Les gènes et protéines BSP chez la souris et l’humain : clonage, caractérisation, expression sous forme recombinante et étude des fonctions biologiques

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins.

Accroissement de la prévalence du TDA/H, de la consommation de psychostimulants et des symptômes dépressifs : l’importance du contexte social évaluée à partir des effets d’âge, de période et de cohorte

La présente thèse de doctorat visait d’abord à valider les résultats des études antérieures démontrant un accroissement de la prévalence des problèmes de santé mentale et ensuite, à évaluer l’importance du contexte social dans l’explication des changements de prévalence, à partir des effets d’âge, de période et de cohorte. L’atteinte de ces objectifs s’est faite à partir de deux études empiriques, chacune ciblant sa propre problématique en santé mentale. La première étude, basée sur les données de l’Enquête longitudinale nationale sur les enfants et les jeunes (ELNEJ) de Statistique Canada, a permis de conclure à un accroissement réel de la prévalence du diagnostic de trouble déficitaire de l’attention/hyperactivité (TDA/H) et de la consommation de psychostimulants chez les enfants canadiens entre 1994 et 2007. Toutefois, cette tendance n’est ni constante, ni universelle, puisque des effets de période et d’âge apparaissent clairement : l’augmentation des prévalences est uniquement remarquée dans les années 2000, et survient seulement chez les enfants d’âge scolaire. L’identification d’inégalités de prévalence dues à la période historique et à l’âge des enfants souligne l’importance du contexte social dans la problématique du diagnostic de TDA/H et de la consommation de psychostimulants. La seconde étude a été réalisée à partir des données du Panel Study of Belgian Households (PSBH) et cherchait à expliquer l’accroissement des symptômes dépressifs observé ces vingt dernières années chez les adultes belges. L’utilisation de l’analyse multiniveaux longitudinale permettant la distinction des effets d’âge et des effets de cohortes a été privilégiée. Bien que l’intensité des symptômes dépressifs ait varié de manière relativement importante chez les individus au cours des années 1990, nos conclusions démontrent que les symptômes auto-rapportés de dépression sont davantage associés aux conditions de vie, qu’à la personnalité. L’augmentation résulte d’un effet de la succession des cohortes, où les individus des cohortes les plus récentes rapportent toujours une plus grande intensité de symptômes dépressifs que les individus des cohortes précédentes. Les membres d’une même cohorte de naissance partagent donc des expériences communes à un âge similaire, ce qui a un impact durable sur leurs comportements et sur leur santé mentale. De manière générale, les résultats des deux articles empiriques ont, chacun à leur manière, confirmé la réalité de l’accroissement des problèmes de santé mentale dans les sociétés occidentales contemporaines, et permis de constater que la prévalence diffère selon l’âge et la cohorte de naissance des individus, ainsi que selon la période historique, renforçant ainsi l’hypothèse de l’importance des facteurs sociaux dans l’étiologie des problèmes de santé mentale. Bien que la nature de ces facteurs n’ait pu être testée de manière directe, de nombreuses explications sociales furent tout de même proposées. À cet égard, des changements dans les normes comportementales associées à l’âge, dans les normes sociales, dans la conceptualisation des troubles mentaux, des modifications dans la sphère éducative, ainsi que des innovations pharmacologiques, médicales et technologiques constituent des explications sociales aux effets d’âge, de période et de cohorte qui ont été observés.