13 resultados para enzyme marker
em Université de Montréal, Canada
Resumo:
Les sites apuriniques/apyrimidiniques (AP) sont des sites de lADN hautement mutagne. Les dommages au niveau de ces sites peuvent survenir spontanment ou tre induits par une varit dagents. Chez lhumain, les sites AP sont rpars principalement par APE1, une enzyme de rparation de lADN qui fait partie de la voie de rparation par excision de base (BER). APE1 est une enzyme multifonctionnelle; cest une AP endonuclase, 3-diestrase et un facteur redox impliqu dans lactivation des facteurs de transcription. Rcemment, il a t dmontr quAPE1 interagit avec lenzyme glycolytique GAPDH. Cette interaction induit lactivation dAPE1 par rduction. En outre, la dltion du gne GAPDH sensibilise les cellules aux agents endommageant lADN, induit une augmentation de formation spontane des sites AP et rduit la prolifration cellulaire. A partir de toutes ces donnes, il tait donc intressant dtudier leffet de la dltion de GAPDH sur la progression du cycle cellulaire, sur la distribution cellulaire dAPE1 et didentifier la cystine(s) dAPE1 cible(s) de la rduction par GAPDH. Nos travaux de recherche ont montr que la dficience en GAPDH cause un arrt du cycle cellulaire en phase G1. Cet arrt est probablement d laccumulation des dommages engendrant un retard au cours duquel la cellule pourra rparer son ADN. De plus, nous avons observ des foci nuclaires dans les cellules dficientes en GAPDH qui peuvent reprsenter des agrgats dAPE1 sous sa forme oxyde ou bien des focis de la protine inactive au niveau des lsions dADN. Nous avons utilis la mutagnse dirige pour crer des mutants (Cys en Ala) des sept cystines dAPE1 qui ont t clon dans un vecteur dexpression dans les cellules de mammifres. Nous mettons lhypothse quau moins un mutant ou plus va tre rsistant linactivation par oxydation puisque lalanine ne peut pas sengager dans la formation des ponts disulfures. Par consquent, on anticipe que lexpression de ce mutant dans les cellules dficientes en GAPDH pourrait restaurer une distribution cellulaire normale de APE1, librerait les cellules de larrt en phase G1 et diminuerait la sensibilit aux agents endommageant lADN. En conclusion, il semble que GAPDH, en prservant lactivit dAPE1, joue un nouveau rle pour maintenir lintgrit gnomique des cellules aussi bien dans les conditions normales quen rponse au stress oxydatif.
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Lacide rtinoque (AR) est le ligand des rcepteurs nuclaires RAR et RXR qui agissent comme facteurs de transcription ligand-inductibles et mdient ses effets biologiques. Il est connu que lAR a des proprits prodiffrenciatrices et antiprolifratives, notamment sur les cellules de lpithlium mammaire. Une perte de sensibilit de lAR a toutefois t mise en vidence dans plusieurs lignes cellulaires mammaires cancreuses, ce qui pourrait faciliter la croissance des tumeurs. Or jusquici cette perte de sensibilit avait t attribue des dfauts de la voie de signalisation de lAR, cause par la perte de lexpression des rcepteurs lAR dans la tumeur, bien que plusieurs lignes de cellules cancreuses y soient tout de mme trs sensibles. Peu dtudes se sont intresses au rle de la voie de synthse de lAR dans la transformation des cellules mammaires. En effet, lAR est synthtis partir de la vitamine A, ou rtinol, son prcurseur sanguin provenant de la dite. Les cellules de lpithlium mammaire normales ont la capacit de synthtiser lAR partir du rtinol. Nos rapportons pour la premire fois que lpithlium mammaire est probablement le sige de la synthse et de la signalisation de lAR. Cela est d, au moins en partie, lexpression dune enzyme de synthse de lAR, RALDH3, dans lpithlium mammaire normal. Dans cette tude, nous dmontrons que les cellules cancreuses de type luminal, qui ont sensibles lAR (et qui expriment le rcepteur des estrognes ER, catgorie qui regroupe 75 % des tumeurs diagnostiques) nont au contraire pas la capacit de sythtiser lAR, probablement en raison dune faible expression de RALDH3 dans les tumeurs, sous leffet des estrognes. Cela pourrait reprsenter un nouveau mcanisme favorisant la croissance des tumeurs luminales dont les cellules prolifrent en prsence du rtinol sanguin. RALDH1, une autre enzyme de la voie de synthse de lAR, et qui partage 70 % didentit de squence avec RALDH3, est un marqueur de tumeurs plus agressives et de la formation de mtastase. Nous montrons au contraire, que RALDH3 est un marqueur dune moindre probabilit de dvelopper des mtastases chez les patientes atteintes dune tumeur luminale. Cela suggre des rles different pour ces deux enzymes dans la glande mammaire. Nos rsultats indiquent que RALDH1 et 3 ont des proprits enzymatiques trs diffrentes, ce qui est en accord avec cette dernire hypothse. Nos donnes suggrent aussi que RALDH1 et 3 pourraient tre des marqueurs de populations distinctes de cellules dans la glande mammaire normale. Nous proposons dexploiter les diffrences entre RALDH1 et 3 afin de mettre au point des mthodes de sparation des diffrentes population de cellules de lpithlium mammaire ce qui pourrait aider comprendre le rle de la synthse dAR dans ce tissu.
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Ralis en cotutelle avec le Dr James G Martin de l'Universit McGill (Meakins-Christie laboratories)
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Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral.
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Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral
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Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral.
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Un papier bioactif est obtenu par la modification dun papier en y immobilisant une ou plusieurs biomolcules. La recherche et le dveloppement de papiers bioactifs est en plein essor car le papier est un substrat peu dispendieux qui est dj dusage trs rpandu travers le monde. Bien que les papiers bioactifs naient pas connus de succs commercial depuis la mise en marche de bandelettes mesurant le taux de glucose dans les annes cinquante, de nombreux groupes de recherche travaillent immobiliser des biomolcules sur le papier pour obtenir un papier bioactif qui est abordable et possde une bonne dure de vie. Contrairement la glucose oxidase, lenzyme utilise sur ces bandelettes, la majorit des biomolcules sont trs fragiles et perdent leur activit trs rapidement lorsquimmobilises sur des papiers. Le dveloppement de nouveaux papiers bioactifs pouvant dtecter des substances dintrt ou mme dsactiver des pathognes dpend donc de dcouverte de nouvelles techniques dimmobilisation des biomolcules permettant de maintenir leur activit tout en tant applicable dans la chane de production actuelle des papiers fins. Le but de cette thse est de dvelopper une technique dimmobilisation efficace et versatile, permettant de protger lactivit de biomolcules incorpores sur des papiers. La microencapsulation a t choisie comme technique dimmobilisation car elle permet denfermer de grandes quantits de biomolcules lintrieur dune sphre poreuse permettant leur protection. Pour cette tude, le polymre poly(thylnediimine) a t choisi afin de gnrer la paroi des microcapsules. Les enzymes laccase et glucose oxidase, dont les proprits sont bien tablies, seront utilises comme biomolcules test. Dans un premier temps, deux procdures dencapsulation ont t dveloppes puis tudies. La mthode par mulsion produit des microcapsules de plus petits diamtres que la mthode par encapsulation utilisant un encapsulateur, bien que cette dernire offre une meilleure efficacit dencapsulation. Par la suite, leffet de la procdure dencapsulation sur lactivit enzymatique et la stabilit thermique des enzymes a t tudi cause de limportance du maintien de lactivit sur le dveloppement dune plateforme dimmobilisation. Leffet de la nature du polymre utilis pour la fabrication des capsules sur la conformation de lenzyme a t tudi pour la premire fois. Finalement, lapplicabilit des microcapsules de poly(thylneimine) dans la confection de papiers bioactifs a t dmontr par le biais de trois prototypes. Un papier ragissant au glucose a t obtenu en immobilisant des microcapsules contenant lenzyme glucose oxidase. Un papier sensible lenzyme neuraminidase pour la dtection de la vaginose bactrienne avec une plus grande stabilit durant lentreposage a t fait en encapsulant les ractifs colorimtriques dans des capsules de poly(thylneimine). Lutilisation de microcapsules pour limmobilisation danticorps a galement t tudie. Les avances au niveau de la plateforme dimmobilisation de biomolcules par microencapsulation qui ont t ralises lors de cette thse permettront de mieux comprendre leffet des ractifs impliqus dans la procdure de microencapsulation sur la stabilit, lactivit et la conformation des biomolcules. Les rsultats obtenus dmontrent que la plateforme dimmobilisation dveloppe peut tre applique pour la confection de nouveaux papiers bioactifs.
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La dgradation protolytique du collagne de type II est considre comme tant un facteur majeur dans le processus irrversible de dgradation de la matrice cartilagineuse lors dostoarthrose. Outre les collagnases de la famille des mtaloprotinases de la matrice (MMP-1, -8, -13), la cathepsine K est parmi les seules enzymes susceptibles de dgrader la triple hlice intacte du collagne de type II, devenant ainsi un lment pertinent pour les recherches sur lostoarthrose. Lobjectif court terme de notre tude consiste en lidentification et la caractrisation de sites de clivage spcifiques de la cathepsine K sur le collagne de type II quin. La technique dlectrophorse SDS-PAGE 1D permet la visualisation des produits de digestion et la validation des rsultats de la caractrisation molculaire des fragments protolytiques. La caractrisation est ralise en combinant la digestion trypsique prcdant lanalyse HPLC-ESI/MS. Les rsultats ont permis dtablir les sites, prsents sur la carte peptidique de la molcule de collagne de type II quin, des 48 rsidus prolines (P) et 5 rsidus lysines (K) supportant une modification post-traductionnelle. De plus, 6 fragments majeurs, diffrents de ceux produits par les MMPs, sont observs par SDS-PAGE 1D puis confirms par HPLC-ESI/MS, correspondant aux sites suivants : F1 [G189-K190], F2 [G252-P253], F3 [P326-G327], F4 [P428-G429], F5 [P563-G564] et F6 [P824-G825]. Le fragment F1 nouvellement identifi suggre un site de clivage diffrent de ltude antrieure sur le collagne de type II bovin et humain. Lobjectif long terme serait le dveloppement danticorps spcifiques au site identifi, permettant de suivre lactivit protolytique de la cathepsine K par immunohistochimie et LISA, dans le cadre du diagnostic de lostoarthrose.
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De nombreuses tudes ont bien dmontr que lactivation du systme rnine-angiotensine (RAS) joue un rle important dans le dveloppement de lhypertension et de la nphropathie diabtique (DN). La dcouverte de lenzyme de conversion de langiotensine-2 (ACE2) et lidentification du rcepteur MAS, spcifique pour langiotensine 1-7 (Ang 1-7), ont permis didentifier deux nouveaux membres du RAS. Laxe ACE2/Ang 1-7/MAS contrebalance les effets de laxe ACE/Ang II/AT1. Plusieurs vidences impliquent la contribution du RAS intrarnal dans la DN. Des tudes ralises dans notre laboratoire avec des souris transgniques surexprimant langiotensinogne de rat dans les cellules de leurs tubules proximaux rnaux (RPTCs) ont permis de dmontrer limportance du RAS intrarnal dans linduction de lhypertension et les dommages rnaux. Nous avons galement observ que lexpression rnale de lACE2 et les niveaux urinaires dANG 1-7 sont plus faibles chez les souris Akita (diabte de type 1) et quun traitement avec des bloqueurs du RAS permet de normaliser lexpression de lACE2 et de prvenir le dveloppement de lhypertension dans le modle des souris Akita. Dans un milieu diabtique, la fois la glycmie et langiotensine II (Ang II) peuvent induire la gnration des espces ractives de loxygne (ROS), contribuant ainsi aux dommages rnaux. Afin dexplorer la relation entre les ROS, ACE2 et la DN, nous avons cr des souris Akita transgniques surexprimant la catalase (Cat) dans les RPTCs, en croisant des souris Akita diabtique de type 1 notre modle de souris transgniques surexprimant la Cat de rat dans les RPTCs. Dans une seconde tude, des souris Akita ont t traites avec lAng 1-7 ou une combinaison dAng 1-7 et de son antagoniste, A779, afin dtudier la relation entre laction de lAng 1-7, lhypertension systolique (sHTN), le stress oxydatif, les dommages rnaux, ACE2 et lexpression du rcepteur Mas. Nos rsultats ont montr que la surexpression de Cat attnue le stress oxydatif rnal; prvient lhypertension, amliore le taux de filtration glomrulaire, lalbuminurie, lhypertrophie rnale, la fibrose tubulo-interstitielle et lapoptose tubulaire; et supprime lexpression des gnes profibrotiques et proapoptotiques dans les RPTCs des souris Akita Cat-Tg lorsque compares aux souris Akita. De plus, la surexpression de Cat dans les RPTC des souris Akita normalise lexpression rnale de lACE2 et les niveaux urinaires dAng 1-7. Dautre part, ladministration dAng 1-7 prvient lhypertension systmique, normalise le ratio albumine/cratinine urinaire et attnue lhyperfiltration glomrulaire des souris Akita, sans affecter la glycmie sanguine. De plus, le traitement avec lAng 1-7 attnue aussi le stress oxydatif et lexpression de la NADPH oxydase, Agt, ACE, TGF-1 (transforming growth factor-1) et collagne IV, tout en augmentant lexpression de lACE2 et du rcepteur Mas dans les reins des souris Akita. Ces effets sont renverss par la co-admininstration dA779. Ces rsultats dmontrent que la surexpression de Cat prvient lhypertension et la progression de la nphropathie, en plus de mettre en lumire limportance du stress oxydatif intrarnal et lexpression de lACE2 comme facteurs contribuant lhypertension et les dommages rnaux observs dans le diabte. En outre, nos donnes suggrent que lAng 1-7 joue un rle protecteur dans lhypertension et les dommages aux RPTC dans le diabte, principalement en rduisant les voies de signalisations du stress oxydatif dans les reins et en normalisant lexpression de lACE2 et du rcepteur Mas. Nos rsultats indiquent aussi que lAng 1-7 pourrait agir comme un agent thrapeutique potentiel dans le traitement de lhypertension systmique et les dommages rnaux observs dans le diabte. En consquence, lAng 1-7 est responsable du rle protecteur de lACE2 dans lhypertension et la DN.
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In the last few years, the development of a plasmid-based reverse genetics system for mammalian reovirus has allowed the production and characterization of mutant viruses. This could be especially significant in the optimization of reovirus strains for virotherapeutic applications, either as gene vectors or oncolytic viruses. The genome of a mutant virus exhibiting increased sensitivity to interferon was completely sequenced and compared with its parental virus. Viruses corresponding to either the parental or mutant viruses were then rescued by reverse genetics and shown to exhibit the expected phenotypes. Systematic rescue of different viruses harboring either of the four parental genes in a mutant virus backbone, or reciprocally, indicated that a single amino acid substitution in one of 2 methyltransferase domains is the major determinant of the difference in interferon sensitivity between these two viruses.
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La digestion enzymatique des protines est une mthode de base pour les tudes protomiques ainsi que pour le squenage en mode bottom-up . Les enzymes sont ajoutes soit en solution (phase homogne), soit directement sur le gel polyacrylamide selon la mthode dj utilise pour lisolation de la protine. Les enzymes protolytiques immobilises, cest--dire insolubles, offrent plusieurs avantages tels que la rutilisation de lenzyme, un rapport lev denzyme-sur-substrat, et une intgration facile avec les systmes fluidiques. Dans cette tude, la chymotrypsine (CT) a t immobilise par rticulation avec le glutaraldehyde (GA), ce qui cre des particules insolubles. Lefficacit dimmobilisation, dtermine par spectrophotomtrie dabsorbance, tait de 96% de la masse totale de la CT ajout. Plusieurs diffrentes conditions dimmobilisation (i.e., rticulation) tels que la composition/pH du tampon et la masse de CT durant la rticulation ainsi que les diffrentes conditions dentreposage tels que la temprature, dure et humidit pour les particules GA-CT ont t values par comparaison des cartes peptidiques en lectrophorse capillaire (CE) des protines standards digres par les particules. Les particules de GA-CT ont t utiliss pour digrer la BSA comme exemple dune protine replie large qui requit une dnaturation pralable la digestion, et pour digrer la casine marque avec de lisothiocyanate de fluorescine (FITC) comme exemple dun substrat driv afin de vrifier lactivit enzymatique du GA-CT dans la prsence des groupements fluorescents lis au substrat. La cartographie peptidique des digestions par les particules GA-CT a t ralise par CE avec la dtection par absorbance ultraviolet (UV) ou fluorescence induite par laser. La casine-FITC a t, en effet, digre par GA-CT au mme degr que par la CT libre (i.e., soluble). Un microracteur enzymatique (IMER) a t fabriqu par immobilisation de la CT dans un capillaire de silice fondu du diamtre interne de 250 m prtrait avec du 3-aminopropyltrithoxysilane afin de fonctionnaliser la paroi interne avec les groupements amines. Le GA a t ragit avec les groupements amine puis la CT a t immobilise par rticulation avec le GA. Les IMERs base de GA-CT taient prpar laide dun systme CE automatis puis utilis pour digrer la BSA, la myoglobine, un peptide ayant 9 rsidus et un dipeptide comme exemples des substrats ayant taille large, moyenne et petite, respectivement. La comparaison des cartes peptidiques des digestats obtenues par CE-UV ou CE-spectromtrie de masse nous permettent dtudier les conditions dimmobilisation en fonction de la composition et le pH du tampon et le temps de raction de la rticulation. Une tude par microscopie de fluorescence, un outil utilis pour examiner ltendue et les endroits dimmobilisation GA-CT dans lIMER, ont montr que limmobilisation a eu lieu majoritairement sur la paroi et que la rticulation ne sest tendue pas si loin au centre du capillaire quanticipe.
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Dix-huit maladies humaines graves ont jusqu'ici t associes avec des expansions de trinuclotides rpts (TNR) codant soit pour des polyalanines (codes par des codons GCN rpts) soit pour des polyglutamines (codes par des codons CAG rpts) dans des protines spcifiques. Parmi eux, la dystrophie musculaire oculopharynge (DMOP), lAtaxie spinocrbelleuse de type 3 (SCA3) et la maladie de Huntington (MH) sont des troubles transmission autosomale dominante et apparition tardive, caractriss par la prsence d'inclusions intranuclaires (IIN). Nous avons dj identifi la mutation responsable de la DMOP comme tant une petite expansion (2 7 rptitions supplmentaires) du codon GCG rpt du gne PABPN1. En outre, nous-mmes ainsi que dautres chercheurs avons identifi la prsence dvnements de dcalage du cadre de lecture ribosomique de -1 au niveau des codons rpts CAG des gnes ATXN3 (SCA3) et HTT (MH), entranant ainsi la traduction de codons rpts hybrides CAG/GCA et la production d'un peptide contenant des polyalanines. Or, les donnes observes dans la DMOP suggrent que la toxicit induite par les polyalanines est trs sensible leur quantit et leur longueur. Pour valider notre hypothse de dcalage du cadre de lecture dans le gne ATXN3 dans des modles animaux, nous avons essay de reproduire nos constatations chez la drosophile et dans des neurones de mammifres. Nos rsultats montrent que l'expression transgnique de codons rpts CAG largis dans lADNc de ATXN3 conduit aux vnements de dcalage du cadre de lecture -1, et que ces vnements sont nfastes. l'inverse, l'expression transgnique de codons rpts CAA (codant pour les polyglutamines) largis dans lADNc de ATXN3 ne conduit pas aux vnements de dcalage du cadre de lecture -1, et nest pas toxique. Par ailleurs, lARNm des codons rpts CAG largis dans ATXN3 ne contribue pas la toxicit observe dans nos modles. Ces observations indiquent que lexpansion de polyglutamines dans nos modles drosophile et de neurones de mammifres pour SCA3 ne suffit pas au dveloppement d'un phnotype. Par consquent, nous proposons que le dcalage du cadre de lecture ribosomique -1 contribue la toxicit associe aux rptitions CAG dans le gne ATXN3. Pour tudier le dcalage du cadre de lecture -1 dans les maladies expansion de trinuclotides CAG en gnral, nous avons voulu crer un anticorps capable de dtecter le produit prsentant ce dcalage. Nous rapportons ici la caractrisation dun anticorps polyclonal qui reconnat slectivement les expansions pathologiques de polyalanines dans la protine PABPN1 implique dans la DMOP. En outre, notre anticorps dtecte galement la prsence de protines contenant des alanines dans les inclusions intranuclaires (IIN) des chantillons de patients SCA3 et MD.
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L'obsit est une maladie associe de nombreuses complications comme le diabte de type 2, l'hypertension et le cancer. De nos jours, les modifications au mode de vie, tels lalimentation et le niveau dactivit physique, ne sont pas suffisants pour combattre les effets dltres de l'obsit. La pharmacothrapie est un traitement alternatif bien que les effets bnfiques soient temporaires et ne peuvent tre maintenus long terme. Le besoin pour un traitement bnfique long terme sans effet secondaire n'est pas combl. Mieux connu pour son rle dans la rgulation de la pression artrielle, le systme rnine-angiotensine favorise l'entreposage du gras. Le rcepteur la prornine et la rnine est une composante du systme rnine-angiotensine. Ainsi, le rcepteur qui amplifie l'activation de celui-ci pourrait avoir un rle cl dans le gain de masse grasse. Le but de ce projet de thse est d'valuer le rle du rcepteur la prornine et la rnine dans le dveloppement de l'obsit et de ses complications chez la souris et ce, en utilisant une combinaison de dite riche en gras et en hydrates de carbone et du handle region peptide, un bloqueur du rcepteur la prornine la rnine. Aprs une priode de 10 semaines, nous avons constat que l'expression et la protine du rcepteur la prornine et la rnine augmentent spcifiquement dans le tissu adipeux sous-cutan et viscral des souris obses. Lorsqu'administr en concomitance avec une dite riche en gras et en hydrates de carbone, le handle region peptide favorise chez la souris des diminutions des gains des masses corporelles et adipeuses viscrales. Une diminution de l'expression de l'enzyme catalysant la dernire tape de la lipogense pourrait tre responsable de la rduction de gras viscral. Chez les mmes animaux, l'expression de plusieurs adipokines est galement diminue dans le tissu adipeux suggrant une rduction de la rsistance l'insuline, de l'inflammation et de l'infiltration des macrophages localement dans le gras sous-cutan et viscral. L'augmentation de l'expression dun marqueur de l'adipogense dans le tissu adipeux sous-cutan pourrait suggrer un plus grand nombre d'adipocytes. Cela pourrait tamponner l'excs d'acides gras libres circulants puisque nous avons constat une diminution de ce paramtre chez les souris ayant une dite riche en gras et en hydrates de carbone et traites avec le peptide. Nous avons mis l'hypothse qu'un cycle futile pourrait tre activ dans le gras sous-cutan car nous avons observ une augmentation de l'expression de plusieurs enzymes impliques dans la lipogense et dans la lipolyse. Le ''brunissement'' du tissu adipeux est la prsence de cellules similaires aux adipocytes bruns dans le tissu adipeux qui sont caractriss par une grande densit mitochondriale et la thermogense. L'augmentation de l'expression des marqueurs de ''brunissement'' et de biogense de mitochondrie dans le gras sous-cutan suggre que le ''brunissement'' pourrait galement tre activ dans ce dpt de gras. La sensibilit l'insuline chez ces animaux pourrait tre amliore telle que suggre en circulation par la diminution de l'insuline, par le glucose qui change peu, par l'augmentation du ratio glucose sur insuline ainsi que par un changement potentiel dans la corrlation entre le poids corporel de la souris et les niveaux dadiponectine circulante. Nos travaux suggrent que le handle region peptide pourrait augmenter la capacit du tissu adipeux sous-cutan mtaboliser les lipides circulants avec l'activation potentielle d'un cycle futile et le ''brunissement''. Cela prviendrait le dpt ectopique de lipides vers les compartiments viscraux comme le suggre la rduction de masse adipeuse viscrale chez les souris ayant une dite riche en gras et en hydrates de carbone et traites avec le peptide. Utilisant un modle de souris, cette tude dmontre le potentiel pharmacologique du handle region peptide comme un nouveau traitement pour prvenir l'obsit.
