Étude des mécanismes d’extraction lipidique par le peptide mélittine et la protéine BSP1

Les peptides et protéines extracteurs de lipides (PEL) se lient aux membranes lipidiques puis en extraient des lipides en formant de plus petits auto-assemblages, un phénomène qui peut aller jusqu'à la fragmentation des membranes. Dans la nature, cette extraction se produit sur une gamme de cellules et entraîne des conséquences variées, comme la modification de la composition de la membrane et la mort de la cellule. Cette thèse se penche sur l’extraction lipidique, ou fragmentation, induite par le peptide mélittine et la protéine Binder-of-SPerm 1 (BSP1) sur des membranes lipidiques modèles. Pour ce faire, des liposomes de différentes compositions sont préparés et incubés avec la mélittine ou la BSP1. L'association aux membranes est déterminée par la fluorescence intrinsèque des PEL, tandis que l'extraction est caractérisée par une plateforme analytique combinant des tests colorimétriques et des analyses en chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse (LCMS). La mélittine fait partie des peptides antimicrobiens cationiques, un groupe de PEL très répandu chez les organismes vivants. Ces peptides sont intéressants du point du vue médical étant donné leur mode d’action qui vise directement les lipides des membranes. Plusieurs de ceux-ci agissent sur les membranes des bactéries selon le mécanisme dit « en tapis », par lequel ils s’adsorbent à leur surface, forment des pores et ultimement causent leur fragmentation. Dans cette thèse, la mélittine est utilisée comme peptide modèle afin d’étudier le mécanisme par lequel les peptides antimicrobiens cationiques fragmentent les membranes. Les résultats montrent que la fragmentation des membranes de phosphatidylcholines (PC) est réduite par une déméthylation graduelle de leur groupement ammonium. L'analyse du matériel fragmenté révèle que les PC sont préférentiellement extraites des membranes, dû à un enrichissement local en PC autour de la mélittine à l'intérieur de la membrane. De plus, un analogue de la mélittine, dont la majorité des résidus cationiques sont neutralisés, est utilisé pour évaluer le rôle du caractère cationique de la mélittine native. La neutralisation augmente l'affinité du peptide pour les membranes neutres et anioniques, réduit la fragmentation des membranes neutres et augmente la fragmentation des membranes anioniques. Malgré les interactions électrostatiques entre le peptide cationique et les lipides anioniques, aucune spécificité lipidique n'est observée dans l'extraction. La BSP1 est la protéine la plus abondante du liquide séminal bovin et constitue un autre exemple de PEL naturel important. Elle se mélange aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et extrait des lipides de leur membrane, notamment le cholestérol et les phosphatidylcholines. Cette étape cruciale modifie la composition lipidique de la membrane du spermatozoïde, ce qui faciliterait par la suite la fécondation de l’ovule. Cependant, le contact prolongé de la protéine avec les spermatozoïdes endommagerait la semence. Cette thèse cherche donc à approfondir notre compréhension de ce délicat phénomène en étudiant le mécanisme moléculaire par lequel la protéine fragmente les membranes lipidiques. Les résultats des présents travaux permettent de proposer un mécanisme d’extraction lipidique en 3 étapes : 1) L'association à l’interface des membranes; 2) La relocalisation de l’interface vers le cœur lipidique; 3) La fragmentation des membranes. La BSP1 se lie directement à deux PC à l'interface; une quantité suffisante de PC dans les membranes est nécessaire pour permettre l'association et la fragmentation. Cette liaison spécifique ne mène généralement pas à une extraction lipidique sélective. L'impact des insaturations des chaînes lipidiques, de la présence de lysophosphatidylcholines, de phosphatidyléthanolamine, de cholestérol et de lipides anioniques est également évalué. Les présentes observations soulignent la complexe relation entre l'affinité d'un PEL pour une membrane et le niveau de fragmentation qu'il induit. L'importance de la relocalisation des PEL de l'interface vers le cœur hydrophobe des membranes pour permettre leur fragmentation est réitérée. Cette fragmentation semble s'accompagner d'une extraction lipidique préférentielle seulement lorsqu'une séparation de phase est induite au niveau de la membrane, nonobstant les interactions spécifiques PEL-lipide. Les prévalences des structures amphiphiles chez certains PEL, ainsi que de la fragmentation en auto-assemblages discoïdaux sont discutées. Finalement, le rôle des interactions électrostatiques entre les peptides antimicrobiens cationiques et les membranes bactériennes anioniques est nuancé : les résidus chargés diminueraient l'association des peptides aux membranes neutres suite à l'augmentation de leur énergie de solvatation.

Rôle de la protéine ScFRK1 dans le développement du sac embryonnaire et son impact sur le guidage des tubes polliniques

Le gène Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) code pour une protéine de la famille des MAPKK kinases exprimée spécifiquement dans les ovules. Son transcrit s’accumule principalement dans la zone micropylaire du sac embryonnaire à l’anthèse et diminue rapidement après pollinisation. Ces résultats suggèrent un rôle possible avant ou pendant la fécondation. Bien qu'aucune expression ne soit détectée dans le pollen à maturité, la protéine est cependant présente dans les cellules mères de microspores. Des plantes transgéniques sous-exprimant ScFRK1 ne montrent aucun phénotype au niveau des tissus végétatifs, mais présentent de petits fruits dépourvus de graines. L’étude microscopique du gamétophyte femelle révèle que son développement ne progresse pas au-delà du stade de la mégaspore fonctionnelle et une grande proportion de sacs embryonnaires anormaux est corrélée avec une faible expression de ScFRK1. De plus, la production de pollen viable diminue en fonction de la baisse des niveaux d’expression du gène, ce qui pourrait s’expliquer par un problème au cours de la mitose I. Puisque l’intégrité du sac embryonnaire est essentielle au guidage des tubes polliniques, nous avons conçu un système de guidage semi-in vivo permettant d’évaluer la capacité des ovules du mutant ScFRK1 à les attirer. L’attraction est sévèrement affectée dans de telles conditions, ce qui confirme l'implication des cellules de la zone micropylaire comme source attractive. Notre système nous a également permis de démontrer que le guidage est très spécifique à l’espèce et que cette attraction constitue un mécanisme important favorisant la spéciation et la maintenance des barrières interspécifiques dans la reproduction sexuée des végétaux.

Implication des peptides RALFs dans les communications cellulaires lors du développement du gamétophyte femelle chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Chez les angiospermes, la reproduction passe par la double fécondation. Le tube pollinique délivre deux cellules spermatiques au sein du gamétophyte femelle. Une cellule féconde la cellule œuf pour produire un zygote; l’autre féconde la cellule centrale pour produire l’endosperme. Pour assurer un succès reproductif, le développement du gamétophyte femelle au sein de l’ovule doit établir un patron cellulaire qui favorise les interactions avec le tube pollinique et les cellules spermatiques. Pour ce faire, un dialogue doit s’établir entre les différentes cellules de l’ovule lors de son développement, de même que lors de la fécondation. D’ailleurs, plusieurs types de communications intercellulaires sont supposées suite à la caractérisation de plusieurs mutants développementaux. De même, ces communications semblent persister au sein du zygote et de l’endosperme pour permettre la formation d’un embryon viable au sein de la graine. Malgré les développements récents qui ont permis de trouver des molécules de signalisation supportant les modèles d’interactions cellulaires avancés par la communauté scientifique, les voies de signalisation sont de loin très incomplètes. Dans le but de caractériser des gènes encodant des protéines de signalisation potentiellement impliqués dans la reproduction chez Solanum chacoense, l’analyse d’expression des gènes de type RALF présents dans une banque d’ESTs (Expressed Sequence Tags) spécifiques à l’ovule après fécondation a été entreprise. RALF, Rapid Alcalinization Factor, est un peptide de 5 kDa qui fait partie de la superfamille des «protéines riches en cystéines (CRPs)», dont les rôles physiologiques au sein de la plante sont multiples. Cette analyse d’expression a conduit à une analyse approfondie de ScRALF3, dont l’expression au sein de la plante se limite essentiellement à l’ovule. L’analyse de plantes transgéniques d’interférence pour le gène ScRALF3 a révélé un rôle particulier lors de la mégagamétogénèse. Les plantes transgéniques présentent des divisions mitotiques anormales qui empêchent le développement complet du sac embryonnaire. Le positionnement des noyaux, de même que la synchronisation des divisions au sein du syncytium, semblent responsables de cette perte de progression lors de la mégagamétogénèse. L’isolement du promoteur de même que l’analyse plus précise d’expression au sein de l’ovule révèle une localisation sporophytique du transcrit. La voie de signalisation de l’auxine régule également la transcription de ScRALF3. De surcroît, ScRALF3 est un peptide empruntant la voie de sécrétion médiée par le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. En somme, ScRALF3 est un important facteur facilitant la communication entre le sporophyte et le gamétophyte pour amener à maturité le sac embryonnaire. L’identification d’un orthologue potentiel chez Arabidopsis thaliana a conduit à la caractérisation de AtRALF34. L’absence de phénotype lors du développement du sac embryonnaire suggère, cependant, de la redondance génétique au sein de la grande famille des gènes de type RALF. Néanmoins, les peptides RALFs apparaissent comme d’importants régulateurs lors de la reproduction chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Developmental, morphological, and behavioural plasticity in the reproductive strategies of stink bugs and their egg parasitoids

L’environnement façonne la physiologie, la morphologie et le comportement des organismes par l’entremise de processus écologiques et évolutifs complexes et multidimensionnels. Le succès reproducteur des animaux est déterminé par la valeur adaptative d’un phénotype dans un environnement en modification constante selon une échelle temporelle d’une à plusieurs générations. De plus, les phénotypes sont façonnés par l’environnement, ce qui entraine des modifications adaptatives des stratégies de reproduction tout en imposant des contraintes. Dans cette thèse, considérant des punaises et leurs parasitoïdes comme organismes modèles, j’ai investigué comment plusieurs types de plasticité peuvent interagir pour influencer la valeur adaptative, et comment la plasticité des stratégies de reproduction répond à plusieurs composantes des changements environnementaux (qualité de l’hôte, radiation ultraviolette, température, invasion biologique). Premièrement, j’ai comparé la réponse comportementale et de traits d’histoire de vie à la variation de taille corporelle chez le parasitoïde Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera : Platygastridae), démontrant que les normes de réaction des comportements étaient plus souvent positives que celles des traits d’histoires de vie. Ensuite, j’ai démontré que la punaise prédatrice Podisus maculiventris Say (Hemiptera : Pentatomidae) peut contrôler la couleur de ses œufs, et que la pigmentation des œufs protège les embryons du rayonnement ultraviolet; une composante d’une stratégie complexe de ponte qui a évoluée en réponse à une multitude de facteurs environnementaux. Puis, j’ai testé comment le stress thermique affectait la dynamique de la mémoire du parasitoïde Trissolcus basalis (Wollaston) (Hymenoptera : Platygastridae) lors de l’apprentissage de la fiabilité des traces chimiques laissées par son hôte. Ces expériences ont révélé que des températures hautes et basses prévenaient l’oubli, affectant ainsi l’allocation du temps passé par les parasitoïdes dans des agrégats d’hôtes contenant des traces chimiques. J’ai aussi développé un cadre théorique général pour classifier les effets de la température sur l’ensemble des aspects comportementaux des ectothermes, distinguant les contraintes des adaptations. Finalement, j’ai testé l’habileté d’un parasitoïde indigène (T. podisi) à exploiter les œufs d’un nouveau ravageur invasif en agriculture, Halyomorpha halys Stål (Hemiptera : Pentatomidae). Les résultats ont montré que T. podisi attaque les œufs de H. halys, mais qu’il ne peut s’y développer, indiquant que le ravageur invasif s’avère un « piège évolutif » pour ce parasitoïde. Cela pourrait indirectement bénéficier aux espèces indigènes de punaises en agissant comme un puits écologique de ressources (œufs) et de temps pour le parasitoïde. Ces résultats ont des implications importantes sur la réponse des insectes, incluant ceux impliqués dans les programmes de lutte biologique, face aux changements environnementaux.