13 resultados para matrix metalloproteinase 2
em Université de Montréal, Canada
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Mmoire numris par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Affiliation: Dpartement de Mdecine, Facult de mdecine, Universit de Montral & Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Universit de Montral (CHUM), Hpital Notre-Dame du CHUM
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Le cheval est souvent victime de plaies traumatiques, dont la gurison est frquemment problmatique, et ce, principalement quand la plaie survient sur le membre. Il est courant de voir chez le cheval le dveloppement dun tissu de granulation exubrant ou bouton de chair , qui mne une cicatrisation excessive due la surproduction de tissu fibreux. Ce tissu cicatriciel, non pithlialis, est caractris par une occlusion au niveau de la microcirculation due lhypertrophie des cellules endothliales, qui laisse supposer la prsence dhypoxie tissulaire. Une hypoxie relative a effectivement t mesure par spectroscopie dans le proche infrarouge au niveau des plaies appendiculaires prdisposes au dveloppement de tissu de granulation exubrant, par rapport aux plaies corporelles. De plus, une tude thermographique a rvl un patron spatial similaire de la perfusion. Au niveau molculaire, la littrature rapporte que le facteur de transcription hypoxia inducible factor (HIF) est lorigine de plusieurs changements dans les niveaux dexpression de divers gnes rguls par lhypoxie. Lobjectif du prsent projet de recherche tait de dfinir la contribution de lhypoxie la gurison cutane chez le cheval. Le premier volet (in vivo) du projet visait mesurer lexpression protique temporelle du HIF1A dans des chantillons tissulaires en provenance de plaies cutanes gurissant normalement et dautres dveloppant une cicatrisation excessive, selon divers sites anatomiques (tronc, membre). Les rsultats obtenus suggrent que la mesure de HIF1A, dans les chantillons pluricellulaires de cette tude, reflte lpithlialisation de la plaie plutt que les niveaux doxygne tissulaire. En effet, le HIF1A semble rguler lhomostasie et la prolifration des kratinocytes. Le second volet (in vitro), consistait en la mise en culture de fibroblastes dermiques quins provenant du tronc ou du membre, en condition de normoxie ou dhypoxie ( 1% dO2 ou laide dun mimtique, le CoCl2) afin den tudier le comportement (capacits de prolifration et de synthse protique). Les rsultats obtenus soutiennent une contribution de lhypoxie la cicatrisation extensive chez le cheval puisque lhypoxie favorise la prolifration des fibroblastes en plus dencourager la synthse de collagne de type 1 et de diminuer la synthse de la mtalloprotinase de type 2. Les changements observs semblent dpendre de facteurs extrinsques (environnementaux) car les fibroblastes dermiques se comportent de faon similaire indpendamment de la provenance anatomique. En somme, les deux volets de ltude ont permis dlucider une part des mcanismes sous-jacents la formation du tissu de granulation exubrant lors de gurison cutane chez le cheval. La poursuite des recherches dans ce domaine mnera une meilleure comprhension de la pathologie et ainsi, permettra de dvelopper des mthodes de traitement spcifiques la condition.
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Le PCK3145 est un peptide de 15 acides amins inhibant la scrtion de MMP-9 et dmontrant une activit anti-tumorale contre le cancer de la prostate. Comme les cancers hmatologiques scrtent MMP-9, nous avons donc valu leffet du PCK3145 sur ces cancers. Nous avons dmontr que les lignes humaines de lymphome non- Hodgkinien (LNH) SR et de mylome multiple RPMI-8226 ainsi que la ligne murine de mastocytome P815 ont une prolifration rduite suite une exposition au PCK3145. Ce peptide diminue galement la clonognicit de ces cellules. In vivo, le PCK3145 diminue significativement la croissance des tumeurs sous-cutanes P815 comparativement au PBS (p<0.001) et aux peptides contrles ( scrambled peptide (p<0.05) et PCK5266 (p<0.01)). De plus, le traitement au PCK3145 diminue le nombre de mtastases au niveau du foie par rapports aux contrles (p<0.05). Les niveaux de MMP-9 dans le sang des souris traites au PCK3145 sont similaires ceux dans le sang des souris sans tumeur. Par contre, chez les souris recevant le PBS ou le scrambled peptide , les niveaux de MMP-9 taient significativement plus levs que dans les souris sans tumeur et les souris traites au PCK3145 (p<0.05). De surcrot, dans un modle de xnogreffe, le PCK3145 diminue significativement la croissance des lymphomes SR par rapport au PBS (p<0.01) et au scrambled peptide (p<0.001). Ces rsultats indiquent que le PCK3145 possde une activit anti-tumorale et pourrait reprsenter un agent intressant pour le traitement de plusieurs cancers hmatologiques.
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OBJECTIF: Rcemment, nous avons dmontr que la modification du collagne type II (Col II) par le 4-hydroxynonnal (HNE), un produit de la peroxydation lipidique, est augmente dans le cartilage arthrosique sans quon sache la signification de cette augmentation dans la pathogense de larthrose. Lobjectif de cette tude vise dmontrer que cette modification affecte linteraction chondrocytes/matrice extracellulaire (MEC) et en consquence induit des changements phnotypiques et fonctionnels de ces cellules. METHODES: Des plaques de culture ont t pralablement cotes avec du Col II puis traites avec du HNE (0.1-2 mM) except le puits contrle. Les chondrocytes ont t ensuite ensemencs puis incubs pendant 48 heures. La viabilit des cellules est value par le test MTT. Le Western blot est utilis pour mesurer lexpression des molcules dadhsion (lICAM-1 et lintgrine 11), de la cyclooxygenase-2 (COX-2), du Col II ainsi que la phosphorylation de la p38 MAPK, ERK1/2 et NF-B-p65. La RT-PCR en temps rel est utilise pour mesurer lexpression de lARNm de lICAM-1, des intgrines 11, de la COX-2 et de la mtalloprotinases-13 (MMP-13). La dtermination de lexpression de lICAM-1 la surface des cellules est ralise par cytomtrie de flux. Des kits commerciaux ont servi pour mesurer le niveau de la MMP-13, de la prostaglandine E2 (PGE2), de lactivit de la caspase-8 et de la phosphorylation de la p38 MAPK, ERK1/2 et NF-B-p65. RESULTATS: La modification du Col II par 0.2 mM HNE induit significativement lexpression des molcules dadhsion telles que lICAM-1 et lintgrine 11, de la MMP-13 sans avoir un effet sur la morphologie, la survie et le phnotype cellulaires. Nos rsultats montrent aussi une forte augmentation de la phosphorylation de la p38 MAPK, dERK1/2 et de NF-B-p65. Cependant, la modification du Col II par 2 mM HNE affecte la morphologie et la viabilit cellulaires et induit lactivit de la caspase-8. Elle inhibe fortement lexpression des integrines 11 et du Col II ainsi que la phosphorylation de lERK1/2 et de NF-B-p65, mais par contre, induit significativement la production de la COX-2 et son produit la PGE2 ainsi que la phosphorylation de la p38 MAPK. Fait intressant, le prtraitement des complexes HNE/Col II par 0.1 mM de carnosine empche les changements phnotypiques et fonctionnels des chondrocytes. CONCLUSION : Ces nouveaux rsultats suggrent le rle important de la modification du Col II par le HNE dans larthrose, en affectant le phnotype et le fonctionnement cellulaires des chondrocytes. La carnosine, par sa capacit de neutraliser le HNE, a rvl dtre un agent promoteur dans le traitement de larthrose.
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Ldme crbral est une complication associe lencphalopathie hpatique (EH) lors dune insuffisance hpatique chronique (cirrhose du foie). Prsentement, lorigine de sa pathogense, vasognique (rupture de la barrire hmato-encphalique (BHE)) ou cytotoxique (prise anormale dions), na pas encore t dtermine. Il a t dmontr que le co-transporteur Na-K-Cl (NKCC1) du ct luminal des microvaisseaux sanguins crbraux (CMV) joue un rle dans le dveloppement de ldme crbral dans des modles dischmie o la bumetanide, un inhibiteur de NKCC, attnue ldme crbral. Deux modles dEH ont t utiliss pour cette tude i) la ligature de la voie biliaire (BDL) qui prsente lhyperammonimie chronique, ldme crbral et le stress oxydatif systmique ; ii) lanastomose portocave (PCA) qui prsente de lhyperammonimie chronique seulement. Les buts du projet taient de: i) dfinir lorigine du dveloppement de ldme chez les rats BDL en tudiant lextravasation de macromolcules, les jonctions serres et lactivation des mtalloprotinases matricielles de la BHE; ii) observer les effets de lhyperammonimie chronique indpendamment sur la BHE chez les rats PCA; iii) valuer le rle de lhyperammonimie et du stress oxydatif et iv) tudier le rle du NKCC1 dans les CMV dans la pathogense de ldme crbral. Les rsultats du projet dmontrent que ldme est dorigine cytotoxique chez les rats BDL et que lintgrit de la BHE est conserve chez les rats PCA malgr lhyperammonimie. Lexpression gnique du NKCC1 est associe ldme mais pas son expression protique et sa phosphorylation. Enfin, ltude dmontre que lhyperammonimie et le stress oxydatif indpendant ne jouent pas un rle dans la pathogense de ldme mais suggre quils y aient un effet synergique.
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Ces travaux visent tendre les applications de la rsonance de plasmons de surface (SPR) Lobjectif est doffrir des outils diagnostics plus rapides, efficaces et simple dutilisation pour diagnostiquer ou effectuer le suivi de conditions cliniques. Pour se faire, un nouveau type dinstrumentation SPR bas sur lutilisation dun prisme dinversion (dove) a permis datteindre une limite de dtection (LOD) de 10-6 unit dindice de rfraction (RIU), une valeur comparable aux instruments commerciaux complexes tout en demeurant peu dispendieux, robuste et simple dutilisation. Les travaux prsents dans cet ouvrage visent, dans un second temps, rduire les interactions nonspcifiques (NSB) entre la surface des biocapteurs SPR et les composants de la matrice biologique complexe telles que: lurine, le lysat cellulaire, le srum et le sang. Ces dernires induisent des rponses empchant lutilisation de biocapteurs SPR en milieux complexes. Les acides amins (AA) offrent une grande varit de proprits physico-chimiques permettant la mise au point de monocouches auto-assembles (SAM) aux proprits diverses. Initialement, 19 des 20 acides amins naturels ont t attachs lacide 3-mercaptopropionique (3-MPA) formant des SAMs peptidomimtiques. La quantit dinteractions nonspcifiques engendres par ces diffrentes surfaces a t mesure en exposant ces surfaces au srum sanguin bovin complet variant de 400 ng/cm jusqu 800 ng/cm. La dtection laide de ces surfaces de la -lactamase (une enzyme responsable de la rsistance aux antibiotiques au niveau M) a dmontr la possibilit demployer ces surfaces pour btir des biocapteurs SPR. Des peptides de longueur allant de 2 5 rsidus attachs 3-MPA ont t synthtiss sur support solide. Cette tude a dmontr que laugmentation de la longueur des peptides forms dAA rsistants aux NBS accroit leur rsistance jusqu 5 rsidus. Le compos le plus performant de ce type (3-MPA-(Ser)5-OH) a permis datteindre 180 ng/cm. Cette valeur est similaire celle des meilleures surfaces disponibles commercialement, notamment les surfaces de polyethylne glycol (PEG) 100 ng/cm. Des surfaces de 3-MPA-(Ser)5-OH ont permis ltalonnage de la -lactamase et sa quantification directe dans un lysat cellulaire. La LOD pour ces biocapteurs est de 10 nM. Une troisime gnration de surfaces peptidiques binaires a permis la rduction de la NSB jusqu un niveau de 2310 ng/cm une valeur comparable aux meilleures surfaces disponibles. Ces surfaces ont permis ltalonnage dun indicateur potentiel du cancer la metalloprotinase-3 de matrice (MMP-3). Les surfaces formes de peptides binaires (3-MPA-H3D2-OH) ont permis la quantification directe de la MMP-3 dans le srum sanguin complet. Une quatrime gnration de surfaces peptidiques a permis de rduire davantage le niveau de NSB jusqu une valeur de 12 11 ng/cm. Ces surfaces ont t modifies en y attachant une terminaison de type acide nitriloactique (NTA) afin dy attacher des biomolcules marques par six rsidus histidines terminaux. Ces surfaces ont permis le dveloppement dune mthode rapide de balayage des ligands ciblant le cluster of differenciation-36 (CD36). Ltude dlectroformation des monocouches de peptide a permis de dterminer les conditions de formation optimales dune couche de 3-MPA-HHHDD-OH permettant ainsi la formation de monocouches rsistantes au NSB en moins de 6 minutes en appliquant un potentiel de formation de 200mV vs Ag/AgCl.
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Larthrose (OA) est une maladie dgnrative trs rpondue touchant les articulations. Elle est caractrise par la destruction progressive du cartilage articulaire, linflammation de la membrane synoviale et le remodelage de los sous chondral. Ltiologie de cette maladie nest pas encore bien dfinie. Plusieurs tudes ont t menes pour lucider les mcanismes molculaires et cellulaires impliqus dans le dveloppement de lOA. Les effets protecteurs du rcepteur activ par les prolifrateurs de peroxysomes gamma (PPAR) dans l'OA sont bien documents. Il a t dmontr que PPAR possde des proprits anti-inflammatoires et anti-cataboliques. Aussi, plusieurs stimuli ont t impliqus dans la rgulation de lexpression de PPAR dans diffrents types cellulaires. Cependant, les mcanismes exacts responsables de cette rgulation ainsi que le profil de lexpression de ce rcepteur au cours de la progression de lOA ne sont pas bien connus. Dans la premire partie de nos travaux, nous avons essay dlucider les mcanismes impliqus dans laltration de lexpression de PPAR dans cette maladie. Nos rsultats ont confirm limplication de linterleukine-1 (IL-1), une cytokine pro-inflammatoire, dans la rduction de lexpression de PPAR au niveau des chondrocytes du cartilage articulaire. Cet effet concide avec l'induction de lexpression du facteur de transcription rponse prcoce de type 1 (Egr-1). En plus, la diminution de l'expression de PPAR a t associe au recrutement d'Egr-1 et la rduction concomitante de la liaison de Sp1 au niveau du promoteur de PPAR. Dans la deuxime partie de nos travaux, nous avons valu le profil dexpression de ce rcepteur dans le cartilage au cours de la progression de cette maladie. Le cochon dinde avec OA spontane et le chien avec OA induite par rupture du ligament crois antrieur (ACLT) deux modles animaux dOA ont t utiliss pour suivre lexpression des trois isoformes de PPARs : PPAR alpha (), PPAR bta () et PPAR gamma () ainsi que la prostaglandine D synthase hmatopotique (H-PGDS) et la prostaglandine D synthase de type lipocaline (L-PGDS) deux enzymes impliques dans la production de lagoniste naturel de PPAR, la 15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandine J(2) (15d-PGJ2). Nos rsultats ont dmontr des changements dans lexpression de PPAR et la L-PGDS. En revanche, lexpression de PPAR, PPAR et H-PGDS est reste stable au fil du temps. La diminution de lexpression de PPAR dans le cartilage articulaire semble contribuer au dveloppement de lOA dans les deux modles animaux. En effet, le traitement des chondrocytes par de siRNA dirig contre PPAR a favoris la production des mdiateurs arthrosiques tels que l'oxyde nitrique (NO) et la mtalloprotase matricielle de type 13 (MMP-13), confirmant ainsi le rle anti-arthrosique de ce rcepteur. Contrairement ce dernier, le niveau d'expression de la L-PGDS a augment au cours de la progression de cette maladie. La surexpression de la L-PGDS au niveau des chondrocytes humains a t associe la diminution de la production de ces mdiateurs arthrosiques, suggrant son implication dans un processus de tentative de rparation. En conclusion, lensemble de nos rsultats suggrent que la modulation du niveau dexpression de PPAR, de la L-PGDS et dEgr-1 au niveau du cartilage articulaire pourrait constituer une voie thrapeutique potentielle dans le traitement de lOA et probablement dautres formes d'arthrite.
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Le syndrome de Wernicke-Korsakoff (SWK) est un dsordre neuropsychiatrique caus par la dficience en thiamine (DT). Dans la DT exprimentale comme dans le SWK, on observe une mort neuronale et des hmorragies dans certaines rgions prcises du diencphale et du tronc crbral. Les lsions diencphaliques du SWK sont particulirement svres et entranent souvent des squelles amnsiques permanentes. Le lien entre la dysfonction mtabolique induite par la DT et la mort neuronale nest pas connu. Des rapports prcdents ont dmontr que la permabilit de la barrire hmato-encphalique (BHE) tait altre et ce, prcdant lapparition du dommage neuronal, suggrant un rle critique de la dysfonction vasculaire. Les jonctions serres (JS) interendothliales, la base anatomique de la BHE, constituent un rseau molculaire incluant loccludin et les zonula occludens (ZOs). Cette thse dmontre une perte dexpression et une altration de la morphologie de ces protines en relation avec la dysfonction de la BHE dans le thalamus de souris dficientes en thiamine, fournissant une explication pour la prsence dhmorragies. Le stress oxydatif peut entraner des dommages directs aux protines des JS et interfrer avec leurs mcanismes de rgulation. De plus, loxyde nitrique (NO) peut induire la mtalloprotinase matricielle-9 (MMP-9) implique dans la dgradation de ces protines. Lendothlium vasculaire crbral (EVC) semble tre une source importante de NO dans la DT, lexpression de loxyde nitrique synthase endothliale (eNOS) tant slectivement induite dans les rgions vulnrables. Le NO peut ragir avec les espces ractives oxygnes et former du peroxynitrite, entranant un stress oxydatif/nitrosatif endothlial. Les rsultats prsents dmontrent que la dltion du gne de eNOS prvient le stress oxydatif/nitrosatif crbrovasculaire, lextravasation des immunoglobulins G (IgGs) et laltration de loccludin et des ZOs dans le thalamus de souris dficientes en thiamine. De plus, cette dltion prvient linduction de lexpression de MMP-9 dans lEVC. Des rsultats similaires ont t obtenus avec lantioxydant N-actylcystine (NAC). Les mcanismes prcis par lesquels les espces ractives altrent les protines des JS sont inconnus. Caveolin-1, une composante majeure du caveol de lEVC, est implique dans la rgulation de lexpression des protines des JS, et celle-ci est module par le stress oxydatif/nitrosatif; laltration de lexpression de caveolin-1 a t rcemment associe la rupture de la BHE. Les rsultats prsents dmontrent que lexpression de caveolin-1 est slectivement altre dans lEVC du thalamus de souris dficientes en thiamine, cocidant avec la rupture de la BHE, et dmontrent que la normalisation de lexpression de caveolin-1 par le NAC est associe avec lattnuation du dommage la BHE. Pris ensemble, ces rsultats dmontrent un rle central du stress oxydatif/nitrosatif crbrovasculaire, particulirement celui provenant de eNOS, dans laltration des JS de la BHE via des dommages directs et via linduction de MMP-9 et de caveolin-1. Cette rupture de la BHE contribue par consquent la mort neuronale dans le thalamus, puisque la prvention des altrations crbrovasculaires par la dltion du gne de eNOS et le NAC attnue significativement la mort neuronale. Ladministration prcoce dantioxydants en combinaison avec la thiamine devrait donc tre une considration importante pour le traitement du SWK.
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Le cartilage est un tissu conjonctif compos dune seule sorte de cellule nomme chondrocytes. Ce tissu offre une fondation pour la formation des os. Les os longs se dveloppent par l'ossification endochondral. Ce processus implique la coordination entre la prolifration, la diffrenciation et l'apoptose des chondrocytes, et rsulte au remplacement du cartilage par l'os. Des anomalies au niveau du squelette et des dfauts lis lge tels que larthrose (OA) apparaissent lorsquil y a une perturbation dans lquilibre du processus de dveloppement. ce jour, les mcanismes exacts contrlant la fonction et le comportement des chondrocytes pendant la croissance et le dveloppement du cartilage sont inconnus. Le rcepteur activateur de la prolifration des peroxysomes (PPAR) gamma est un facteur de transcription impliqu dans l'homostasie des lipides. Plus rcemment, son implication a aussi t suggre dans l'homostasie osseuse. Cependant, le rle de PPAR in vivo dans la croissance et le dveloppement du cartilage est inconnu. Donc, pour la premire fois, cette tude examine le rle spcifique de PPAR in vivo dans la croissance et le dveloppement du cartilage. Les souris utilises pour ltude avaient une dltion conditionnelle au cartilage du gne PPAR. Ces dernires ont t gnres en employant le systme LoxP/Cre. Les analyses des souris ayant une dltion au PPAR aux stades embryonnaire et adulte dmontrent une rduction de la croissance des os longs, une diminution des dpts de calcium dans los, de la densit osseuse et de la vascularisation, un dlai dans lossification primaire et secondaire, une diminution cellulaire, une perte dorganisation colonnaire et une diminution des zones hypertrophiques, une dsorganisation des plaques de croissance et des chondrocytes dforms. De plus, la prolifration et la diffrenciation des chondrocytes sont anormales. Les chondrocytes et les explants isols du cartilage mutant dmontrent une expression rduite du facteur de croissance endothlial vasculaire (VEGF)-A et des lments de production de la matrice extracellulaire. Une augmentation de lexpression de la mtalloprotinase matricielle (MMP)-13 est aussi observe. Dans les souris ges ayant une dltion au PPAR, y est aussi not des phnotypes qui ressemblent ceux de lOA tel que la dgradation du cartilage et l'inflammation de la membrane synoviale, ainsi quune augmentation de lexpression de MMP-13 et des nopitopes gnrs par les MMPs. Nos rsultats dmontrent que le PPAR est ncessaire pour le dveloppement et lhomostasie du squelette. PPAR est un rgulateur essentiel pour la physiologie du cartilage durant les stades de croissance, de dveloppement et de vieillissement.
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Introduction: Lactivation des cellules stellaires hpatiques (CSHs) est un point cl du processus de fibrose hpatique. Les lymphocytes T CD4+ intra-hpatiques sont une source majeure de cytokines anti-inflammatoires comme lIL-10 et pro-inflammatoire (IL-17A), hpatoprotectrice (IL-22) produites par les Th17. Les Th17 sont impliqus dans de nombreuses pathologies inflammatoires mais leffet de ces cellules sur les CSHs nest pas encore lucid. Objectif: Comprendre le rle des cytokines de type Th17 dans le processus dactivation des CSHs. Mthodes: La ligne de CSHs humaine LX2 a t stimule par lIL-17A ou lIL-22 puis compare des cellules traites par le TGF-b et le tampon phosphate salin (PBS). Lactivation des CSHs a t value en examinant les molcules profibrotique alpha-smooth muscle actin (a-SMA), collagne de type I (COL1A1) et inhibiteur produits par les tissus des mtalloprotases matricielles I (TIMP-I) par q-PCR. Lexpression protique a t valide par immunobuvardage ou coloration au rouge de picro Sirius. Lexpression membranaire de lIL-10Rb, du TGF-b-RII et de lIL-17RA a t mesure par cytomtrie en flux. Rsultats: LIL-17A et lIL-22 nactivent pas les cellules LX2, car aucune induction da-SMA, de COL1A1 et de TIMP-I na t observe. Cependant, lIL-17A et lIL-22 sensibilisent les CSHs laction du TGF-b, tel que dmontr par une forte expression et production da-SMA, collagne type I et TIMP-I. LIL-17A, mais pas lIL-22, induit la surexpression la surface cellulaire du TGF-b-RII et inhibe partiellement la baisse dexpression du TGF--RII aprs stimulation au TGF-b. Conclusion: Nos rsultats dmontrent une fonction pro-fibrotique de lIL-17A et de lIL-22, car les deux cytokines sensibilisent les CSHs laction du TGF-b. LIL-17A agit via la surexpression et la stabilisation du TGF-b-RII tandis que lIL-22 agit probablement par des mcanismes intracellulaires.
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La dgradation protolytique du collagne de type II est considre comme tant un facteur majeur dans le processus irrversible de dgradation de la matrice cartilagineuse lors dostoarthrose. Outre les collagnases de la famille des mtaloprotinases de la matrice (MMP-1, -8, -13), la cathepsine K est parmi les seules enzymes susceptibles de dgrader la triple hlice intacte du collagne de type II, devenant ainsi un lment pertinent pour les recherches sur lostoarthrose. Lobjectif court terme de notre tude consiste en lidentification et la caractrisation de sites de clivage spcifiques de la cathepsine K sur le collagne de type II quin. La technique dlectrophorse SDS-PAGE 1D permet la visualisation des produits de digestion et la validation des rsultats de la caractrisation molculaire des fragments protolytiques. La caractrisation est ralise en combinant la digestion trypsique prcdant lanalyse HPLC-ESI/MS. Les rsultats ont permis dtablir les sites, prsents sur la carte peptidique de la molcule de collagne de type II quin, des 48 rsidus prolines (P) et 5 rsidus lysines (K) supportant une modification post-traductionnelle. De plus, 6 fragments majeurs, diffrents de ceux produits par les MMPs, sont observs par SDS-PAGE 1D puis confirms par HPLC-ESI/MS, correspondant aux sites suivants : F1 [G189-K190], F2 [G252-P253], F3 [P326-G327], F4 [P428-G429], F5 [P563-G564] et F6 [P824-G825]. Le fragment F1 nouvellement identifi suggre un site de clivage diffrent de ltude antrieure sur le collagne de type II bovin et humain. Lobjectif long terme serait le dveloppement danticorps spcifiques au site identifi, permettant de suivre lactivit protolytique de la cathepsine K par immunohistochimie et LISA, dans le cadre du diagnostic de lostoarthrose.
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Objective: Our research program has focused on the development of promising, soft alkylating N-phenyl-N-(2-chloroethyl)urea (CEU) compounds which acylate the glutamic acid-198 of -tubulin, near the binding site of colchicum alkaloids. CEUs inhibit the motility of cancerous cells in vitro and, interestingly, exhibit antiangiogenic and anticancer activity in vivo. Mitotic arrest induced by microtubule-interfering agents such as CEUs remains the major mechanism of their anticancer activity, leading to apoptosis. However, we recently demonstrated that microtubule disruption by CEUs and other common antimicrotubule agents greatly alters the integrity and organization of microtubule-associated structures, the focal adhesion contact, thereby initiating anoikis, an apoptosis-like cell death mechanism caused by the loss of cell contact with the extracellular matrix. Methods: To ascertain the activated signaling pathway profile of CEUs, flow cytometry, Western blot, immunohistochemistry and transfection experiments were performed. Wound-healing and chick embryo assays were carried out to evaluate the antiangiogenic potency of CEUs. Results: CEU-induced apoptosis involved early cell cycle arrest in G2/M and increased level of CDK1/cycline B proteins. These signaling events were followed by the specific activation of the intrinsic apoptosis pathway, involving loss of mitochondrial membrane potential (m) and ROS production, cytochrome c release from mitochondria, caspase activation, AIF nuclear translocation, PARP cleavage and nuclear fragmentation. CEUs maintained their efficacy on cells plated on pro-survival extracellular matrices or exhibiting overexpression of P-glycoprotein or the anti-apoptotic protein Bcl-2. Conclusion: Our results suggest that CEUs represent a promising new class of antimicrotubule, antiangiogenic and pro-anoikis agents.
