Feedback regulation of Gab2-dependent signaling by the Ras/MAPK pathway

La voie de signalisation des Récepteurs Tyrosine Kinase (RTK) occupe un rôle central dans la régulation de la croissance cellulaire, la prolifération, la différentiation et la motilité. Une régulation anormale des RTKs mène à plusieurs maladies humaines telles que le cancer du sein, la seconde cause de mortalité chez les femmes à cause de l’amplification et la mutation fréquente de la protéine tyrosine kinase HER2 (ERBB2). Grb2-associated binder (Gab) 2 est une protéine adaptatrice qui agit en aval de plusieurs RTKs, y compris HER2, pour réguler de multiples voies de signalisation. En réponse à la stimulation par de nombreux facteurs de croissances et cytokines, Gab2 est recruté à la membrane plasmique où il potentialise l’activation des voies de signalisation Ras/mitogen-activated protein kinase (MAPK) et PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase)/Akt (protein kinase B). En plus d’occuper un rôle essentiel durant le développement du système hématopoïétique, Gab2 est souvent amplifié dans les cancers, notamment le cancer du sein et les mélanomes. Cependant, les mécanismes moléculaires qui régulent le fonctionnement de Gab2 sont peu connus. Il est établi que lors de l’activation des RTKs, Gab2 est phosphorylé au niveau de plusieurs résidus Tyrosine, menant à l’association de différentes protéines comme p85 et Shp2. En plus de la phosphorylation en Tyrosine, notre laboratoire ainsi que d’autres groupes de recherche avons identifié que Gab2 est aussi phosphorylé au niveau de résidus Ser/Thr suite à l’activation de la voie de signalisation MAPK. Cependant, la régulation des fonctions de Gab2 par ces modifications post-traductionnelles est encore peu connue. Dans le but de comprendre comment Gab2 est régulé par la voie de signalisation MAPK, nous avons utilisé différentes approches. Dans la première partie de ma thèse, nous avons déterminé un nouveau mécanisme démontrant que la voie de signalisation Ras/MAPK, par le biais des protéines kinases RSK (p90 ribosomal S6 kinase), phosphoryle Gab2. Ce phénomène se produit à la fois in vivo et in vitro au niveau de trois résidus Ser/Thr conservés. Des mutations au niveau de ces sites de phosphorylation entrainent le recrutement de Shp2 menant à l’augmentation de la motilité cellulaire, ce qui suggère que les protéines RSK restreignent les fonctions dépendantes de Gab2. Ce phénomène est le résultat de la participation de RSK dans la boucle de rétroaction négative de la voie de signalisation MAPK. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons démontré que les protéines ERK1/2 phosphorylent Gab2 au niveau de plusieurs résidus pS/T-P à la fois in vitro et in vivo, entrainant l’inhibition du recrutement de p85. De plus, nous avons établi pour la première fois que Gab2 interagit physiquement avec ERK1/2 dans des cellules lors de l’activation de la voie de signalisation MAPK. Par ailleurs, nous avons montré un nouveau domaine d’attache du module ERK1/2 sur Gab2. Des mutations sur les résidus essentiels de ce domaine d’attache n’entrainent pas seulement la dissociation de ERK1/2 avec Gab2, mais diminuent également la phosphorylation dépendante de ERK1/2 sur Gab2. Ainsi, nos données montrent que la voie de signalisation MAPK régule les fonctions de la protéine Gab2 par le biais des kinases RSK et ERK1/2. Cette thèse élabore par ailleurs un schéma complet des fonctions de Gab2 dépendantes de la voie de signalisation MAPK dans le développement de nombreux cancers.

Conception de miARN artificiels basée sur la caractérisation de la boucle de régulation miR-20/E2F

La biologie moléculaire et, plus spécifiquement, la régulation de l’expression génique ont été révolutionnées par la découverte des microARN (miARN). Ces petits ARN d’une vingtaine de nucléotides sont impliqués dans la majorité des processus cellulaires et leur expression est dérégulée dans plusieurs maladies, comme le cancer. Un miARN reconnaît ses cibles principalement par son noyau, ce qui lui permet de réguler simultanément la traduction de centaines d’ARN messagers. Nos travaux ont montré l’existence d’une boucle de rétro-activation négative, entre deux miARN du polycistron miR-17-92 et trois facteurs de transcription de la famille E2F. E2F1, 2 et 3 induisent la transcription de miR-20 et miR-17 qui par la suite inhibent leur traduction. Nos résultats suggèrent l’implication de cette boucle dans la résistance à l’apoptose induite par E2F1 dans les cellules du cancer de la prostate, ce qui expliquerait en partie le potentiel oncogénique du polycistron miR-17-92. L’étude de ce motif de régulation nous a donc permis de réaliser le potentiel incroyable qu’ont les miARN à inhiber la traduction de plusieurs gènes. Basé sur les règles de reconnaissance des miARN, nous avons développé et validé MultiTar. Cet outil bioinformatique permet de trouver la séquence d’un miARN artificiel ayant le potentiel d’inhiber la traduction de gènes d’intérêts choisis par l’utilisateur. Afin de valider MultiTar, nous avons généré des multitargets pouvant inhiber l’expression des trois E2F, ce qui nous a permis de comparer leur efficacité à celle de miR-20. Nos miARN artificiels ont la capacité d’inhiber la traduction des E2F et de neutraliser leur fonction redondante de la progression du cycle cellulaire de façon similaire ou supérieur à miR-20. La fonctionnalité de notre programme, ouvre la voie à une stratégie flexible pouvant cibler le caractère multigénique de différents processus cellulaires ou maladies complexes, tel que le cancer. L’utilisation de miARN artificiels pourrait donc représenter une alternative intéressante aux stratégies déjà existantes, qui sont limitées à inhiber des cibles uniques. En plus d’élucider un réseau de régulation complexe impliquant les miARN, nous avons pu tirer profit de leur potentiel d’inhibition par la conception de miARN artificiels.

Étude de Necdin par un modèle de carcinogénèse lié à l’antigène grand T du Virus du polyome

Les virus sont utilisés depuis longtemps dans la recherche sur le cancer et ont grandement contribué à l’avancement des connaissances de même qu’à l’établissement de préceptes importants encore valables aujourd’hui dans le domaine. L’un des défis actuels est de mieux définir les étapes menant à la transition d’une cellule normale à une cellule transformée et c’est sur cette problématique que nous nous sommes penchés. Pour ce faire, nous avons tiré profit de l’utilisation de l’antigène grand-T du virus de polyome (PyLT), un virus capable d’induire des tumeurs chez les rongeurs. Cet oncogène viral à lui seul possède des propriétés intéressantes qui suggèrent que, en plus de l’immortalisation, il peut également contribuer aux événements précoces de la carcinogénèse. Ceci repose principalement sur la capacité de PyLT à induire des tumeurs en souris transgéniques et ce, avec une certaine latence ce qui suggère que des événements supplémentaires sont nécessaires. Ainsi, l’utilisation de PyLT dans un modèle de culture cellulaire permet de disséquer les changements qui lui sont attribuables. Dans un premier temps, l’établissement du profil d'expression génique associé à l'expression de PyLT dans un modèle murin nous a permis de sélectionner un bon nombre de gènes, parmi lesquels figurait Necdin. Nous avons choisi d’étudier Necdin plus en détail puisque peu d’attention était accordée à cette protéine dans le domaine du cancer, malgré que différentes données de la littérature lui suggèrent à la fois des fonctions suppresseurs de tumeur et oncogéniques. Nous avons démontré que, malgré sa fonction proposée de suppresseur de croissance, l’expression de Necdin n’est pas incompatible avec la prolifération dans la lignée cellulaire de souris NIH 3T3 et les cellules primaires humaines (IMR90), bien que l’inhibition de son expression par shARN confère un avantage prolifératif. Nous avons confirmé que Necdin est un gène cible de p53 induit par différents agents génotoxiques, toutefois son expression peut également être régulée de façon p53-indépendante. De plus, Necdin agit négativement sur l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à l’activation de p53. Ceci suggère que Necdin est impliqué dans une boucle de régulation négative de la voie de p53 et que l’augmentation anormale de l’expression de Necdin pourrait contribuer à la perturbation la voie du suppresseur de tumeur p53. L’activation de p53 permet l’arrêt transitoire du cycle cellulaire en condition de stress, mais est aussi impliquée dans l’établissement d’un arrêt permanent nommé sénescence. La sénescence est un mécanisme de protection contre l’accumulation de mutations qui peut contribuer à l’initiation du cancer. Vu l’intéressante implication de Necdin dans la régulation de l’activité de p53, nous avons transposé les connaissances acquises du modèle murin à un modèle humain, plus adapté pour l’étude de la sénescence. La caractérisation de l’expression de Necdin dans des fibroblastes primaires humains à différents passages montre que les jeunes cellules en prolifération active expriment Necdin et que son niveau diminue avec l’établissement de la sénescence réplicative. Le même phénomène est observé lors de la sénescence prématurée provoquée par l’expression d’un oncogène et par l’exposition aux radiations ionisantes. De plus, dans des conditions normales de prolifération, la modulation de Necdin par des essais de gain et de perte de fonction n’affecte pas la durée de vie des cellules primaires. Toutefois, en condition de stress génotoxique dû à l’exposition aux irradiations, les cellules surexprimant Necdin présentent une radiorésistance accrue de la même façon que lorsque p53 est inactivé directement. Ce résultat en cellules humaines vient appuyer l’effet observé dans les cellules de souris sur l’impact qu’aura le niveau de Necdin sur la réponse de p53 en condition de stress. Un bref survol a été fait pour aborder de quelle façon nos résultats en culture cellulaire pouvaient se traduire dans des modèles de cancer chez l’humain. Nous avons caractérisé l’expression de Necdin dans deux types différents de cancer. D’abord, dans le cancer de l’ovaire, le niveau élevé de Necdin dans les tumeurs à faible potentiel de malignité (LMP) en comparaison aux cancers agressifs de l’ovaire de type séreux suggère que l’expression de Necdin se limite aux cellules de cancer LMP, qui présente généralement un p53 de type sauvage. Son expression est aussi retrouvée dans deux lignées cellulaires du cancer de l’ovaire non-tumorigéniques en xénogreffe de souris, dont l’une possède un p53 fonctionnel. De plus, la caractérisation de Necdin dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate suggère une relation entre son expression et la présence de p53 fonctionnel. Dans le cancer de la prostate, tout comme pour le cancer de l’ovaire, Necdin semble être présent dans les lignées représentant un stade moins avancé de la maladie. L’utilisation de l’oncoprotéine virale PyLT nous a permis de révéler des propriétés intéressantes de Necdin. Nous proposons que dans certains contextes, l’expression constitutive de Necdin pourrait contribuer au cancer en retardant une réponse par p53 appropriée et possiblement en participant à l’augmentation de l’instabilité génomique. La fonction potentiellement oncogénique de Necdin quant à sa relation avec p53 que nous avons révélée requiert davantage d’investigation et les cancers caractérisés ici pourraient constituer de bons modèles à cette fin.

Sur un modèle d'érythropoïèse comportant un taux de mortalité dynamique

Ce mémoire concerne la modélisation mathématique de l’érythropoïèse, à savoir le processus de production des érythrocytes (ou globules rouges) et sa régulation par l’érythropoïétine, une hormone de contrôle. Nous proposons une extension d’un modèle d’érythropoïèse tenant compte du vieillissement des cellules matures. D’abord, nous considérons un modèle structuré en maturité avec condition limite mouvante, dont la dynamique est capturée par des équations d’advection. Biologiquement, la condition limite mouvante signifie que la durée de vie maximale varie afin qu’il y ait toujours un flux constant de cellules éliminées. Par la suite, des hypothèses sur la biologie sont introduites pour simplifier ce modèle et le ramener à un système de trois équations différentielles à retard pour la population totale, la concentration d’hormones ainsi que la durée de vie maximale. Un système alternatif composé de deux équations avec deux retards constants est obtenu en supposant que la durée de vie maximale soit fixe. Enfin, un nouveau modèle est introduit, lequel comporte un taux de mortalité augmentant exponentiellement en fonction du niveau de maturité des érythrocytes. Une analyse de stabilité linéaire permet de détecter des bifurcations de Hopf simple et double émergeant des variations du gain dans la boucle de feedback et de paramètres associés à la fonction de survie. Des simulations numériques suggèrent aussi une perte de stabilité causée par des interactions entre deux modes linéaires et l’existence d’un tore de dimension deux dans l’espace de phase autour de la solution stationnaire.

Autocrine loop in the purinergic control of airway surface liquid volume : monitoring with a novel side-view imaging technique

La Fibrose Kystique (FK) est une maladie dégénérative qui entraine une dégénération des poumons dû au problème de clairance mucociliaire (CMC). Le volume de surface liquide (SL) couvrant les cellules pulmonaires est essentiel à la clairance de mucus et au combat contre les infections. Les nucléotides extracellulaires jouent un rôle important dans la CMC des voies aériennes, en modifiant le volume de la SL pulmonaire. Cependant, les mécanismes du relâchement de l’ATP et de leurs déplacements à travers la SL, restent inconnus. Des études ultérieures démontrent que l’exocytose d’ATP mécano-sensible et Ca2+-dépendant, dans les cellules A549, est amplifié par les actions synergétiques autocrine/paracrine des cellules avoisinantes. Nous avions comme but de confirmer la présence de la boucle purinergique dans plusieurs modèles de cellules épithéliales et de développer un système nous permettant d’observer directement la SL. Nous avons démontrés que la boucle purinergique est fonctionnelle dans les modèles de cellules épithéliales examinés, mis appart les cellules Calu-3. L’utilisation de modulateur de la signalisation purinergique nous a permis d’observer que le relâchement d’ATP ainsi que l’augmentation du [Ca2+]i suivant un stress hypotonique, sont modulés par le biais de cette boucle purinergique et des récepteurs P2Y. De plus, nous avons développé un système de microscopie qui permet d’observer les changements de volume de SL en temps réel. Notre système permet de contrôler la température et l’humidité de l’environnement où se trouvent les cellules, reproduisant l’environnement pulmonaire humain. Nous avons démontré que notre système peut identifier même les petits changements de volume de SL.

Estime de soi et appropriation cognitive du feedback en contexte d’évaluation de potentiel : le rôle de la valence et de l’influence de la source

L’estime de soi joue un rôle central lorsqu’il est question de prédire les réactions des individus au feedback. En dépit de son influence indéniable sur les réactions des individus au feedback en contexte d’évaluation de potentiel, peu d’études se sont attardées aux facteurs pouvant en atténuer l’effet dans le cadre d’une telle démarche. Cette thèse vise à combler ce manque à travers deux articles empiriques répondant chacun à plusieurs objectifs de recherche. Dans cette optique, des données ont été amassées auprès de deux échantillons indépendants de candidats (étude 1, N = 111; étude 2, N = 153) ayant réalisé une évaluation de potentiel dans une firme-conseil spécialisée en psychologie industrielle. Le premier article vise à tester deux théories relatives à l’estime de soi s’affrontant lorsqu’il est question de prédire les réactions cognitives au feedback, la théorie de l’auto-valorisation et de l’auto-vérification. Pour mieux comprendre ce phénomène, l’influence de l’estime de soi et de la valence décisionnelle du feedback sur les deux composantes de l’appropriation cognitive du feedback en contexte d’évaluation, l’acceptation et la conscientisation, a été testé. Les résultats soutiennent les postulats de la théorie d’auto-valorisation lorsqu’il est question de prédire l’acceptation du feedback. En contrepartie, les résultats offrent peu de soutien à la théorie de l’auto-vérification dans la prédiction de la conscientisation à l’égard du feedback. Le second article vise à identifier des leviers modulables pour influencer favorablement les réactions des individus ayant une plus faible estime d’eux-mêmes. Pour ce faire, deux variables relatives à l’influence de la source ont été ciblées, la crédibilité perçue et les pratiques de confrontation constructive. Cet article comprend deux études, soit une première ayant pour objectif de valider un instrument mesurant la crédibilité perçue de la source et une seconde examinant les relations entre trois déterminants, soit l’estime de soi du candidat, la crédibilité perçue de la source et les pratiques de confrontation constructive, et deux réactions cognitives au feedback, l’acceptation et la conscientisation. Les analyses de la première étude font ressortir que l’échelle de crédibilité perçue présente des qualités psychométriques satisfaisantes et les résultats corroborent une structure unifactorielle. Les résultats de la seconde étude indiquent que les trois déterminants étudiés sont positivement reliés à l’acceptation et à la conscientisation. Les effets d’interaction significatifs font ressortir des conditions favorisant l’acceptation et la conscientisation chez les individus ayant une plus faible estime d’eux-mêmes. La crédibilité perçue atténue la relation entre l’estime de soi et l’acceptation alors que la confrontation constructive modère les relations entre l’estime de soi et, tant l’acceptation que la conscientisation. Enfin, la crédibilité perçue et la confrontation constructive interagissent dans la prédiction de la conscientisation, faisant ainsi ressortir l’importance d’établir sa crédibilité pour augmenter l’effet positif de la confrontation constructive. Les apports théorique et conceptuel de chacun des articles ainsi que les pistes d’intervention pratiques en découlant sont discutés séparément et repris dans une conclusion globale. Les retombées de cette thèse, tant sur le plan de la recherche que de l'intervention, sont également abordées dans cette dernière section.

The dynamics of sustained reentry in a loop model with discrete gap junction resistance

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Noticeability of corrective feedback, L2 development and learner beliefs

Cette étude quasi-expérimentale a pour but de 1) comparer la prise en compte et les effets de trois conditions rétroactives, à savoir la reformulation, l’incitation et un mélange des deux techniques, 2) déterminer le lien entre la prise en compte et l’apprentissage, et 3) identifier l’effet des perceptions des apprenants quant à la rétroaction corrective sur la prise en compte et l’apprentissage. Quatre groupes d’apprenants d’anglais langue seconde ainsi que leurs enseignants provenant d’un CEGEP francophone de l’île de Montréal ont participé à cette étude. Chaque enseignant a été assigné à une condition rétroactive expérimentale qui correspondait le plus à ses pratiques rétroactives habituelles. La chercheure a assuré l’intervention auprès du groupe contrôle. L’utilisation du passé et de la phrase interrogative était ciblée durant l’intervention expérimentale. Des protocoles de pensée à haute voie ainsi qu’un questionnaire ont été utilisés pour mesurer la prise en compte de la rétroaction corrective. Des tâches de description d’images et d’identification des différences entre les images ont été administrées avant l’intervention (pré-test), immédiatement après l’intervention (post-test immédiat) et 8 semaines plus tard (post-test différé) afin d’évaluer les effets des différentes conditions rétroactives sur l’apprentissage des formes cibles. Un questionnaire a été administré pour identifier les perceptions des apprenants quant à la rétroaction corrective. En termes de prise en compte, les résultats indiquent que les participants sont en mesure de remarquer la rétroaction dépendamment de la forme cible (les erreurs dans l’utilisation du passé sont détectées plus que les erreurs d’utilisation de la phrase interrogative) et de la technique rétroactive utilisée (l’incitation et le mélange d’incitation et de reformulations sont plus détectés plus que la reformulation). En ce qui a trait à l’apprentissage, l’utilisation du passé en général est marquée par plus de développement que celle de la phrase interrogative, mais il n'y avait aucune différence entre les groupes. Le lien direct entre la prise en compte et l’apprentissage ne pouvait pas être explicitement établi. Pendant que la statistique inférentielle a suggéré une relation minimale entre la prise en compte du passé et son apprentissage, mais aucune relation entre la prise en compte de la phrase interrogative et son apprentissage, les analyses qualitatives ont montrés à une association entre la prise en compte et l’apprentissage (sur les deux cibles) pour certains étudiants et augmentations sans prise en compte pour d'autres. Finalement, l’analyse factorielle du questionnaire indique la présence de quatre facteurs principaux, à savoir l’importance de la rétroaction corrective, la reformulation, l’incitation et les effets affectifs de la rétroaction. Deux de ces facteurs ont un effet modérateur sur la prise en compte de la rétroaction sans, toutefois, avoir d’impact sur l’apprentissage.

Le projet feedback : recherche d'un point de rencontre stylistique entre la musique électroacoustique glitch, le free jazz et le drone metal.

L’objectif principal de cette thèse de doctorat en composition consiste en la conceptualisation et création d’une oeuvre pour guitare électrique et dispositif électronique se situant à un point de rencontre stylistique entre le free jazz, la musique électro glitch et le drone métal. Le présent texte vise principalement à expliciter la démarche de création de cette oeuvre, intitulée feedback. À la suite du chapitre d'introduction qui décrit l'origine et les objectifs de ce projet de composition, le premier chapitre est consacré à une réflexion sur l'improvisation musicale. En partant d'une description générale de cette pratique et de ses origines, cinq manifestations de l'improvisation qui ont influencé l’oeuvre y sont décrites. Dans le deuxième chapitre est présentée l'hyperguitare qui a été développée pour la pièce ainsi que la description de ses composantes matérielles et logicielles. Dans le troisième chapitre sont décrits le contexte de création, le rôle de l’improvisation dans le processus de création et la description technique des quatre oeuvres composées en amont de feedback. Le quatrième chapitre est dédié à la pièce feedback inspirée de l'œuvre cinématographique et littéraire Fight Club et imprégnée, sur le plan stylistique, de la culture rock, du free jazz et de la musique électroacoustique glitch. En conclusion sont présentés les nouveaux objectifs que ces recherches ont engendrés.