Marquage fluorescent des protéines pour étudier les enzymes protéolytiques solubles et immobilisées par la cartographie peptidique électrophorétique

La cartographie peptidique est une méthode qui permet entre autre d’identifier les modifications post-traductionnelles des protéines. Elle comprend trois étapes : 1) la protéolyse enzymatique, 2) la séparation par électrophorèse capillaire (CE) ou chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des fragments peptidiques et 3) l’identification de ces derniers. Cette dernière étape peut se faire par des méthodes photométriques ou par spectrométrie de masse (MS). Au cours de la dernière décennie, les enzymes protéolytiques immobilisées ont acquis une grande popularité parce qu’elles peuvent être réutilisées et permettent une digestion rapide des protéines due à un rapport élevé d’enzyme/substrat. Pour étudier les nouvelles techniques d’immobilisation qui ont été développées dans le laboratoire du Professeur Waldron, la cartographie peptidique par CE est souvent utilisée pour déterminer le nombre total de peptides détectés et leurs abondances. La CE nous permet d’avoir des séparations très efficaces et lorsque couplée à la fluorescence induite par laser (LIF), elle donne des limites de détection qui sont 1000 fois plus basses que celles obtenues avec l’absorbance UV-Vis. Dans la méthode typique, les peptides venant de l’étape 1) sont marqués avec un fluorophore avant l’analyse par CE-LIF. Bien que la sensibilité de détection LIF puisse approcher 10-12 M pour un fluorophore, la réaction de marquage nécessite un analyte dont la concentration est d’au moins 10-7 M, ce qui représente son principal désavantage. Donc, il n’est pas facile d’étudier les enzymes des peptides dérivés après la protéolyse en utilisant la technique CE-LIF si la concentration du substrat protéique initial est inférieure à 10-7 M. Ceci est attribué à la dilution supplémentaire lors de la protéolyse. Alors, afin d’utiliser le CE-LIF pour évaluer l’efficacité de la digestion par enzyme immobilisée à faible concentration de substrat,nous proposons d’utiliser des substrats protéiques marqués de fluorophores pouvant être purifiés et dilués. Trois méthodes de marquage fluorescent de protéine sont décrites dans ce mémoire pour étudier les enzymes solubles et immobilisées. Les fluorophores étudiés pour le marquage de protéine standard incluent le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA), la fluorescéine-5-isothiocyanate (FITC) et l’ester de 6-carboxyfluorescéine N-succinimidyl (FAMSE). Le FAMSE est un excellent réactif puisqu’il se conjugue rapidement avec les amines primaires des peptides. Aussi, le substrat marqué est stable dans le temps. Les protéines étudiées étaient l’-lactalbumine (LACT), l’anhydrase carbonique (CA) et l’insuline chaîne B (INB). Les protéines sont digérées à l’aide de la trypsine (T), la chymotrypsine (CT) ou la pepsine (PEP) dans leurs formes solubles ou insolubles. La forme soluble est plus active que celle immobilisée. Cela nous a permis de vérifier que les protéines marquées sont encore reconnues par chaque enzyme. Nous avons comparé les digestions des protéines par différentes enzymes telles la chymotrypsine libre (i.e., soluble), la chymotrypsine immobilisée (i.e., insoluble) par réticulation avec le glutaraldéhyde (GACT) et la chymotrypsine immobilisée sur billes d’agarose en gel (GELCT). Cette dernière était disponible sur le marché. Selon la chymotrypsine utilisée, nos études ont démontré que les cartes peptidiques avaient des différences significatives selon le nombre de pics et leurs intensités correspondantes. De plus, ces études nous ont permis de constater que les digestions effectuées avec l’enzyme immobilisée avaient une bonne reproductibilité. Plusieurs paramètres quantitatifs ont été étudiés afin d’évaluer l’efficacité des méthodes développées. La limite de détection par CE-LIF obtenue était de 3,010-10 M (S/N = 2,7) pour la CA-FAM digérée par GACT et de 2,010-10 M (S/N = 4,3) pour la CA-FAM digérée par la chymotrypsine libre. Nos études ont aussi démontrées que la courbe d’étalonnage était linéaire dans la région de travail (1,0×10-9-1,0×10-6 M) avec un coefficient de corrélation (R2) de 0,9991.

Indirect Bonding Method: in vitro Comparison of the Shear Bond Strength between Metallic Orthodontic Brackets and Different Porcelain Surface Preparations

Introduction : La force d’adhésion à l'interface métal-céramique avec les résines auto-polymérisantes destinées au collage indirect des boîtiers orthodontiques n'a pas été évaluée à ce jour et un protocole clinique basé sur la littérature scientifique est inexistant. Objectifs : 1) Comparer la force de cisaillement maximale entre des boîtiers métalliques et des surfaces en porcelaine préparées selon différentes méthodes; 2) Suggérer un protocole clinique efficace et prévisible. Matériel et méthodes : Quatre-vingt-dix disques en leucite (6 groupes; n = 15/groupe) ont été préparés selon 6 combinaisons de traitements de surface : mécaniques (+ / - fraisage pour créer les rugosités) et chimiques (acide fluorhydrique, apprêt, silane). Des bases en résine composite Transbond XT (3M Unitek, Monrovia, California) faites sur mesure ont été collées avec le système de résine adhésive auto-polymérisante Sondhi A + B Rapid Set (3M Unitek, Monrovia, California). Les échantillons ont été préservés (H2O/24hrs), thermocyclés (500 cycles) et testés en cisaillement (Instron, Norwood, Massachusetts). Des mesures d’Index d’adhésif résiduel (IAR) ont été compilées. Des tests ANOVAs ont été réalisés sur les rangs étant donné que les données suivaient une distribution anormale et ont été ajustés selon Tukey. Un Kruskall-Wallis, U-Mann Whitney par comparaison pairée et une analyse de Weibull ont aussi été réalisés. Résultats : Les médianes des groupes varient entre 17.0 MPa (- fraisage + acide fluorhydrique) à 26.7 MPa (- fraisage + acide fluorhydrique + silane). Le fraisage en surface ne semble pas affecter l’adhésion. La combinaison chimique (- fraisage + silane + apprêt) a démontré des forces de cisaillement significativement plus élevées que le traitement avec (- fraisage + acide fluorhydrique), p<0,05, tout en possédant des forces similaires au protocole typiquement suggéré à l’acide fluorhydrique suivi d’une application de silane, l’équivalence de (- fraisage + acide fluorhydrique + silane). Les mesures d’IAR sont significativement plus basses dans le groupe (- fraisage + acide fluorhydrique) en comparaison avec celles des 5 autres groupes, avec p<0,05. Malheureusement, ces 5 groupes ont des taux de fracture élévés de 80 à 100% suite à la décimentation des boîtiers. Conclusion : Toutes les combinaisons de traitement de surface testées offrent une force d’adhésion cliniquement suffisante pour accomplir les mouvements dentaires en orthodontie. Une application de silane suivie d’un apprêt est forte intéressante, car elle est simple à appliquer cliniquement tout en permettant une excellente adhésion. Il faut cependant avertir les patients qu’il y a un risque de fracture des restorations en céramique lorsque vient le moment d’enlever les broches. Si la priorité est de diminuer le risque d’endommager la porcelaine, un mordançage seul à l’acide hydrofluorique sera suffisant.

Étude clinique randomisée prospective du taux de survie d'un fil lingual mandibulaire de rétention utilisant les méthodes de collage direct et indirect à court et moyen termes

Introduction : Après un traitement orthodontique, la rétention (ou contention) est essentielle pour éviter les récidives vers la malocclusion initiale. Le fil de rétention lingual est un appareil fixe, relativement facile à installer et bien accepté par les patients pour maintenir la position finale des dents antérieures inférieures. Étant de plus en plus utilisé, il devient important de s’assurer de sa fiabilité pour la stabilité de l’alignement dentaire. Objectif : Le but de cette étude clinique randomisée prospective est de déterminer le taux de survie d’un fil lingual mandibulaire de rétention en comparant les méthodes de collage direct et de collage indirect à court et moyen termes. Méthodologie : L’échantillon est constitué de 117 patients consécutifs aléatoirement distribués dans 2 groupes : collage direct (n=58) et collage indirect (n=59). Les fils torsadés de diamètre 0,0175’’ sont préformés par un technicien de laboratoire soit selon la méthode de collage direct, soit selon la méthode de collage indirect. Une matrice de transfert en silicone assure le positionnement précis du fil lingual en bouche. Assure® et Filtek™ Flow ont été utilisés pour le collage direct. Filtek™ Flow, Assure®, and Sondhi™ ont été utilisés pour le collage indirect. Les fils de rétention ont été évalués pour le décollement, l’infiltration, la distorsion et le bris à 2 mois (T1) et 6 mois (T2). Résultats : À T1, le taux de survie du fil de rétention est de 90,2% pour le groupe de collage direct, comparativement à 79,5% pour le groupe de collage indirect (p=0,232). À T2, le fil est resté intact pour 74,1% des participants dans le groupe de collage direct et pour 70,0% des participants dans le groupe de collage indirect (p=0,481). Les différences ne sont pas statistiquement significatives entre les 2 groupes. La fréquence du décollement est plus haute que les autres problèmes enregistrés à T1 (p<0,022), représentant 85,7% des échecs. À T2, le décollement est plus fréquent que la distorsion ou le bris (p<0,04), mais pas statistiquement plus fréquent que l’infiltration (p=0,109). Il représente alors 86,4% des échecs. Conclusion : Le décollement est la principale cause d’échec d’un fil de rétention lingual. Il n’y a pas de différence statistiquement significative du taux de survie d’un fil lingual mandibulaire de rétention entre les techniques de collage direct et de collage indirect à court et moyen termes.

Mécanismes moléculaires régulant la pathologie dendritique dans la rétine adulte lésée in vivo

Les dendrites sont essentielles pour la réception et l’intégration des stimuli afférents dans les neurones. De plus en plus d’évidences d’une détérioration dendritique sont associées à une axonopathie dans les maladies neurodégénératives. Le glaucome dont la physiopathologie est caractérisée par une détérioration progressive et irréversible des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs) est la première cause de cécité irréversible dans le monde. Son évolution est associée à un amincissement graduel des axones et à l’atrophie des somas des CGRs. La majorité des études de neuroprotection des neuropathies rétiniennes visent la survie et la protection des somas et des axones. Des études récentes ont démontré des changements dendritiques associés à cette pathologie, toutefois les mécanismes moléculaires les régulant sont méconnus. L’hypothèse principale de ma thèse stipule qu’une lésion axonale entraîne des altérations précoces des structures dendritiques. L’identification de voies de signalisation régulant ces changements permettrait d’élaborer des stratégies de neuroprotection et de rétablir la fonction de ces neurones. Dans la première étude, nous avons examiné l’effet précoce d’une lésion axonale aigüe sur la morphologie dendritique des CGRs in vivo. En utilisant des souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) soumises à une axotomie, nous avons démontré un rétrécissement de l’arbre dendritique des CGRs et une diminution sélective de l’activité de mTOR avant le début de la mort des CGRs lésées. Aussi nous avons démontré une augmentation de l’expression de la protéine Regulated in development and DNA damage response 2 (REDD2), un régulateur négatif en amont de la protéine mTOR en réponse à la lésion du nerf optique in vivo. Nous avons démontré que la réactivation de mTOR par l’inhibition de l’expression de REDD2 préserve les arbres dendritiques des CGRs adultes. En effet, l’injection de petits ARN d’interférence contre la REDD2 (siREDD2) stimule l’activité de mTOR dans les CGRs lésées et augmente significativement la longueur et la surface dendritique totale. De plus, la rapamycine, un inhibiteur de mTOR, inhibe complètement l’effet du siREDD2 sur la croissance et l’élaboration des dendrites. L’analyse électrophysiologique des CGRs démontre une augmentation de l’excitabilité des CGRs lésées qui est restaurée en présence du siREDD2. Par ailleurs, des données récentes ont mis en évidence l’implication de la neuro-inflammation dans le glaucome, caractérisée par une augmentation de cytokines pro-inflammatoires dont principalement le facteur de nécrose tumorale (TNFα). Ainsi dans la deuxième étude nous avons examiné l’effet du TNF exogène sur la morphologie de l’arbre dendritique des CGRs et commencé l’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces changements. Nos résultats démontrent que l’injection de TNF recombinante dans le vitrée induit une rétraction dendritique précoce qui corrèle à une réduction de phospho-S6 suggérant l’implication de mTOR dans ces CGRs lésées. Ainsi, les études présentées dans cette thèse mettent en évidence un nouveau rôle de mTOR dans la stabilité et le maintien des dendrites de neurones rétiniennes adultes. Ces études ont aussi démontré l’effet précoce de stress direct ou indirect, c’est-à-dire l’axotomie et le TNFα respectivement sur la pathologie dendritique et sur leur effet sur la fonction neuronale.