Caractérisation d'une famille de récepteurs kinases impliqués dans le développement gamétophytique chez Arabidopsis thaliana

Au cours du développement des végétaux, de l’établissement de l’identité cellulaire des premiers organes au guidage du tube pollinique, la communication cellule à cellule est d’une importance capitale. En réponse, les voies de signalisation moléculaires sont élaborées pour la perception d’un signal extérieur et la transduction en une réponse génique via une cascade intracellulaire. Les récepteurs kinases font partie des protéines perceptrices des stimuli et constituent chez les plantes une catégorie de protéines avec une occurrence considérable, mais dont très peu d’informations détaillées sont disponibles à ce jour. Une famille de récepteurs kinases chez Arabidopsis thaliana, AtORK11 (Arabidopsis thaliana Ovule Receptor Kinase 11), a été identifiée par orthologie à un récepteur spécifique aux ovaires chez une solanacéee sauvage, Solanum chacoense. La fonction présumée de cette famille de récepteurs kinases de type leucine-rich repeat, suggérée par son patron d’expression, implique les événements relatifs au développement des gamétophytes et à la reproduction. Afin de caractériser la fonction des quatre gènes de la famille (AtORK11a, AtORK11b, AtORK11c et AtORK11d) une stratégie d’analyse de mutants d’insertion de l’ADN-T et d’évaluation du mode d’action par complémentation bimoléculaire par fluorescence (BiFC) a été entreprise. Aucune fonction précise n’a pu être attribuée aux doubles mutants d’insertion, par contre la surexpression d’une construction dominante négative indique un rôle dans le développement gamétophytique. Il a aussi été démontré que les quatre récepteurs peuvent interagir par homodimérisation aussi bien que par hétérodimérisation. Une hypothèse de redondance fonctionnelle est ainsi mise à jour parmi la famille des gènes AtORK11.

Algorithmes pour la réconciliation d’un arbre de gènes avec un arbre d’espèces

Une réconciliation entre un arbre de gènes et un arbre d’espèces décrit une histoire d’évolution des gènes homologues en termes de duplications et pertes de gènes. Pour inférer une réconciliation pour un arbre de gènes et un arbre d’espèces, la parcimonie est généralement utilisée selon le nombre de duplications et/ou de pertes. Les modèles de réconciliation sont basés sur des critères probabilistes ou combinatoires. Le premier article définit un modèle combinatoire simple et général où les duplications et les pertes sont clairement identifiées et la réconciliation parcimonieuse n’est pas la seule considérée. Une architecture de toutes les réconciliations est définie et des algorithmes efficaces (soit de dénombrement, de génération aléatoire et d’exploration) sont développés pour étudier les propriétés combinatoires de l’espace de toutes les réconciliations ou seulement les plus parcimonieuses. Basée sur le processus classique nommé naissance-et-mort, un algorithme qui calcule la vraisemblance d’une réconciliation a récemment été proposé. Le deuxième article utilise cet algorithme avec les outils combinatoires décrits ci-haut pour calculer efficacement (soit approximativement ou exactement) les probabilités postérieures des réconciliations localisées dans le sous-espace considéré. Basé sur des taux réalistes (selon un modèle probabiliste) de duplication et de perte et sur des données réelles/simulées de familles de champignons, nos résultats suggèrent que la masse probabiliste de toute l’espace des réconciliations est principalement localisée autour des réconciliations parcimonieuses. Dans un contexte d’approximation de la probabilité d’une réconciliation, notre approche est une alternative intéressante face aux méthodes MCMC et peut être meilleure qu’une approche sophistiquée, efficace et exacte pour calculer la probabilité d’une réconciliation donnée. Le problème nommé Gene Tree Parsimony (GTP) est d’inférer un arbre d’espèces qui minimise le nombre de duplications et/ou de pertes pour un ensemble d’arbres de gènes. Basé sur une approche qui explore tout l’espace des arbres d’espèces pour les génomes considérés et un calcul efficace des coûts de réconciliation, le troisième article décrit un algorithme de Branch-and-Bound pour résoudre de façon exacte le problème GTP. Lorsque le nombre de taxa est trop grand, notre algorithme peut facilement considérer des relations prédéfinies entre ensembles de taxa. Nous avons testé notre algorithme sur des familles de gènes de 29 eucaryotes.

Évolution de familles de gènes par duplications et pertes : algorithmes pour la correction d’arbres bruités

Les gènes sont les parties du génome qui codent pour les protéines. Les gènes d’une ou plusieurs espèces peuvent être regroupés en "familles", en fonction de leur similarité de séquence. Cependant, pour connaître les relations fonctionnelles entre ces copies de gènes, la similarité de séquence ne suffit pas. Pour cela, il est important d’étudier l’évolution d’une famille par duplications et pertes afin de pouvoir distinguer entre gènes orthologues, des copies ayant évolué par spéciation et susceptibles d’avoir conservé une fonction commune, et gènes paralogues, des copies ayant évolué par duplication qui ont probablement développé des nouvelles fonctions. Étant donnée une famille de gènes présents dans n espèces différentes, un arbre de gènes (obtenu par une méthode phylogénétique classique), et un arbre phylogénétique pour les n espèces, la "réconciliation" est l’approche la plus courante permettant d’inférer une histoire d’évolution de cette famille par duplications, spéciations et pertes. Le degré de confiance accordé à l’histoire inférée est directement relié au degré de confiance accordé à l’arbre de gènes lui-même. Il est donc important de disposer d’une méthode préliminaire de correction d’arbres de gènes. Ce travail introduit une méthodologie permettant de "corriger" un arbre de gènes : supprimer le minimum de feuilles "mal placées" afin d’obtenir un arbre dont les sommets de duplications (inférés par la réconciliation) sont tous des sommets de "duplications apparentes" et obtenir ainsi un arbre de gènes en "accord" avec la phylogénie des espèces. J’introduis un algorithme exact pour des arbres d’une certaine classe, et une heuristique pour le cas général.

Caractérisation du rôle et des mécanismes d’action des gènes Hoxa dans l’hématopoïèse adulte

Chez les humains, un large pourcentage de leucémies myéloïdes et lymphoïdes exprime des gènes Homéobox (Hox) de façon aberrante, principalement ceux du groupe des gènes Hoxa. Cette dérégulation de l’expression des gènes Hox peut provenir directement des translocations impliquant des gènes Hox ou indirectement par d’autres protéines ayant un potentiel oncogénique. De plus, plusieurs études indiquent que les gènes Hox jouent un rôle essentiel dans l'initiation de diverses leucémies. Comprendre le fonctionnement des gènes Hox dans l'hématopoïèse normale est donc une condition préalable pour élucider leurs fonctions dans les leucémies, ce qui pourrait éventuellement conduire à l’élaboration de nouveaux traitements contre cette maladie. Plusieurs études ont tenté d’élucider les rôles exacts des gènes Hox dans l'hématopoïèse via l’utilisation de souris mutantes pour un seul gène Hox. Or, en raison du phénomène de redondance fonctionnelle chez cette famille de gènes, ces études ont été peu concluantes. Il a été précédemment démontré que dans une population de cellules enrichies en cellules souches hématopoïétiques (CSH), les gènes du cluster Hoxa sont plus exprimés que les gènes Hox des autres clusters. Aussi, il a été établi que les gènes du cluster Hoxb sont non essentiels à l’hématopoïèse définitive puisque les CSH mutantes pour les gènes Hoxb1-9 conservent leur potentiel de reconstitution à long terme. En nous basant sur ces données, nous avons émis l'hypothèse suivante : les gènes Hoxa sont essentiels pour l'hématopoïèse normale adulte. Pour tester notre hypothèse, nous avons choisi d’utiliser un modèle de souris comportant une délétion pour l’ensemble des gènes Hoxa. Dans le cadre de cette recherche, nous avons démontré que les CSH, les progéniteurs primitifs et les progéniteurs des cellules B sont particulièrement sensibles au niveau d'expression des gènes Hoxa. Plus particulièrement, une baisse de la survie et une différenciation prématurée semblent être à l’origine de la perte des CSH Hoxa-/- dans la moelle osseuse. L’analyse du profil transcriptionnel des CSH par séquençage de l'ARN a révélé que les gènes Hoxa sont capables de réguler un vaste réseau de gènes impliqués dans divers processus biologiques. En effet, les gènes Hoxa régulent l’expression de plusieurs gènes codant pour des récepteurs de cytokine. De plus, les gènes Hoxa influencent l’expression de gènes jouant une fonction dans l’architecture de la niche hématopoïétique. L’expression de plusieurs molécules d’adhésion est aussi modulée par les gènes Hoxa, ce qui peut affecter la relation des CSH avec la niche hématopoïétique. L’ensemble de ces résultats démontre que les gènes Hoxa sont d'importants régulateurs de l'hématopoïèse adulte puisqu’ils sont nécessaires au maintien des CSH et des progéniteurs grâce à leurs effets sur plusieurs processus biologiques comme l'apoptose, le cycle cellulaire et les interactions avec la niche.

Algorithmes de construction et correction d'arbres de gènes par la réconciliation

Les gènes, qui servent à encoder les fonctions biologiques des êtres vivants, forment l'unité moléculaire de base de l'hérédité. Afin d'expliquer la diversité des espèces que l'on peut observer aujourd'hui, il est essentiel de comprendre comment les gènes évoluent. Pour ce faire, on doit recréer le passé en inférant leur phylogénie, c'est-à-dire un arbre de gènes qui représente les liens de parenté des régions codantes des vivants. Les méthodes classiques d'inférence phylogénétique ont été élaborées principalement pour construire des arbres d'espèces et ne se basent que sur les séquences d'ADN. Les gènes sont toutefois riches en information, et on commence à peine à voir apparaître des méthodes de reconstruction qui utilisent leurs propriétés spécifiques. Notamment, l'histoire d'une famille de gènes en terme de duplications et de pertes, obtenue par la réconciliation d'un arbre de gènes avec un arbre d'espèces, peut nous permettre de détecter des faiblesses au sein d'un arbre et de l'améliorer. Dans cette thèse, la réconciliation est appliquée à la construction et la correction d'arbres de gènes sous trois angles différents: 1) Nous abordons la problématique de résoudre un arbre de gènes non-binaire. En particulier, nous présentons un algorithme en temps linéaire qui résout une polytomie en se basant sur la réconciliation. 2) Nous proposons une nouvelle approche de correction d'arbres de gènes par les relations d'orthologie et paralogie. Des algorithmes en temps polynomial sont présentés pour les problèmes suivants: corriger un arbre de gènes afin qu'il contienne un ensemble d'orthologues donné, et valider un ensemble de relations partielles d'orthologie et paralogie. 3) Nous montrons comment la réconciliation peut servir à "combiner'' plusieurs arbres de gènes. Plus précisément, nous étudions le problème de choisir un superarbre de gènes selon son coût de réconciliation.

Approches algorithmiques pour l’inférence d’histoires de duplication en tandem avec inversions et délétions pour des familles multigéniques

[Français] Une fraction importante des génomes eucaryotes est constituée de Gènes Répétés en Tandem (GRT). Un mécanisme fondamental dans l’évolution des GRT est la recombinaison inégale durant la méiose, entrainant la duplication locale (en tandem) de segments chromosomiques contenant un ou plusieurs gènes adjacents. Différents algorithmes ont été proposés pour inférer une histoire de duplication en tandem pour un cluster de GRT. Cependant, leur utilisation est limitée dans la pratique, car ils ne tiennent pas compte d’autres événements évolutifs pourtant fréquents, comme les inversions, les duplications inversées et les délétions. Cette thèse propose différentes approches algorithmiques permettant d’intégrer ces événements dans le modèle de duplication en tandem classique. Nos contributions sont les suivantes: • Intégrer les inversions dans un modèle de duplication en tandem simple (duplication d’un gène à la fois) et proposer un algorithme exact permettant de calculer le nombre minimal d’inversions s’étant produites dans l’évolution d’un cluster de GRT. • Généraliser ce modèle pour l’étude d’un ensemble de clusters orthologues dans plusieurs espèces. • Proposer un algorithme permettant d’inférer l’histoire évolutive d’un cluster de GRT en tenant compte des duplications en tandem, duplications inversées, inversions et délétions de segments chromosomiques contenant un ou plusieurs gènes adjacents.

Role of the homeodomain transcription factor Hoxa13 in embryonic development and formation of extra-embryonic structures

La famille des gènes Hox code pour des facteurs de transcription connus pour leur contribution essentielle à l’élaboration de l’architecture du corps et ce, au sein de tout le règne animal. Au cours de l’évolution chez les vertébrés, les gènes Hox ont été redéfinis pour générer toute une variété de nouveaux tissus/organes. Souvent, cette diversification s’est effectuée via des changements quant au contrôle transcriptionnel des gènes Hox. Chez les mammifères, la fonction de Hoxa13 n’est pas restreinte qu’à l’embryon même, mais s’avère également essentielle pour le développement de la vascularisation fœtale au sein du labyrinthe placentaire, suggérant ainsi que sa fonction au sein de cette structure aurait accompagné l’émergence des espèces placentaires. Au chapitre 2, nous mettons en lumière le recrutement de deux autres gènes Hoxa, soient Hoxa10 et Hoxa11, au compartiment extra-embryonnaire. Nous démontrons que l’expression de Hoxa10, Hoxa11 et Hoxa13 est requise au sein de l’allantoïde, précurseur du cordon ombilical et du système vasculaire fœtal au sein du labyrinthe placentaire. De façon intéressante, nous avons découvert que l’expression des gènes Hoxa10-13 dans l’allantoïde n’est pas restreinte qu’aux mammifères placentaires, mais est également présente chez un vertébré non-placentaire, indiquant que le recrutement des ces gènes dans l’allantoïde précède fort probablement l’émergence des espèces placentaires. Nous avons généré des réarrangements génétiques et utilisé des essais transgéniques pour étudier les mécanismes régulant l’expression des gènes Hoxa dans l’allantoïde. Nous avons identifié un fragment intergénique de 50 kb capable d’induire l’expression d’un gène rapporteur dans l’allantoïde. Cependant, nous avons trouvé que le mécanisme de régulation contrôlant l’expression du gène Hoxa au sein du compartiment extra-embryonnaire est fort complexe et repose sur plus qu’un seul élément cis-régulateur. Au chapitre 3, nous avons utilisé la cartographie génétique du destin cellulaire pour évaluer la contribution globale des cellules exprimant Hoxa13 aux différentes structures embryonnaires. Plus particulièrement, nous avons examiné plus en détail l’analyse de la cartographie du destin cellulaire de Hoxa13 dans les pattes antérieures en développement. Nous avons pu déterminer que, dans le squelette du membre, tous les éléments squelettiques de l’autopode (main), à l’exception de quelques cellules dans les éléments carpiens les plus proximaux, proviennent des cellules exprimant Hoxa13. En contraste, nous avons découvert que, au sein du compartiment musculaire, les cellules exprimant Hoxa13 et leurs descendantes (Hoxa13lin+) s’étendent à des domaines plus proximaux du membre, où ils contribuent à générer la plupart des masses musculaires de l’avant-bras et, en partie, du triceps. De façon intéressante, nous avons découvert que les cellules exprimant Hoxa13 et leurs descendantes ne sont pas distribuées uniformément parmi les différents muscles. Au sein d’une même masse musculaire, les fibres avec une contribution Hoxa13lin+ différente peuvent être identifiées et les fibres avec une contribution semblable sont souvent regroupées ensemble. Ce résultat évoque la possibilité que Hoxa13 soit impliqué dans la mise en place de caractéristiques spécifiques des groupes musculaires, ou la mise en place de connections nerf-muscle. Prises dans leur ensemble, les données ici présentées permettent de mieux comprendre le rôle de Hoxa13 au sein des compartiments embryonnaires et extra-embryonnaires. Par ailleurs, nos résultats seront d’une importance primordiale pour soutenir les futures études visant à expliquer les mécanismes transcriptionnels soutenant la régulation des gènes Hoxa dans les tissus extra-embryonnaires.

Implication des peptides RALFs dans les communications cellulaires lors du développement du gamétophyte femelle chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Chez les angiospermes, la reproduction passe par la double fécondation. Le tube pollinique délivre deux cellules spermatiques au sein du gamétophyte femelle. Une cellule féconde la cellule œuf pour produire un zygote; l’autre féconde la cellule centrale pour produire l’endosperme. Pour assurer un succès reproductif, le développement du gamétophyte femelle au sein de l’ovule doit établir un patron cellulaire qui favorise les interactions avec le tube pollinique et les cellules spermatiques. Pour ce faire, un dialogue doit s’établir entre les différentes cellules de l’ovule lors de son développement, de même que lors de la fécondation. D’ailleurs, plusieurs types de communications intercellulaires sont supposées suite à la caractérisation de plusieurs mutants développementaux. De même, ces communications semblent persister au sein du zygote et de l’endosperme pour permettre la formation d’un embryon viable au sein de la graine. Malgré les développements récents qui ont permis de trouver des molécules de signalisation supportant les modèles d’interactions cellulaires avancés par la communauté scientifique, les voies de signalisation sont de loin très incomplètes. Dans le but de caractériser des gènes encodant des protéines de signalisation potentiellement impliqués dans la reproduction chez Solanum chacoense, l’analyse d’expression des gènes de type RALF présents dans une banque d’ESTs (Expressed Sequence Tags) spécifiques à l’ovule après fécondation a été entreprise. RALF, Rapid Alcalinization Factor, est un peptide de 5 kDa qui fait partie de la superfamille des «protéines riches en cystéines (CRPs)», dont les rôles physiologiques au sein de la plante sont multiples. Cette analyse d’expression a conduit à une analyse approfondie de ScRALF3, dont l’expression au sein de la plante se limite essentiellement à l’ovule. L’analyse de plantes transgéniques d’interférence pour le gène ScRALF3 a révélé un rôle particulier lors de la mégagamétogénèse. Les plantes transgéniques présentent des divisions mitotiques anormales qui empêchent le développement complet du sac embryonnaire. Le positionnement des noyaux, de même que la synchronisation des divisions au sein du syncytium, semblent responsables de cette perte de progression lors de la mégagamétogénèse. L’isolement du promoteur de même que l’analyse plus précise d’expression au sein de l’ovule révèle une localisation sporophytique du transcrit. La voie de signalisation de l’auxine régule également la transcription de ScRALF3. De surcroît, ScRALF3 est un peptide empruntant la voie de sécrétion médiée par le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. En somme, ScRALF3 est un important facteur facilitant la communication entre le sporophyte et le gamétophyte pour amener à maturité le sac embryonnaire. L’identification d’un orthologue potentiel chez Arabidopsis thaliana a conduit à la caractérisation de AtRALF34. L’absence de phénotype lors du développement du sac embryonnaire suggère, cependant, de la redondance génétique au sein de la grande famille des gènes de type RALF. Néanmoins, les peptides RALFs apparaissent comme d’importants régulateurs lors de la reproduction chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Analyse génétique de la fonction du gène Polycomb Bmi1 dans le développement et la survie des photorécepteurs chez la souris.

La rétine est constituée de plusieurs types de neurones incluant les cellules amacrines, ganglionnaires, bipolaires et les photorécepteurs. Les photorécepteurs, qui englobent les cônes et les bâtonnets, sont des neurones sensoriels hautement spécialisés qui permettent la conversion de la lumière en signaux électriques par le mécanisme de phototransduction. Les mécanismes moléculaires par lesquels les progéniteurs rétiniens (RPCs) se différencient en différents neurones spécialisés comme les photorécepteurs sont encore peu connus. Le gène Polycomb Bmi1 appartient à la famille des gènes Polycomb qui forment des complexes multimériques impliqués dans la répression de l’expression génique via le remodelage de la chromatine. Au niveau biologique, le gène Bmi1 régule, entre autre, le contrôle de la prolifération cellulaire, le métabolisme des radicaux libres, et la réparation de l’ADN. Récemment, il a été démontré que Bmi1 joue un rôle critique dans la prolifération et l’auto-renouvellement d’un groupe de RPCs immatures. De plus, Bmi1 est essentiel au développement post-natal de la rétine. L'objectif de cette étude est d'analyser le rôle de Bmi1 dans le développement et la survie des photorécepteurs chez la souris. Nos résultats révèlent un phénotype de dégénérescence des photorécepteurs de types cônes chez notre modèle de souris déficiente pour Bmi1. Les bâtonnets sont insensibles à la mutation. De plus, Bmi1 est exprimé de façon prédominante dans les cônes. Nos expériences de culture de cellules rétiniennes suggèrent que le phénotype est cellule-autonome. Par ailleurs, la co-délétion du gène Chk2, membre de la réponse aux dommages à l'ADN, permet de ralentir la progression du phénotype. Les rétines Bmi1-/- et Bmi1-/-Chk2-/- présentent une augmentation importante des dommages oxydatifs à l'ADN. Ces résultats suggèrent que le stress oxydatif pourrait jouer un rôle important dans la survie des cônes. L'étude du rôle du gène Polycomb Bmi1 dans les photorécepteurs est importante pour une meilleure compréhension des mécanismes contribuant à la survie des cônes et pourrait mener à la découverte de nouveaux traitements des maladies dégénératives des cônes.

Le rôle de sirtuine 3 dans la rétinopathie du prématuré

Dans les pays industrialisés, les rétinopathies ischémiques proliférantes telles que la rétinopathie diabétique et la rétinopathie du prématuré sont les principales causes de cécité chez les individus en âge de travailler et la population pédiatrique. Ces pathologies sont caractérisées par une dégénérescence microvasculaire initiale suivie d’une hyper-vascularisaton compensatoire disproportionnée et pathologique. Les sirtuines constituent une importante famille de protéines impliquées dans le métabolisme et la réponse au stress. Plus particulièrement, sirtuine 3 (SIRT3) est une déacétylase mitochondriale primordiale qui agit au cœur du métabolisme énergétique et de l’activation de nombreuses voies métaboliques oxydatives. Nos résultats démontrent pour la première fois qu’une déficience en SIRT3 diminue la sévérité des lésions vasculaires dans le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR). En plus de stimuler l’angiogénèse, l’absence de SIRT3 est aussi associée à une augmentation de la glycolyse, possiblement en activant la famille de gènes 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFKFB). Nous suggérons que le manque de SIRT3 est impliqué dans l’effet Warburg et procure ainsi un avantage prolifératif et protecteur dans l’OIR. La présente étude propose SIRT3 comme nouvelle cible thérapeutique potentielle dans la rétinopathie du prématuré, une maladie dont les complications désastreuses persistent tout au long de la vie.

Implication des gènes de la famille Bcl-2 dans l'apoptose des hépatocytes chez le rat Long-Evans Cinnamon

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Identification de mutations dans les gènes de la famille des synapsines chez des individus avec épilepsie, dyslexie ou autisme

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mode de vie, habitudes alimentaires et cancer du sein: Étude cas-témoins chez les Canadiennes-françaises non porteuses de mutations des gènes BRCA

Le cancer du sein (CS) est la deuxième cause de décès liés au cancer parmi les femmes dans la plupart des pays industrialisés. Les personnes qui ont le CS peuvent ne pas hériter des mutations causant le cancer de leurs parents. Ainsi, certaines cellules subissent des mutations qui mènent au cancer. Dans le cas de cancer héréditaire, les cellules tumorales contiennent généralement des mutations qui ne sont pas trouvées ailleurs dans l'organisme, mais peuvent maintenir des mutations qui vont répartir dans toutes les cellules. La genèse du CS est le résultat des mutations de gènes qui assurent la régulation de la prolifération cellulaire et la réparation de l’ADN. Deux gènes semblent particulièrement concernés par les mutations. Les gènes ‘Breast Cancer 1’ (BRCA1) et ‘Breast Cancer 2’ (BRCA2), sont impliqués dans la prédisposition génétique de CS. On estime que 5-10% des cas de cancer du sein sont attribuables à une prédisposition génétique. La plupart de ces cancers sont liés à une anomalie du gène BRCA1 ou BRCA2. Plusieurs études ont été menées chez les femmes atteintes de CS sporadique et quelques études se sont concentrées sur celles qui sont porteuses de mutations de BRCA. Alors, notre recherche a été entreprise afin de vérifier l’hypothèse d’une association entre le CS, le mode vie et les habitudes alimentaires chez les Canadiennes-françaises non porteuses des 6 mutations de BRCA les plus fréquentes parmi cette population. Nous avons mené une étude cas-témoins dans cette population. Quelque 280 femmes atteintes du cancer du sein et non-porteuses de mutations de BRCA, ont été recrutées en tant que cas. Les témoins étaient recrutés parmi les membres de la famille des cas (n=15) ou à partir d'autres familles atteintes de CS (n=265). Les participantes étaient de tous âges, recrutées à partir d’une étude de cohorte qui est actuellement en cours, menée par une équipe de chercheurs au Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (CHUM) Hôtel-Dieu à Montréal. Les apports alimentaires ont été recueillis par un questionnaire de fréquence semi-quantitatif validé et administré par une nutritionniste, qui portait sur la période avant les deux ans précédant le premier diagnostic de CS pour les cas et la période avant les deux ans précédant l’entrevue téléphonique pour les témoins. Un questionnaire de base était administré par l’infirmière de recherche aux participantes afin de colliger des renseignements sociodémographiques et sur les facteurs de risque du CS. Une association positive et significative a été détectée entre l’âge (plus de 50 ans) auquel les sujets avaient atteint leur Indice de Masse Corporel (IMC) le plus élevé et le CS rapport de cotes (OR) =2,83; intervalle de confiance à 95% (IC95%) (2,34-2,91). De plus, une association positive a été détectée entre un gain de poids de >34 lbs comparativement à un gain de poids de ≤15 lbs, dès l’âge de 20 ans OR=1,68; IC95% (1,10-2,58). Un gain de poids de >24 lbs comparativement à un gain de poids de ≤9 lbs, dès l’âge de 30 ans a aussi montré une augmentation de risque de CS OR=1,96; IC95% (1,46-3,06). Une association positive a aussi été détecté entre, un gain de poids de >12 lbs comparativement à un gain de poids de ≤1 lb, dès l’âge de 40 ans OR=1,91; IC95% (1,53-2,66). Concernant le tabagisme, nous avons observé une association positive et significative reliée à la consommation de plus de 9 paquets-années OR = 1,59; IC95% (1,57-2,87). Il fut suggéré que l’activité physique modéré confère une protection contre le CS: une pratique de > 24,8 (‘metabolic equivalent’) MET-hrs par semaine par rapport à ≤10,7 MET-hrs par semaine, diminue le risque du CS de 52% OR = 0,48 ; IC95% (0,31-0,74). L’activité physique totale (entre 16,2 et 33,2 MET-hrs par semaine), a aussi montré une réduction de risque de CS de 43% OR = 0,57 ; IC95% (0,37-0,87). Toutefois, il n'y avait aucune association entre une activité physique vigoureuse et le risque de CS. L’analyse portant sur les macro- et micro-nutriments et les groupes alimentaires a montré qu’un apport en énergie totale de plus de 2057 Kcal par jour augmentait le risque de CS de 2,5 fois OR = 2,54; IC95% (1,67-3,84). En ce qui concerne la consommation de café, les participantes qui buvaient plus de 8 tasses de café par jour avaient un risque de CS augmenté de 40% OR = 1,40; IC95% (1,09-2,24). Les sujets ayant une consommation dépassant 9 g d’alcool (éthanol) par jour avaient également un risque élevé de 55% OR = 1,55; IC95% (1,02-2,37). De plus, une association positive et significative a été détectée entre le CS et la consommation de plus de deux bouteilles de bière par semaine OR = 1,34; IC95% (1,28-2,11), 10 onces de vin par semaine OR = 1,16; IC95% (1,08-2,58) ou 6 onces de spiritueux par semaine OR = 1,09; IC95% (1,02-2,08), respectivement. En résumé, les résultats de cette recherche supportent l’hypothèse selon laquelle le mode de vie et les habitudes alimentaires jouent un rôle important dans l’étiologie de CS chez les Canadiennes-françaises non porteuses de mutations de BRCA. Les résultats nous permettent de constater que le gain de poids et le tabagisme sont liés à des risques élevés de CS, tandis que l'activité physique modérée aide à réduire ce risque. De plus, nos résultats suggèrent qu’un apport énergétique total relativement élevé et une consommation élevée de café et d'alcool peuvent accroître le risque de ce cancer. Ce travail a permis de mettre l’accent sur une nouvelle direction de recherche, jusqu'à présent non investiguée. Les résultats de ce travail de recherche pourraient contribuer à recueillir de nouvelles informations et des conseils pouvant influencer et aider la population à modifier son mode de vie et ses habitudes alimentaires afin de diminuer le risque de cancer du sein.

Les gènes et protéines BSP chez la souris et l’humain : clonage, caractérisation, expression sous forme recombinante et étude des fonctions biologiques

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins.

Caractérisation clinique et génétique d’une famille canadienne-française atteinte de la neuropathie héréditaire sensitive avec rétinite pigmentaire et ataxie

La complexité de l’étude des neuropathies héréditaires provient de leur hétérogénéité clinique et génétique et de la diversité des fibres composant les nerfs périphériques. Cette complexité se reflète dans les nombreuses classifications différentes. Les neuropathies héréditaires se classifient entre autres selon leur mode de transmission et leur atteinte sensitive, autonomique et motrice. Les neuropathies héréditaires sensitives et autonomiques (NHSA) se présentent avec une perte de la sensation distale aux membres, accompagnée d’autres manifestations selon le type de NHSA. L’étude des NHSA est facilitée lorsqu’il existe des grappes de familles originaires de régions du Québec où des effets fondateurs pour des maladies récessives ont déjà été identifiés. Nous avons recruté une grande famille canadienne-française originaire de Paspébiac dans la Baie-des-Chaleurs dans laquelle nous avons identifié quatre cas atteints d’une neuropathie héréditaire sensitive avec rétinite pigmentaire et ataxie (NHSRPA). Nous avons émis l’hypothèse que nous étions en présence d’une nouvelle forme de neuropathie héréditaire sensitive récessive à effet fondateur. Afin d’identifier la position chromosomique du gène muté responsable de la NHSRPA, nous avons tout d’abord complété un criblage du génome en génotypant des marqueurs microsatellites «single tandem repeat» (STR) sur des individus clés et nous avons ensuite procédé à une analyse de liaison génétique paramétrique. Ces études nous ont permis de lier cette famille au chromosome 1 et de définir un premier intervalle candidat de 6,7 Mb. Grâce à un génotypage de marqueurs «single nucleotide polymorphism» (SNP), nous avons réduit l’intervalle candidat à 5,3 Mb au locus 1q32,2-q32,3. Cette région contient 44 gènes candidats. Une revue plus fine de la littérature a fait ressortir qu’une famille espagnole et une américaine de souche hollandaise souffrant de la même maladie avaient déjà été liées au même locus. L’origine possiblement basque de notre famille gaspésienne nous a poussé à comparer l’haplotype porteur avec celui de la famille espagnole qui, quoi que gitane, provient du pays basque espagnol. Ces travaux ont démontré le partage d’une région de 203 kb. Afin de rétrécir davantage notre intervalle candidat, nous avons comparé les haplotypes des cas entre les deux familles et nous avons identifié un dernier intervalle candidat de 60 SNP au locus 1q32,3. Cette région ne contient que quatre gènes candidats dont le plus intéressant est le gène «activating transcription factor» (ATF3). À ce jour, aucune mutation n’a été trouvée dans le gène ATF3 et les gènes FAM71A, BATF3 et NSL1. Des expériences supplémentaires sont nécessaires afin d’identifier le gène muté responsable de la NHSRPA.