l’expression de DKK1 dans le cancer du sein et dans d’autres cancers communs. Le profil d’expression de DKK1 a été étudié par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignées cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. L’expression de DKK1 a aussi été étudiée dans des échantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant d’un cancer du sein exprimaient DKK1. La moitié des tumeurs DKK1(+) était triple négative, donc pas de récepteurs d’œstrogène et de progestérone et était Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilités de traitements très restreintes). De plus, 50% des échantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectuées dans le cancer du poumon ont été, par la suite, corroborées par d'autres groupes qui ont montré une corrélation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Après avoir confirmée l’expression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons évalué l’immunogénicité de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectué des stimulations in vitro de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s d’un cancer du sein ou du poumon avec des peptides dérivés de DKK1 pouvant être présentés par les complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont été identifiés et isolés. Par essai multiplex et cytométrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalité d’un ces clones T CD8+ spécifiques à DKK1 a été étudiée et a révélée un profil effecteur, renforçant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans l’ensemble, les résultats obtenus dans cette première partie de thèse suggèrent une possible utilisation de DKK1 en immunothérapie contre les cancers communs, attribuable à son expression dans ces cancers et la possibilité de faire proliférer des T CD8+ effecteurs spécifiques à DKK1 à partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thèse, je décrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints d’un cancer commun, afin d’augmenter la force et la durée de leurs fonctions anti-tumorales. Il a été démontré que des lymphocytes moins différentiés sont capables d’une réponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons basé ce projet sur l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur conférer un phénotype moins différentié, partageant des caractéristiques de la cellule naïve et de la cellule mémoire. Des cultures de T CD8+, spécifiques à des antigènes viraux, en présence de l’inhibiteur ont permis d’augmenter la sécrétion d’interféron (IFN)- et leur activité cytotoxique. Ces résultats indiquent un effet de l’activation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportées pour la première fois chez les T CD8+ humains et suggèrent une nouvelle stratégie, applicables à l’immunothérapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activité anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont mené à la réalisation d’une étape très importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la démonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux dérivés d’organes importants. Ces travaux ont également mené à la démonstration de l’immunogénicité de DKK1, par l’identification d’un peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, l’étude de la polyfonctionnalité des T CD8+ spécifiques à DKK1 a révélée un profil effecteur favorable pour l’obtention d’une réponse anti-tumorale efficace. Ces découvertes pourraient servir à l’élaboration d’une stratégie d’immunothérapie à médiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, l’étude phénotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donné lieu à l’observation d’un phénotype encore jamais rapporté chez l’humain, conférant aux T CD8+ un aspect moins différentié avec des caractéristiques propre à un phénotype mémoire. Ces résultats sont pertinents dans l’amélioration de l’immunothérapie du cancer, passant par l’augmentation de la persistance des lymphocytes. En résumé, les résultats présentés dans cette thèse de doctorat fournissent des évidences indéniables quant à la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothérapie à médiation cellulaire des cancers communs. Ces résultats fournissent également des preuves quant à la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par l’activation de la voie de la voie de Wnt, afin de générer des lymphocytes médiateurs plus efficaces pour ce type de thérapie.

Étude du rôle de la protéine Vpr du VIH-1 dans la modulation de la réponse immunitaire

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une activation chronique du système immunitaire et par une réduction graduelle du nombre de lymphocytes TCD4+, qui contribuent à une détérioration lente du système immunitaire menant à la phase SIDA. Paradoxalement, ce sont majoritairement des lymphocytes T CD4+ non infectés qui sont détruits et la cause de ce phénomène reste encore inconnue. Certaines protéines virales, dont la protéine accessoire Vpr, sont soupçonnées de jouer un rôle dans ce processus. Synthétisée tardivement, Vpr est incorporée à l’intérieur des virions, en plus d’être relâchée sous forme soluble dans le milieu extracellulaire. La principale fonction biologique de Vpr est l’induction d’un arrêt de cycle en phase G2/M, via le recrutement du complexe d’ubiquitine E3 ligase CUL4A-DDB1VprBP et l’activation de la voie de dommage à l’ADN contrôlée par la kinase ATR. Une étude démontre que l’activation des voies de dommages à l’ADN conduit à l’expression de ligands du récepteur activateur NKG2D, exprimés par les cellules NK, déclenchant leurs fonctions cytolytiques. Chose intéressante, plusieurs études suggèrent que le VIH-1 régule positivement l’expression des ligands de NKG2D à la surface des lymphocytes T CD4+ infectés. Cependant, le facteur viral impliqué dans ce processus reste encore indéfini. Le but de cette thèse était d’évaluer le rôle de Vpr dans la modulation des fonctions cytolytiques des cellules NK et son implication potentielle dans la destruction des lymphocytes T CD4+. Nos travaux ont permis de démontrer que l’expression de Vpr, seule ou dans le contexte de l’infection, est suffisante afin d’augmenter spécifiquement l’expression du ligand de NKG2D, ULBP2, au niveau de lymphocytes T CD4+ primaires. Conséquemment, Vpr augmente ainsi la susceptibilité de ces cellules à une lyse par des cellules NK autologues. Nous démontrons que cette régulation positive d’ULBP2 repose sur la capacité de Vpr de recruter le complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP et l’activation de la voie de dommage à l’ADN ATR. Plus important encore, nous apportons des preuves que Vpr augmente également l’expression d’ULBP2 au niveau des cellules non infectées lors d’une infection de lymphocytes TCD4+ par le VIH-1. À cet effet, nous montrons que l’acheminement de Vpr au niveau de lymphocytes T CD4+ non infectés via des particules virales défectives est suffisant afin de réguler positivement ULBP2 et d’augmenter leur lyse par des cellules NK autologues. De plus, nous décrivons pour la première fois que Vpr, sous forme soluble, a la capacité d’induire des dommages à l’ADN et de réguler positivement ULBP2 suite à la transduction de différents types cellulaires, incluant des cellules T. Globalement, nos résultats démontrent que Vpr est un facteur viral clé impliqué dans la régulation positive des ligands de NKG2D induite par le VIH-1. Cette régulation positive d’ULBP2 pourrait alors contribuer à la destruction des lymphocytes T CD4+ infectés et non infectés via l’activation des fonctions cytolytiques des cellules NK. Une meilleure compréhension de la contribution de cette activité de Vpr dans la pathogenèse du VIH-1 a le potentiel de permettre le développement de nouvelles cibles ou stratégies thérapeutiques contre le VIH-1.

FosteraTM PRRS modified live vaccine efficacy against a Canadian heterologous virulent field strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV).

Vaccination is a useful option to control infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), and several modified live-PRRSV vaccines have been developed. These vaccines have shown some efficacy in reducing the incidence and severity of clinical disease as well as the duration of viremia and virus shedding but have failed to provide sterilizing immunity. The efficacy of modified live-virus (MLV) vaccines is greater against a homologous strain compared with heterologous PRRSV strains. The objective of this study was to evaluate the efficacy of Fostera PRRS MLV vaccine in protecting against challenge with a heterologous field strain widely circulating in the swine herds of eastern Canada. Forty-six piglets were divided into 4 groups: nonvaccinated-nonchallenged; nonvaccinated-challenged; vaccinated-challenged; and vaccinated-nonchallenged. The animals were vaccinated at 23 d of age with Fostera PRRS and challenged 23 d later with a heterologous field strain of PRRSV (FMV12-1425619). Overall, the vaccine showed some beneficial effects in the challenged animals by reducing the severity of clinical signs and the viral load. A significant difference between nonvaccinated and vaccinated animals was detected for some parameters starting 11 to 13 d after challenge, which suggested that the cell-mediated immune response or other delayed responses could be more important than pre-existing PRRSV antibodies in vaccinated animals within the context of protection against heterologous strains.