The role of GAPDH in maintaining the functional state of the DNA repair enzyme APE1

Les sites apuriniques/apyrimidiniques (AP) sont des sites de l’ADN hautement mutagène. Les dommages au niveau de ces sites peuvent survenir spontanément ou être induits par une variété d’agents. Chez l’humain, les sites AP sont réparés principalement par APE1, une enzyme de réparation de l’ADN qui fait partie de la voie de réparation par excision de base (BER). APE1 est une enzyme multifonctionnelle; c’est une AP endonucléase, 3’-diestérase et un facteur redox impliqué dans l’activation des facteurs de transcription. Récemment, il a été démontré qu’APE1 interagit avec l’enzyme glycolytique GAPDH. Cette interaction induit l’activation d’APE1 par réduction. En outre, la délétion du gène GAPDH sensibilise les cellules aux agents endommageant l’ADN, induit une augmentation de formation spontanée des sites AP et réduit la prolifération cellulaire. A partir de toutes ces données, il était donc intéressant d’étudier l’effet de la délétion de GAPDH sur la progression du cycle cellulaire, sur la distribution cellulaire d’APE1 et d’identifier la cystéine(s) d’APE1 cible(s) de la réduction par GAPDH. Nos travaux de recherche ont montré que la déficience en GAPDH cause un arrêt du cycle cellulaire en phase G1. Cet arrêt est probablement dû à l’accumulation des dommages engendrant un retard au cours duquel la cellule pourra réparer son ADN. De plus, nous avons observé des foci nucléaires dans les cellules déficientes en GAPDH qui peuvent représenter des agrégats d’APE1 sous sa forme oxydée ou bien des focis de la protéine inactive au niveau des lésions d’ADN. Nous avons utilisé la mutagénèse dirigée pour créer des mutants (Cys en Ala) des sept cystéines d’APE1 qui ont été cloné dans un vecteur d’expression dans les cellules de mammifères. Nous émettons l’hypothèse qu’au moins un mutant ou plus va être résistant à l’inactivation par oxydation puisque l’alanine ne peut pas s’engager dans la formation des ponts disulfures. Par conséquent, on anticipe que l’expression de ce mutant dans les cellules déficientes en GAPDH pourrait restaurer une distribution cellulaire normale de APE1, libérerait les cellules de l’arrêt en phase G1 et diminuerait la sensibilité aux agents endommageant l’ADN. En conclusion, il semble que GAPDH, en préservant l’activité d’APE1, joue un nouveau rôle pour maintenir l’intégrité génomique des cellules aussi bien dans les conditions normales qu’en réponse au stress oxydatif.

Characterization of the AP endonuclease enzyme APN-1 from C. elegans

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Développement d'un microréacteur à base d'enzyme protéolytique réticulée avec le glutaraldéhyde pour la cartographie peptidique

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Cardiovascular and sensory abnormalities in a rat model of insulin resistance : beneficial effect of an antioxidant and an angiotensin-1 converting enzyme inhibitor

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Fabrication, caractérisation et étude électrochimique de microcapsules conductrices à base de dérivés carbazole aminés pour la conception de biopiles enzymatiques

L’objectif général de cette thèse est de développer une plateforme d’immobilisation d’enzymes efficace pour application en biopile. Grâce à la microencapsulation ainsi qu’au choix judicieux des matériaux polymériques pour la fabrication de la plateforme d’immobilisation, l’efficacité du transfert électronique entre l’enzyme encapsulée et l’électrode serait amélioré. Du même coup, les biopiles employant cette plateforme d’immobilisation d’enzymes pourrait voir leur puissance délivrée être grandement augmentée et atteindre les niveaux nécessaires à l’alimentation d’implants artificiels pouvant remplacer des organes telque le pancréas, les reins, le sphincter urinaire et le coeur. Dans un premier temps, le p-phénylènediamine a été employé comme substrat pour la caractérisation de la laccase encapsulée dans des microcapsules de poly(éthylèneimine). La diffusion de ce substrat à travers les microcapsules a été étudiée sous diverses conditions par l’entremise de son oxidation électrochimique et enzymatique afin d’en évaluer sa réversibilité et sa stabilité. La voltampérométrie cyclique, l’électrode à disque tournante (rotating disk electrode - RDE) et l’électrode à O2 ont été les techniques employées pour cette étude. Par la suite, la famille des poly(aminocarbazoles) et leurs dérivés a été identifée pour remplacer le poly(éthylèneimine) dans la conception de microcapsules. Ces polymères possèdent sur leurs unités de répétition (mono- ou diamino) des amines primaires qui seraient disponibles lors de la polymérisation interfaciale avec un agent réticulant tel qu’un chlorure de diacide. De plus, le 1,8-diaminocarbazole (unité de répétition) possède, une fois polymérisé, les propriétés électrochimiques recherchées pour un transfert d’électrons efficace entre l’enzyme et l’électrode. Il a toutefois été nécessaire de développer une route de synthèse afin d’obtenir le 1,8-diaminocarbazole puisque le protocole de synthèse disponible dans la littérature a été jugé non viable pour être utilisé à grande échelle. De plus, aucun protocole de synthèse pour obtenir du poly(1,8-diaminocarbazole) directement n’a été trouvé. Ainsi, deux isomères de structure (1,6 et 1,8-diaminocarbazole) ont pu être synthétisés en deux étapes. La première étape consistait en une substitution électrophile du 3,6-dibromocarbazole en positions 1,8 et/ou 1,6 par des groupements nitro. Par la suite, une réaction de déhalogénation réductive à été réalisée en utilisant le Et3N et 10% Pd/C comme catalyseur dans le méthanol sous atmosphère d’hydrogène. De plus, lors de la première étape de synthèse, le composé 3,6-dibromo-1-nitro-carbazole a été obtenu; un monomère clé pour la synthèse du copolymère conducteur employé. Finalement, la fabrication de microcapsules conductrices a été réalisée en incorporant le copolymère poly[(9H-octylcarbazol-3,6-diyl)-alt-co-(2-amino-9H-carbazol-3,6-diyl)] au PEI. Ce copolymère a pu être synthétisé en grande quantité pour en permettre son utilisation lors de la fabrication de microcapsules. Son comportement électrochimique s’apparentait à celui du poly(1,8-diaminocarbazole). Ces microcapsules, avec laccase encapsulée, sont suffisamment perméables au PPD pour permettre une activité enzymatique détectable par électrode à O2. Par la suite, la modification de la surface d’une électrode de platine a pu être réalisée en utilisant ces microcapsules pour l’obtention d’une bioélectrode. Ainsi, la validité de cette plateforme d’immobilisation d’enzymes développée, au cours de cette thèse, a été démontrée par le biais de l’augmentation de l’efficacité du transfert électronique entre l’enzyme encapsulée et l’électrode.

Development of an enzyme immobilization platform based on microencapsulation for paper-based biosensors

Un papier bioactif est obtenu par la modification d’un papier en y immobilisant une ou plusieurs biomolécules. La recherche et le développement de papiers bioactifs est en plein essor car le papier est un substrat peu dispendieux qui est déjà d’usage très répandu à travers le monde. Bien que les papiers bioactifs n’aient pas connus de succès commercial depuis la mise en marche de bandelettes mesurant le taux de glucose dans les années cinquante, de nombreux groupes de recherche travaillent à immobiliser des biomolécules sur le papier pour obtenir un papier bioactif qui est abordable et possède une bonne durée de vie. Contrairement à la glucose oxidase, l’enzyme utilisée sur ces bandelettes, la majorité des biomolécules sont très fragiles et perdent leur activité très rapidement lorsqu’immobilisées sur des papiers. Le développement de nouveaux papiers bioactifs pouvant détecter des substances d’intérêt ou même désactiver des pathogènes dépend donc de découverte de nouvelles techniques d’immobilisation des biomolécules permettant de maintenir leur activité tout en étant applicable dans la chaîne de production actuelle des papiers fins. Le but de cette thèse est de développer une technique d’immobilisation efficace et versatile, permettant de protéger l’activité de biomolécules incorporées sur des papiers. La microencapsulation a été choisie comme technique d’immobilisation car elle permet d’enfermer de grandes quantités de biomolécules à l’intérieur d’une sphère poreuse permettant leur protection. Pour cette étude, le polymère poly(éthylènediimine) a été choisi afin de générer la paroi des microcapsules. Les enzymes laccase et glucose oxidase, dont les propriétés sont bien établies, seront utilisées comme biomolécules test. Dans un premier temps, deux procédures d’encapsulation ont été développées puis étudiées. La méthode par émulsion produit des microcapsules de plus petits diamètres que la méthode par encapsulation utilisant un encapsulateur, bien que cette dernière offre une meilleure efficacité d’encapsulation. Par la suite, l’effet de la procédure d’encapsulation sur l’activité enzymatique et la stabilité thermique des enzymes a été étudié à cause de l’importance du maintien de l’activité sur le développement d’une plateforme d’immobilisation. L’effet de la nature du polymère utilisé pour la fabrication des capsules sur la conformation de l’enzyme a été étudié pour la première fois. Finalement, l’applicabilité des microcapsules de poly(éthylèneimine) dans la confection de papiers bioactifs a été démontré par le biais de trois prototypes. Un papier réagissant au glucose a été obtenu en immobilisant des microcapsules contenant l’enzyme glucose oxidase. Un papier sensible à l’enzyme neuraminidase pour la détection de la vaginose bactérienne avec une plus grande stabilité durant l’entreposage a été fait en encapsulant les réactifs colorimétriques dans des capsules de poly(éthylèneimine). L’utilisation de microcapsules pour l’immobilisation d’anticorps a également été étudiée. Les avancées au niveau de la plateforme d’immobilisation de biomolécules par microencapsulation qui ont été réalisées lors de cette thèse permettront de mieux comprendre l’effet des réactifs impliqués dans la procédure de microencapsulation sur la stabilité, l’activité et la conformation des biomolécules. Les résultats obtenus démontrent que la plateforme d’immobilisation développée peut être appliquée pour la confection de nouveaux papiers bioactifs.

Identification et caractérisation des principaux fragments du collagène de type II du cartilage équin, produit in vitro par l'enzyme cathepsine K

La dégradation protéolytique du collagène de type II est considérée comme étant un facteur majeur dans le processus irréversible de dégradation de la matrice cartilagineuse lors d’ostéoarthrose. Outre les collagénases de la famille des métaloprotéinases de la matrice (MMP-1, -8, -13), la cathepsine K est parmi les seules enzymes susceptibles de dégrader la triple hélice intacte du collagène de type II, devenant ainsi un élément pertinent pour les recherches sur l’ostéoarthrose. L’objectif à court terme de notre étude consiste en l’identification et la caractérisation de sites de clivage spécifiques de la cathepsine K sur le collagène de type II équin. La technique d’électrophorèse SDS-PAGE 1D permet la visualisation des produits de digestion et la validation des résultats de la caractérisation moléculaire des fragments protéolytiques. La caractérisation est réalisée en combinant la digestion trypsique précédant l’analyse HPLC-ESI/MS. Les résultats ont permis d’établir les sites, présents sur la carte peptidique de la molécule de collagène de type II équin, des 48 résidus prolines (P) et 5 résidus lysines (K) supportant une modification post-traductionnelle. De plus, 6 fragments majeurs, différents de ceux produits par les MMPs, sont observés par SDS-PAGE 1D puis confirmés par HPLC-ESI/MS, correspondant aux sites suivants : F1 [G189-K190], F2 [G252-P253], F3 [P326-G327], F4 [P428-G429], F5 [P563-G564] et F6 [P824-G825]. Le fragment F1 nouvellement identifié suggère un site de clivage différent de l’étude antérieure sur le collagène de type II bovin et humain. L’objectif à long terme serait le développement d’anticorps spécifiques au site identifié, permettant de suivre l’activité protéolytique de la cathepsine K par immunohistochimie et ÉLISA, dans le cadre du diagnostic de l’ostéoarthrose.

Caractérisation du gène de l'enzyme de conversion de l'angiotensine-2 dans le rein diabétique et implication dans le développement de la néphropathie diabétique et de l'hypertension

De nombreuses études ont bien démontré que l’activation du système rénine-angiotensine (RAS) joue un rôle important dans le développement de l’hypertension et de la néphropathie diabétique (DN). La découverte de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) et l’identification du récepteur MAS, spécifique pour l’angiotensine 1-7 (Ang 1-7), ont permis d’identifier deux nouveaux membres du RAS. L’axe ACE2/Ang 1-7/MAS contrebalance les effets de l’axe ACE/Ang II/AT1. Plusieurs évidences impliquent la contribution du RAS intrarénal dans la DN. Des études réalisées dans notre laboratoire avec des souris transgéniques surexprimant l’angiotensinogène de rat dans les cellules de leurs tubules proximaux rénaux (RPTCs) ont permis de démontrer l’importance du RAS intrarénal dans l’induction de l’hypertension et les dommages rénaux. Nous avons également observé que l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’ANG 1-7 sont plus faibles chez les souris Akita (diabète de type 1) et qu’un traitement avec des bloqueurs du RAS permet de normaliser l’expression de l’ACE2 et de prévenir le développement de l’hypertension dans le modèle des souris Akita. Dans un milieu diabétique, à la fois la glycémie et l’angiotensine II (Ang II) peuvent induire la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS), contribuant ainsi aux dommages rénaux. Afin d’explorer la relation entre les ROS, ACE2 et la DN, nous avons créé des souris Akita transgéniques surexprimant la catalase (Cat) dans les RPTCs, en croisant des souris Akita diabétique de type 1 à notre modèle de souris transgéniques surexprimant la Cat de rat dans les RPTCs. Dans une seconde étude, des souris Akita ont été traitées avec l’Ang 1-7 ou une combinaison d’Ang 1-7 et de son antagoniste, A779, afin d’étudier la relation entre l’action de l’Ang 1-7, l’hypertension systolique (sHTN), le stress oxydatif, les dommages rénaux, ACE2 et l’expression du récepteur Mas. Nos résultats ont montré que la surexpression de Cat atténue le stress oxydatif rénal; prévient l’hypertension, améliore le taux de filtration glomérulaire, l’albuminurie, l’hypertrophie rénale, la fibrose tubulo-interstitielle et l’apoptose tubulaire; et supprime l’expression des gènes profibrotiques et proapoptotiques dans les RPTCs des souris Akita Cat-Tg lorsque comparées aux souris Akita. De plus, la surexpression de Cat dans les RPTC des souris Akita normalise l’expression rénale de l’ACE2 et les niveaux urinaires d’Ang 1-7. D’autre part, l’administration d’Ang 1-7 prévient l’hypertension systémique, normalise le ratio albumine/créatinine urinaire et atténue l’hyperfiltration glomérulaire des souris Akita, sans affecter la glycémie sanguine. De plus, le traitement avec l’Ang 1-7 atténue aussi le stress oxydatif et l’expression de la NADPH oxydase, Agt, ACE, TGF-β1 (transforming growth factor-β1) et collagène IV, tout en augmentant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas dans les reins des souris Akita. Ces effets sont renversés par la co-admininstration d’A779. Ces résultats démontrent que la surexpression de Cat prévient l’hypertension et la progression de la néphropathie, en plus de mettre en lumière l’importance du stress oxydatif intrarénal et l’expression de l’ACE2 comme facteurs contribuant à l’hypertension et les dommages rénaux observés dans le diabète. En outre, nos données suggèrent que l’Ang 1-7 joue un rôle protecteur dans l’hypertension et les dommages aux RPTC dans le diabète, principalement en réduisant les voies de signalisations du stress oxydatif dans les reins et en normalisant l’expression de l’ACE2 et du récepteur Mas. Nos résultats indiquent aussi que l’Ang 1-7 pourrait agir comme un agent thérapeutique potentiel dans le traitement de l’hypertension systémique et les dommages rénaux observés dans le diabète. En conséquence, l’Ang 1-7 est responsable du rôle protecteur de l’ACE2 dans l’hypertension et la DN.

A single amino acid substitution in the mRNA capping enzyme λ2 of a mammalian orthoreovirus mutant increases interferon sensitivity.

In the last few years, the development of a plasmid-based reverse genetics system for mammalian reovirus has allowed the production and characterization of mutant viruses. This could be especially significant in the optimization of reovirus strains for virotherapeutic applications, either as gene vectors or oncolytic viruses. The genome of a mutant virus exhibiting increased sensitivity to interferon was completely sequenced and compared with its parental virus. Viruses corresponding to either the parental or mutant viruses were then rescued by reverse genetics and shown to exhibit the expected phenotypes. Systematic rescue of different viruses harboring either of the four parental genes in a mutant virus backbone, or reciprocally, indicated that a single amino acid substitution in one of λ2 methyltransferase domains is the major determinant of the difference in interferon sensitivity between these two viruses.

Characterization of glutaraldehyde-immobilized chymotrypsin and an in-situ immobilized enzyme reactor using capillary electrophoresis-based peptide mapping

La digestion enzymatique des protéines est une méthode de base pour les études protéomiques ainsi que pour le séquençage en mode « bottom-up ». Les enzymes sont ajoutées soit en solution (phase homogène), soit directement sur le gel polyacrylamide selon la méthode déjà utilisée pour l’isolation de la protéine. Les enzymes protéolytiques immobilisées, c’est-à-dire insolubles, offrent plusieurs avantages tels que la réutilisation de l’enzyme, un rapport élevé d’enzyme-sur-substrat, et une intégration facile avec les systèmes fluidiques. Dans cette étude, la chymotrypsine (CT) a été immobilisée par réticulation avec le glutaraldehyde (GA), ce qui crée des particules insolubles. L’efficacité d’immobilisation, déterminée par spectrophotométrie d’absorbance, était de 96% de la masse totale de la CT ajouté. Plusieurs différentes conditions d’immobilisation (i.e., réticulation) tels que la composition/pH du tampon et la masse de CT durant la réticulation ainsi que les différentes conditions d’entreposage tels que la température, durée et humidité pour les particules GA-CT ont été évaluées par comparaison des cartes peptidiques en électrophorèse capillaire (CE) des protéines standards digérées par les particules. Les particules de GA-CT ont été utilisés pour digérer la BSA comme exemple d’une protéine repliée large qui requit une dénaturation préalable à la digestion, et pour digérer la caséine marquée avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) comme exemple d’un substrat dérivé afin de vérifier l’activité enzymatique du GA-CT dans la présence des groupements fluorescents liés au substrat. La cartographie peptidique des digestions par les particules GA-CT a été réalisée par CE avec la détection par absorbance ultraviolet (UV) ou fluorescence induite par laser. La caséine-FITC a été, en effet, digérée par GA-CT au même degré que par la CT libre (i.e., soluble). Un microréacteur enzymatique (IMER) a été fabriqué par immobilisation de la CT dans un capillaire de silice fondu du diamètre interne de 250 µm prétraité avec du 3-aminopropyltriéthoxysilane afin de fonctionnaliser la paroi interne avec les groupements amines. Le GA a été réagit avec les groupements amine puis la CT a été immobilisée par réticulation avec le GA. Les IMERs à base de GA-CT étaient préparé à l’aide d’un système CE automatisé puis utilisé pour digérer la BSA, la myoglobine, un peptide ayant 9 résidus et un dipeptide comme exemples des substrats ayant taille large, moyenne et petite, respectivement. La comparaison des cartes peptidiques des digestats obtenues par CE-UV ou CE-spectrométrie de masse nous permettent d’étudier les conditions d’immobilisation en fonction de la composition et le pH du tampon et le temps de réaction de la réticulation. Une étude par microscopie de fluorescence, un outil utilisé pour examiner l’étendue et les endroits d’immobilisation GA-CT dans l’IMER, ont montré que l’immobilisation a eu lieu majoritairement sur la paroi et que la réticulation ne s’est étendue pas si loin au centre du capillaire qu’anticipée.