Impact de l'haploinsuffisance du gène Sim1 sur le développement et la fonction du noyau paraventriculaire de l'hypothalamus

L’obésité provient d’un déséquilibre de l’homéostasie énergétique, c’est-à-dire une augmentation des apports caloriques et/ou une diminution des dépenses énergétiques. Plusieurs données, autant anatomiques que physiologiques, démontrent que l’hypothalamus est un régulateur critique de l’appétit et des dépenses énergétiques. En particulier, le noyau paraventriculaire (noyau PV) de l’hypothalamus intègre plusieurs signaux provenant du système nerveux central (SNC) et/ou de la périphérie, afin de contrôler l’homéostasie énergétique via des projections axonales sur les neurones pré-ganglionnaires du système autonome situé dans le troc cérébral et la moelle épinière. Plusieurs facteurs de transcription, impliqués dans le développement du noyau PV, ont été identifiés. Le facteur de transcription SIM1, qui est produit par virtuellement tous les neurones du noyau PV, est requis pour le développement du noyau PV. En effet, lors d’une étude antérieure, nous avons montré que le noyau PV ne se développe pas chez les souris homozygotes pour un allèle nul de Sim1. Ces souris meurent à la naissance, probablement à cause des anomalies du noyau PV. Par contre, les souris hétérozygotes survivent, mais développent une obésité précoce. De façon intéressante, le noyau PV des souris Sim1+/- est hypodéveloppé, contenant 24% moins de cellules. Ces données suggèrent fortement que ces anomalies du développement pourraient perturber le fonctionnement du noyau PV et contribuer au développement du phénotype d’obésité. Dans ce contexte, nous avons entrepris des travaux expérimentaux ayant pour but d’étudier l’impact de l’haploinsuffisance de Sim1 sur : 1) le développement du noyau PV et de ses projections neuronales efférentes; 2) l’homéostasie énergétique; et 3) les voies neuronales physiologiques contrôlant l’homéostasie énergétique chez les souris Sim1+/-. A cette fin, nous avons utilisé : 1) des injections stéréotaxiques combinées à des techniques d’immunohistochimie afin de déterminer l’impact de l’haploinsuffisance de Sim1 sur le développement du noyau PV et de ses projections neuronales efférentes; 2) le paradigme des apports caloriques pairés, afin de déterminer l’impact de l’haploinsuffisance de Sim1 sur l’homéostasie énergétique; et 3) une approche pharmacologique, c’est-à-dire l’administration intra- cérébroventriculaire (i.c.v.) et/ou intra-péritonéale (i.p.) de peptides anorexigènes, la mélanotane II (MTII), la leptine et la cholécystokinine (CCK), afin de déterminer l’impact de l’haploinsuffisance de Sim1 sur les voies neuronales contrôlant l’homéostasie énergétique. Dans un premier temps, nous avons constaté une diminution de 61% et de 65% de l’expression de l’ARN messager (ARNm) de l’ocytocine (Ot) et de l’arginine-vasopressine (Vp), respectivement, chez les embryons Sim1+/- de 18.5 jours (E18.5). De plus, le nombre de cellules produisant l’OT et la VP est apparu diminué de 84% et 41%, respectivement, chez les souris Sim1+/- adultes. L’analyse du marquage axonal rétrograde des efférences du noyau PV vers le tronc cérébral, en particulier ses projections sur le noyau tractus solitaire (NTS) aussi que le noyau dorsal moteur du nerf vague (X) (DMV), a permis de démontrer une diminution de 74% de ces efférences. Cependant, la composition moléculaire de ces projections neuronales reste inconnue. Nos résultats indiquent que l’haploinsuffisance de Sim1 : i) perturbe spécifiquement le développement des cellules produisant l’OT et la VP; et ii) abolit le développement d’une portion importante des projections du noyau PV sur le tronc cérébral, et notamment ses projections sur le NTS et le DMV. Ces observations soulèvent donc la possibilité que ces anomalies du développement du noyau PV contribuent au phénotype d’hyperphagie des souris Sim1+/-. En second lieu, nous avons observé que la croissance pondérale des souris Sim1+/- et des souris Sim1+/+ n’était pas significativement différente lorsque la quantité de calories présentée aux souris Sim1+/- était la même que celle consommée par les souris Sim1+/+. De plus, l’analyse qualitative et quantitative des tissus adipeux blancs et des tissus adipeux bruns n’a démontré aucune différence significative en ce qui a trait à la taille et à la masse de ces tissus chez les deux groupes. Finalement, au terme de ces expériences, les souris Sim1+/--pairées n’étaient pas différentes des souris Sim1+/+ en ce qui a trait à leur insulinémie et leur contenu en triglycérides du foie et des masses adipeuses, alors que tous ces paramètres étaient augmentés chez les souris Sim1+/- nourries ad libitum. Ces résultats laissent croire que l’hyperphagie, et non une diminution des dépenses énergétiques, est la cause principale de l’obésité des souris Sim1+/-. Par conséquent, ces résultats suggèrent que : i) l’haploinsuffisance de Sim1 est associée à une augmentation de l’apport calorique sans toutefois moduler les dépenses énergétiques; ii) l’existence d’au moins deux voies neuronales issues du noyau PV : l’une qui régule la prise alimentaire et l’autre la thermogénèse; et iii) l’haploinsuffisance de Sim1 affecte spécifiquement la voie neuronale qui régule la prise alimentaire. En dernier lieu, nous avons montré que l’injection de MTII, de leptine ainsi que de CCK induit une diminution significative de la consommation calorique des souris des deux génotypes, Sim1+/+ et Sim1+/-. De fait, la consommation calorique cumulative des souris Sim1+/- et Sim1+/+ est diminuée de 37% et de 51%, respectivement, durant les 4 heures suivant l’administration i.p. de MTII comparativement à l’administration d’une solution saline. Lors de l’administration i.c.v. de la leptine, la consommation calorique cumulative des souris Sim1+/- et Sim1+/+ est diminuée de 47% et de 32%, respectivement. Finalement, l’injection i.p. de CCK diminue la consommation calorique des souris Sim1+/- et Sim1+/+ de 52% et de 36%, respectivement. L’ensemble des résultats suggère ici que l’haploinsuffisance de Sim1 diminue l’activité de certaines voies neuronales régulant l’homéostasie énergétique, et particulièrement de celles qui contrôlent la prise alimentaire. En résumé, ces travaux ont montré que l’haploinsuffisance de Sim1 affecte plusieurs processus du développement au sein du noyau PV. Ces anomalies du développement peuvent conduire à des dysfonctions de certains processus physiologiques distincts régulés par le noyau PV, et notamment de la prise alimentaire, et contribuer ainsi au phénotype d’obésité. Les souris hétérozygotes pour le gène Sim1 représentent donc un modèle animal unique, où l’hyperphagie, et non les dépenses énergétiques, est la principale cause de l’obésité. En conséquence, ces souris pourraient représenter un modèle expérimental intéressant pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires en contrôle de la prise alimentaire.

Studies on the exaggerated inflammatory response caused by streptococcus suis at systemic and central nervous system levels

Streptococcus suis de type 2 est un microorganisme pathogène d’importance chez le porc. Il est la cause de différentes pathologies ayant comme caractéristique commune la méningite. C’est également un agent émergeant de zoonose : des cas cliniques humains ont récemment été rapportés en Asie. Cependant, la pathogénèse de S. suis n’est pas encore complètement élucidée. Jusqu’à présent, la réponse pro-inflammatoire initiée par S. suis n’a été étudiée qu’in vitro. L’étude du choc septique et de la méningite requiert toujours des modèles expérimentaux appropriés. Au cours de cette étude, nous avons développé un modèle in vivo d’infection chez la souris qui utilise la voie d’inoculation intra-péritonéale. Ce modèle a servi à l’étude de la réponse pro-inflammatoire associée à ce pathogène, tant au niveau systémique qu’au niveau du système nerveux central (SNC). Il nous a également permis de déterminer si la sensibilité aux infections à S. suis pouvait être influencée par des prédispositions génétiques de l’hôte. Le modèle d’infection par S. suis a été mis au point sur des souris de lignée CD1. Les résultats ont démontré une bactériémie élevée pendant les trois jours suivant l’infection. Celle-ci était accompagnée d’une libération rapide et importante de différentes cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-12p40/p70, IFN-ɣ) et de chémokines (KC, MCP-1 and RANTES), qui ont entraîné un choc septique et la mort de 20 % des animaux. Ensuite, pour confirmer le rôle de l’inflammation sur la mortalité et pour déterminer si les caractéristiques génétiques de l’hôte pouvaient influencer la réponse inflammatoire et l’issue de la maladie, le modèle d’infection a été étendu à deux lignées murines consanguines différentes considérées comme résistante : la lignée C57BL/6 (B6), et sensible : la lignée A/J. Les résultats ont démontré une importante différence de sensibilité entre les souris A/J et les souris B6, avec un taux de mortalité atteignant 100 % à 20 h post-infection (p.i.) pour la première lignée et de seulement 16 % à 36 h p.i. pour la seconde. La quantité de bactéries dans le sang et dans les organes internes était similaire pour les deux lignées. Donc, tout comme dans la lignée CD1, la bactériémie ne semblait pas être liée à la mort des souris. La différence entre les taux de mortalité a été attribuée à un choc septique non contrôlé chez les souris A/J infectées par S. suis. Les souris A/J présentaient des taux exceptionnellement élevés de TNF-α, IL-12p40/p70, IL-1β and IFN- γ, significativement supérieurs à ceux retrouvés dans la lignée B6. Par contre, les niveaux de chémokines étaient similaires entre les lignées, ce qui suggère que leur influence est limitée dans le développement du choc septique dû à S. suis. Les souris B6 avaient une production plus élevée d’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, ce qui suppose que la cascade cytokinaire pro-inflammatoire était mieux contrôlée, entraînant un meilleur taux de survie. Le rôle bénéfique potentiel de l’IL-10 chez les souris infectées par S. suis a été confirmé par deux approches : d’une part en bloquant chez les souris B6 le récepteur cellulaire à l’IL-10 (IL-10R) par un anticorps monoclonal anti-IL-10R de souris et d’autre part en complémentant les souris A/J avec de l’IL-10 de souris recombinante. Les souris B6 ayant reçu le anticorps monoclonal anti-IL-10R avant d’être infectées par S. suis ont développé des signes cliniques aigus similaires à ceux observés chez les souris A/J, avec une mortalité rapide et élevée et des taux de TNF-α plus élevés que les souris infectées non traitées. Chez les souris A/J infectées par S. suis, le traitement avec l’IL-10 de souris recombinante a significativement retardé l’apparition du choc septique. Ces résultats montrent que la survie au choc septique dû à S. suis implique un contrôle très précis des mécanismes pro- et anti-inflammatoires et que la réponse anti-inflammatoire doit être activée simultanément ou très rapidement après le début de la réponse pro-inflammatoire. Grâce à ces expériences, nous avons donc fait un premier pas dans l’identification de gènes associés à la résistance envers S. suis chez l’hôte. Une des réussites les plus importantes du modèle d’infection de la souris décrit dans ce projet est le fait que les souris CD1 ayant survécu à la septicémie présentaient dès 4 jours p.i. des signes cliniques neurologiques clairs et un syndrome vestibulaire relativement similaires à ceux observés lors de méningite à S. suis chez le porc et chez l’homme. L’analyse par hybridation in situ combinée à de l’immunohistochimie des cerveaux des souris CD1 infectées a montré que la réponse inflammatoire du SNC débutait avec une augmentation significative de la transcription du Toll-like receptor (TLR)2 et du CD14 dans les microvaisseaux cérébraux et dans les plexus choroïdes, ce qui suggère que S. suis pourrait se servir de ces structures comme portes d’entrée vers le cerveau. Aussi, le NF-κB (suivi par le système rapporteur de l’activation transcriptionnelle de IκBα), le TNF-α, l’IL-1β et le MCP-1 ont été activés, principalement dans des cellules identifiées comme de la microglie et dans une moindre mesure comme des astrocytes. Cette activation a également été observée dans différentes structures du cerveau, principalement le cortex cérébral, le corps calleux, l’hippocampe, les plexus choroïdes, le thalamus, l’hypothalamus et les méninges. Partout, cette réaction pro-inflammatoire était accompagnée de zones extensives d’inflammation et de nécrose, de démyélinisation sévère et de la présence d’antigènes de S. suis dans la microglie. Nous avons mené ensuite des études in vitro pour mieux comprendre l’interaction entre S. suis et la microglie. Pour cela, nous avons infecté des cellules microgliales de souris avec la souche sauvage virulente (WT) de S. suis, ainsi qu’avec deux mutants isogéniques, un pour la capsule (CPS) et un autre pour la production d’hémolysine (suilysine). Nos résultats ont montré que la capsule était un important mécanisme de résistance à la phagocytose pour S. suis et qu’elle modulait la réponse inflammatoire, en dissimulant les composants pro-inflammatoires de la paroi bactérienne. Par contre, l’absence d’hémolysine, qui est un facteur cytotoxique potentiel, n’a pas eu d’impact majeur sur l’interaction de S. suis avec la microglie. Ces études sur les cellules microgliales ont permis de confirmer les résultats obtenus précédemment in vivo. La souche WT a induit une régulation à la hausse du TLR2 ainsi que la production de plusieurs médiateurs pro-inflammatoires, dont le TNF-α et le MCP-1. S. suis a induit la translocation du NF-kB. Cet effet était plus rapide dans les cellules stimulées par le mutant déficient en CPS, ce qui suggère que les composants de la paroi cellulaire représentent de puissants inducteurs du NF-kB. De plus, la souche S. suis WT a stimulé l’expression de la phosphotyrosine, de la PKC et de différentes cascades liées à l’enzyme mitogen-activated protein kinase (MAPK). Cependant, les cellules microgliales infectées par le mutant déficient en CPS ont montré des profils de phosphorylation plus forts et plus soutenus que celles infectées par le WT. Finalement, la capsule a aussi modulé l’expression de l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) induite par S. suis et par la production subséquente d’oxyde nitrique par la microglie. Ceci pourrait être lié in vivo à la neurotoxicité et à la vasodilatation. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant l’induction de l’inflammation par S. suis, ce qui devrait permettre, d’établir éventuellement des stratégies plus efficaces de lutte contre la septicémie et la méningite. Enfin, nous pensons que ce modèle expérimental d’infection chez la souris pourra être utilisé dans l’étude de la pathogénèse d’autres bactéries ayant le SNC pour cible.