Cholinergic enhancement of perceptual learning : behavioral, physiological, and neuro-pharmacological study in the rat primary visual cortex

Les cortices sensoriels sont des régions cérébrales essentielles pour la perception. En particulier, le cortex visuel traite l’information visuelle en provenance de la rétine qui transite par le thalamus. Les neurones sont les unités fonctionnelles qui transforment l'information sensorielle en signaux électriques, la transfèrent vers le cortex et l'intègrent. Les neurones du cortex visuel sont spécialisés et analysent différents aspects des stimuli visuels. La force des connections entre les neurones peut être modulée par la persistance de l'activité pré-synaptique et induit une augmentation ou une diminution du signal post-synaptique à long terme. Ces modifications de la connectivité synaptique peuvent induire la réorganisation de la carte corticale, c’est à dire la représentation de ce stimulus et la puissance de son traitement cortical. Cette réorganisation est connue sous le nom de plasticité corticale. Elle est particulièrement active durant la période de développement, mais elle s’observe aussi chez l’adulte, par exemple durant l’apprentissage. Le neurotransmetteur acétylcholine (ACh) est impliqué dans de nombreuses fonctions cognitives telles que l’apprentissage ou l’attention et il est important pour la plasticité corticale. En particulier, les récepteurs nicotiniques et muscariniques du sous-type M1 et M2 sont les récepteurs cholinergiques impliqués dans l’induction de la plasticité corticale. L’objectif principal de la présente thèse est de déterminer les mécanismes de plasticité corticale induits par la stimulation du système cholinergique au niveau du télencéphale basal et de définir les effets sur l’amélioration de la perception sensorielle. Afin d’induire la plasticité corticale, j’ai jumelé des stimulations visuelles à des injections intracorticales d’agoniste cholinergique (carbachol) ou à une stimulation du télencéphale basal (neurones cholinergiques qui innervent le cortex visuel primaire). J'ai analysé les potentiels évoqués visuels (PEVs) dans le cortex visuel primaire des rats pendant 4 à 8 heures après le couplage. Afin de préciser l’action de l’ACh sur l’activité des PEVs dans V1, j’ai injecté individuellement l’antagoniste des récepteurs muscariniques, nicotiniques, α7 ou NMDA avant l’infusion de carbachol. La stimulation du système cholinergique jumelée avec une stimulation visuelle augmente l’amplitude des PEVs durant plus de 8h. Le blocage des récepteurs muscarinique, nicotinique et NMDA abolit complètement cette amélioration, tandis que l’inhibition des récepteurs α7 a induit une augmentation instantanée des PEVs. Ces résultats suggèrent que l'ACh facilite à long terme la réponse aux stimuli visuels et que cette facilitation implique les récepteurs nicotiniques, muscariniques et une interaction avec les récepteur NMDA dans le cortex visuel. Ces mécanismes sont semblables à la potentiation à long-terme, évènement physiologique lié à l’apprentissage. L’étape suivante était d’évaluer si l’effet de l’amplification cholinergique de l’entrée de l’information visuelle résultait non seulement en une modification de l’activité corticale mais aussi de la perception visuelle. J’ai donc mesuré l’amélioration de l’acuité visuelle de rats adultes éveillés exposés durant 10 minutes par jour pendant deux semaines à un stimulus visuel de type «réseau sinusoïdal» couplé à une stimulation électrique du télencéphale basal. L’acuité visuelle a été mesurée avant et après le couplage des stimulations visuelle et cholinergique à l’aide d’une tâche de discrimination visuelle. L’acuité visuelle du rat pour le stimulus d’entrainement a été augmentée après la période d’entrainement. L’augmentation de l’acuité visuelle n’a pas été observée lorsque la stimulation visuelle seule ou celle du télencéphale basal seul, ni lorsque les fibres cholinergiques ont été lésées avant la stimulation visuelle. Une augmentation à long terme de la réactivité corticale du cortex visuel primaire des neurones pyramidaux et des interneurones GABAergiques a été montrée par l’immunoréactivité au c-Fos. Ainsi, lorsque couplé à un entrainement visuel, le système cholinergique améliore les performances visuelles pour l’orientation et ce probablement par l’optimisation du processus d’attention et de plasticité corticale dans l’aire V1. Afin d’étudier les mécanismes pharmacologiques impliqués dans l’amélioration de la perception visuelle, j’ai comparé les PEVs avant et après le couplage de la stimulation visuelle/cholinergique en présence d’agonistes/antagonistes sélectifs. Les injections intracorticales des différents agents pharmacologiques pendant le couplage ont montré que les récepteurs nicotiniques et M1 muscariniques amplifient la réponse corticale tandis que les récepteurs M2 muscariniques inhibent les neurones GABAergiques induisant un effet excitateur. L’infusion d’antagoniste du GABA corrobore l’hypothèse que le système inhibiteur est essentiel pour induire la plasticité corticale. Ces résultats démontrent que l’entrainement visuel jumelé avec la stimulation cholinergique améliore la plasticité corticale et qu’elle est contrôlée par les récepteurs nicotinique et muscariniques M1 et M2. Mes résultats suggèrent que le système cholinergique est un système neuromodulateur qui peut améliorer la perception sensorielle lors d’un apprentissage perceptuel. Les mécanismes d’amélioration perceptuelle induits par l’acétylcholine sont liés aux processus d’attention, de potentialisation à long-terme et de modulation de la balance d’influx excitateur/inhibiteur. En particulier, le couplage de l’activité cholinergique avec une stimulation visuelle augmente le ratio de signal / bruit et ainsi la détection de cibles. L’augmentation de la concentration cholinergique corticale potentialise l’afférence thalamocorticale, ce qui facilite le traitement d’un nouveau stimulus et diminue la signalisation cortico-corticale minimisant ainsi la modulation latérale. Ceci est contrôlé par différents sous-types de récepteurs cholinergiques situés sur les neurones GABAergiques ou glutamatergiques des différentes couches corticales. La présente thèse montre qu’une stimulation électrique dans le télencéphale basal a un effet similaire à l’infusion d’agoniste cholinergique et qu’un couplage de stimulations visuelle et cholinergique induit la plasticité corticale. Ce jumelage répété de stimulations visuelle/cholinergique augmente la capacité de discrimination visuelle et améliore la perception. Cette amélioration est corrélée à une amplification de l’activité neuronale démontrée par immunocytochimie du c-Fos. L’immunocytochimie montre aussi une différence entre l’activité des neurones glutamatergiques et GABAergiques dans les différentes couches corticales. L’injection pharmacologique pendant la stimulation visuelle/cholinergique suggère que les récepteurs nicotiniques, muscariniques M1 peuvent amplifier la réponse excitatrice tandis que les récepteurs M2 contrôlent l’activation GABAergique. Ainsi, le système cholinergique activé au cours du processus visuel induit des mécanismes de plasticité corticale et peut ainsi améliorer la capacité perceptive. De meilleures connaissances sur ces actions ouvrent la possibilité d’accélérer la restauration des fonctions visuelles lors d’un déficit ou d’amplifier la fonction cognitive.

Plasticity of neuroanatomical relationships between cholinergic and dopaminergic axon varicosities and pyramidal cells in the rat medial prefrontal cortex

Les systèmes cholinergique et dopaminergique jouent un rôle prépondérant dans les fonctions cognitives. Ce rôle est exercé principalement grâce à leur action modulatrice de l’activité des neurones pyramidaux du cortex préfrontal. L’interaction pharmacologique entre ces systèmes est bien documentée mais les études de leurs interactions neuroanatomiques sont rares, étant donné qu’ils sont impliqués dans une transmission diffuse plutôt que synaptique. Ce travail de thèse visait à développer une expertise pour analyser ce type de transmission diffuse en microscopie confocale. Nous avons étudié les relations de microproximité entre ces différents systèmes dans le cortex préfrontal médian (mPFC) de rats et souris. En particulier, la densité des varicosités axonales en passant a été quantifiée dans les segments des fibres cholinergiques et dopaminergiques à une distance mutuelle de moins de 3 µm ou à moins de 3 µm des somas de cellules pyramidales. Cette microproximité était considérée comme une zone d’interaction probable entre les éléments neuronaux. La quantification était effectuée après triple-marquage par immunofluorescence et acquisition des images de 1 µm par microscopie confocale. Afin d’étudier la plasticité de ces relations de microproximité, cette analyse a été effectuée dans des conditions témoins, après une activation du mPFC et dans un modèle de schizophrénie par déplétion des neurones cholinergiques du noyau accumbens. Les résultats démontrent que 1. Les fibres cholinergiques interagissent avec des fibres dopaminergiques et ce sur les mêmes neurones pyramidaux de la couche V du mPFC. Ce résultat suggère différents apports des systèmes cholinergique et dopaminergique dans l’intégration effectuée par une même cellule pyramidale. 2. La densité des varicosités en passant cholinergiques et dopaminergiques sur des segments de fibre en microproximité réciproque est plus élevée comparé aux segments plus distants les uns des autres. Ce résultat suggère un enrichissement du nombre de varicosités axonales dans les zones d’interaction. 3. La densité des varicosités en passant sur des segments de fibre cholinergique en microproximité de cellules pyramidales, immunoúactives pour c-Fos après une stimulation visuelle et une stimulation électrique des noyaux cholinergiques projetant au mPFC est plus élevée que la densité des varicosités de segments en microproximité de cellules pyramidales non-activées. Ce résultat suggère un enrichissement des varicosités axonales dépendant de l’activité neuronale locale au niveau de la zone d'interaction avec d'autres éléments neuronaux. 4. La densité des varicosités en passant des fibres dopaminergiques a été significativement diminuée dans le mPFC de rats ayant subi une déplétion cholinergique dans le noyau accumbens, comparée aux témoins. Ces résultats supportent des interrelations entre la plasticité structurelle des varicosités dopaminergiques et le fonctionnement cortical. L’ensemble des donneès démontre une plasticité de la densité locale des varicosités axonales en fonction de l’activité neuronale locale. Cet enrichissement activité-dépendant contribue vraisemblablement au maintien d’une interaction neurochimique entre deux éléments neuronaux.

The effect of a VAChT-saporin immunotoxin on retinal cholinergic amacrine cells during post-natal development in rats

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Nouvelles stratégies d’imageries afin de faciliter l’étude des interactions entre les récepteurs couplés aux protéines G

L’étude de l’assemblage et de l’acheminement à la membrane plasmique des complexes de signalisation des RCPGs va jouer un rôle crucial dans le développement de nouveaux médicaments ayant moins d’effets secondaires. Des outils permettant l’étude de ces phénomènes existent déjà, mais un outil polyvalent qui permettrait d’étudier plusieurs aspects pourrait grandement faciliter et accélérer ces études. L’étiquette SNAP est un candidat intéressant puisqu’avec cette étiquette il est possible de marquer une seule construction avec une variété de différents substrats. Une construction encodant pour le récepteur β2AR avec une étiquette SNAP à son extrémité C-terminale a été ingénérée. Cette construction est apte à lier son ligand, à être acheminée à la membrane plasmique et à homodimériser. La protéine exprimée a été marquée avec le fluorophore BG-430. De la fluorescence non spécifique a été détectée dans la cellule (même en absence de l’étiquette SNAP sur le récepteur). Un essai BRET a été développé, utilisant la construction HA-β2AR-SNAP en tant qu’accepteur et est fonctionnel. L’étiquette SNAP, comme utilisée ici, ne présente pas un aussi bon candidat qu’attendu, puisque le substrat n’ayant pas réagi demeure coincé dans la cellule. Le facteur activateur de plaquette (PAF) et son récepteur (PAFR) jouent un rôle critique dans plusieurs réponses inflammatoires et le récepteur FP est impliqué dans l’accouchement prématuré. Une meilleure compréhension des complexes de signalisation associés à ces récepteurs pourrait être la première étape dans la compréhension de leur signalisation dans des situations normales ou de maladies. Des expériences de BRET étudiant des interactions de bases entre les récepteurs et leurs partenaires d’interactions connus ont été réalisées. Elles ont permis de déterminer que : les récepteurs PAF et FP homodimérisent, que les récepteurs PAF et FP hétérodimérisent, que les protéines Gβγ interagissent de manière constitutive avec ces récepteurs et qu’aucun signal de BRET n’a été détecté avec la protéine Gα et ce, en présence ou en absence de stimulation par un agoniste (suggérant qu’il est nécessaire d’optimiser le système présentement utilisé).

Étude des mécanismes moléculaires menant à la migration cellulaire associée à Rac1 et ARF6.

Le facteur de l’ADP-ribosylation 6 (ARF6) et Rac1 sont des petites protéines liant le GTP qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant le trafic de vésicules, la modification des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels ARF6 et Rac1 agissent de concert afin de contrôler ces différents processus cellulaires restent méconnus. Dans cette étude, nous montrons que, dans les cellules HEK293, ARF6 et Rac1 sont retrouvées en complexe suite à la stimulation du récepteur à l’angiotensine. Des expériences réalisées in vitro nous indiquent que ces deux GTPases interagissent ensemble directement, et que ARF6 s’associe préférentiellement avec la forme inactive de Rac1. L’inhibition de l’expression de ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée en cellule de Rac1 via le facteur PIX, indépendamment de la stimulation d’un récepteur, ce qui provoque la migration non contrôlée des cellules. Les arrestines, protéines de régulation de la désensibilisation des récepteurs couplés aux protéines G, servent de protéines d’échafaudage pour Rac1 et ARF6, en interagissant directement avec les GTPases et en augmentant leur association stimulée par l’angiotensine. De plus, les arrestines permettent l’activation, en s’en dissociant, de la MAP Kinase p38 qui régule l’activité de ARF6 et son interaction précoce avec les arrestines. Mis ensemble, ces résultats montrent que les arrestines contrôlent l’activité de ARF6, en influençant p38. ARF6 joue un rôle inhibiteur sur l’activation basale de Rac1 pour permettre ensuite son recrutement et son activation dépendante de l’angiotensine. Cette étude nous a permis de préciser le mode de régulation mis en jeu dans l’initiation de la migration cellulaire, suite à l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G. Par le fait même, nous avons identifié certains des acteurs impliqués dans ce processus, offrant ainsi de nouvelles cibles pour le traitement des déséquilibres pathophysiologiques de la migration cellulaire.

Évaluation pré-clinique du (–)-[18F]FEOBV: Profil métabolique plasmatique.

Introduction. Plusieurs maladies neurodégénératives bénéficieraient de meilleures ap-proches diagnostiques, dont la maladie d’Alzheimer. Celle-ci affecte en particulier les systèmes cholinergiques du SNC, et de nombreuses études d’imagerie ont tenté d’évaluer la dégénérescence de ce système à des fins diagnostiques, à l’aide de ligands radioactifs de diverses composantes du système ACh. En définitive, la plupart de ces études ne se sont pas montrées satisfaisantes. À la recherche de meilleures approches dans ce domaine, nous avons décidé d’évaluer les possibilités offertes par le (-)-[18F]Fluoroethoxy-benzovesamicol ((-)-[18F]FEOBV), un agent émetteur de positons se liant au VAChT de façon spécifique et réversible. Avant d’en arriver à une utilisation humaine cependant, une validation animale en plusieurs étapes s’avère nécessaire, mais celle-ci nous est apparue justifiée à la lumière de résultats d’études préliminaires en TEP chez le rat, qui se sont montrées très prometteuses. Nous nous sommes donc attaqués à la caractérisation du métabolisme de cet agent. Ceci a exigé, dans un premier temps, la mise au point d’une méthode chromatographique d’analyse des métabolites sanguins et, dans un deuxième temps, l’évaluation de ces métabolites et de leur cinétique chez le rat. Ces données permettront ultérieurement, chez l’humain, de procéder à des études quantitatives en TEP. Étude #1: Une fois les paramètres chromatographiques optimisés, le TR du (–)-FEOBV fut établi à 7.92 ± 0.18 minutes. Étude #2 : Le métabolisme in vivo s’est montré très rapide et temporellement variable, mais un seul métabolite hydrophile a été identifié. La fonction d’apport au cerveau du (–)-[18F]FEOBV a pu être établie après correction pour la présence du métabolite détecté. Conclusion. Dans l’ensemble, le (–)-[18F]FEOBV semble très prometteur en tant que marqueur biologique du système cholinergique pré-synaptique.

Étude du rôle de la tyrosine kinase Src dans la régulation de la signalisation des récepteurs opioïdes delta (∆OR)

Les opioïdes sont les analgésiques les plus efficaces mais leur utilisation est limitée par la tolérance, un processus lié en partie à la désensibilisation des récepteurs. Le rôle de la présente étude était de mieux caractériser le processus de désensibilisation des récepteurs et plus particulièrement, d’étudier le rôle de la tyrosine kinase Src sur la régulation de la signalisation des récepteurs delta opioïdes. Nos résultats démontrent que l’inhibition pharmacologique avec PP2 (à faible concentration : 20- 40µM) ou encore l’inhibition moléculaire de la kinase avec de faibles concentrations d’ADN d’un mutant dominant inactif de Src (0,2µg/ml) potentialise l’amplitude et la durée de l’activation de la cascade ERK lorsqu’un agoniste, DPDPE (1µM; 5 min), se lie aux récepteurs. Nous avons également démontré que de fortes concentrations d’inhibiteurs de Src (80 et 100µM de PP2 ou 1µg/ml d’ADN du mutant dominant négatif) bloquent la cascade des MAPK suivant la stimulation de DOR par l’agoniste DPDPE. Ces observations indiquent que Src a un effet biphasique sur l’activité de ERK : l’inhibition complète de Src inhibe l’activité de la cascade MAPK alors qu’une inhibition modérée potentialise cette même cascade. Nous pensons aussi que de fortes concentrations des bloqueurs de Src interfèrent avec l’activation de ERK alors que de faibles concentrations interfèrent avec la désensibilisation des récepteurs. Cette possibilité a été testée à l’aide d’essais d’accumulation d’AMPc qui visaient à évaluer l’effet des bloqueurs de Src (PP2, 20 µM; 1h) sur la désensibilisation induite par un agoniste. L'activation de DOR par DPDPE inhibe la production d’AMPc, préalablement stimulée par du forskolin, de façon dose-dépendante. Le maximum d'inhibition observé est de 61%, mais lors d’un prétraitement au DPDPE (1 µM, 30 min) l’inhibition maximale est réduite à 72% de l’inhibition initiale observée. Cependant, un prétraitement des cellules au PP2 (20µM pendant 1 heure) avant d’effectuer la désensibilisation protège contre cette désensibilisation. L’effet protecteur des bloqueurs de Src n’entraîne pas de changement au niveau de l’internalisation des DOR mais l’altération de leur internalisation via un mutant tronqué du DOR ou via un milieu sucré hypertonique (0.4M de saccharose) réduit cette protection. Ces données suggèrent alors que l’internalisation optimale du récepteur est nécessaire pour que l’effet protecteur prenne place. Nous concluons donc que Src contribue à la désensibilisation de DOR après que l’internalisation du DOR soit survenue.

The Origin and Stimuli Implicated in the Expression of Nestin(+) Cardiac Myocyte-like Cells in the Ischemic Heart

Nos études ont démontrées que la formation de la cicatrice et la guérison sont associées avec l’apparition de cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) dans la région péri-infarcie. Présentement, l’étude examine le mécanisme, tel que l’hypoxie ou les hormones neuronales, possiblement impliqué dans leur recrutement et de dévoiler leur origine cellulaire. La présence de ces cellules a été détectée dans les coeurs infarcies d’une semaine et maintenue après neuf mois suite à une sujétion coronaire complète. Aussi, ces cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) ont été observées dans le coeur infarci humain. L’hypoxie représente un événement prédominant suite à un infarctus de myocarde, mais l’exposition des rats normaux à un environnement hypoxique n’a pas pu promouvoir l’apparition de ces cellules. Autrement, l’infusion de l’agoniste -adrénergique non-sélectif isoprotérénol (ISO) dans les rats adultes Sprague-Dawley a augmenté la protéine nestine dans le ventricule gauche et a été associé avec la réapparition de cellules de type myocytes cardiaques nestine(+). Cela représente possiblement un effet secondaire suite à la nécrose des myocytes cardiaques par l’administration d’isoprotérénol. Dernièrement, on a identifié une sous-population de cellules nestine(+) dans le coeur normal du rat qui co-exprime les marqueurs de cellules cardiaques progénitrices Nkx-2.5 et GATA-4. Cette sous-population de cellules nestine/Nkx-2.5/GATA-4 pourrait représenter des substrats cellulaires qui puissent se différentier en cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) suite à une ischémie. Mots clés: nestine, isoprotérénol, nécrose, cellule souche, cellule progénitrice, myocyte cardiaque

Comparaison des mécanismes de régulation des isoformes a et b des récepteurs 5-HT4

Les actions thérapeutiques des antidépresseurs, disponibles actuellement, requièrent plusieurs semaines de traitement. Ce délai est dû aux adaptations des sites pré et post-synaptiques qui, respectivement, augmentent la disponibilité synaptique des monoamines sérotonine et noradrénaline (5-HT et NA), et entraînent les changements neuroplastiques modifiant la fonction neuronales dans les régions limbiques. Il a été récemment observé, chez un modèle animal de dépression, que l’agoniste RS67333 des récepteurs sérotoninergiques de type 5-HT4 produisait des changements comportementaux, électrophysiologiques, cellulaires et biochimiques, tel qu’observé chez les antidépresseurs. Ces changements apparaissent seulement après 3 jours de traitement tandis que les antidépresseurs nécessitent souvent plusieurs semaines. De plus, l’activation des récepteurs 5-HT4 ne générait pas de tolérance, et cela pendant 21 jours de traitement. Seulement, les propriétés de signalisation et de régulation de ces récepteurs sont très loin d’êtres établies. Nous avons alors voulu mieux caractériser ces deux aspects de leur fonction, en se concentrant d’avantage sur les isoformes a et b, fortement exprimés dans le système limbique. Pour cela, nous avons voulu évaluer d’abord leur capacité de production d’AMPc dans un système hétérologue. Les essais d’accumulation d’AMPc démontrent que les deux isoformes sont capables de moduler positivement et négativement des niveaux d’AMPc en présence de 5-HT. Par contre, la stimulation au RS67333 induit seulement une augmentation du niveau d’AMPc dans les deux cas. Ensemble, ces observations indiquent que les deux isoformes sont capables de coupler à l’adénylate cyclase à travers les protéines Gαs et Gαi. La quantification des récepteurs internalisés a montré que l’isoforme b internalisait plus efficacement que l’isoforme a suite à l’incubation à la 5-HT (61 ± 3 % pour le b vs 40 ± 2 % pour le a). Les protéines kinases PKA et PKC n’étaient pas impliquées dans cette différence, toutefois, la PKC a été trouvée essentielle à l’internalisation des deux isoformes. L’internalisation de l’isoforme b par 5-HT n’a pas été affecté par la surexpression de forme inactive de GRK2 (GRK2- K220R) et a été partiellement inhibé par un mutant négative de la β-arrestine (βarr(319-418)), tandis que l’internalisation de l’isoforme a a été bloquée par les deux. Ces observations indiquent que les mécanismes d’internalisation des deux isoformes du récepteur 5-HT4 les plus abondants dans le système nerveux central sont distincts. Des comportements spécifiques à chaque isoforme ont aussi été constatés au niveau de la régulation fonctionnelle suite à l’exposition au RS67333, qui désensibilise seulement l’isoforme b. D’après nos observations, nous avons conclu que les isoformes a et b diffèrent dans leur propriétés de signalisation et de régulation. L’incapacité du RS67333 à désensibiliser l’isoforme a fournit un substrat moléculaire pour les effets antidépressifs prolongés de cet agoniste dans les études pré-cliniques.

Modulation allostérique de la fonction des récepteurs FP et PAF

Les récepteurs couplés aux protéines-G (RCPGs) constituent la première étape d’une série de cascades signalétiques menant à la régulation d’une multitude de processus physiologiques. Dans le modèle classique connu, la liaison du ligand induit un changement de conformation du récepteur qui mène à sa forme active. Une fois activés, les RCPGs vont réguler l’activité d’une protéine membranaire cible qui peut être tant une enzyme qu’un canal ionique. L’interaction entre le récepteur et la cible nécessite l’intermédiaire d’une protéine hétérotrimérique appelée « protéine G », qui est activée pour favoriser l’échange du GDP (guanosine diphosphate) pour un GTP (guanosine triphosphate) et assurer la transduction du signal du récepteur à l’effecteur. Les mécanismes moléculaires menant à l’activation des effecteurs spécifiques via l’activation des RCPGs par les protéines G hétérotrimériques sont encore plutôt méconnus. Dans notre étude nous nous sommes intéressés aux récepteurs FP et PAF, à leurs ligands naturels, la PGF2α et le Carbamyl-PAF respectivement, et à des ligands à action antagoniste sur ces récepteurs. Des ligands considérés comme agonistes, sont des molécules qui interagissent avec le récepteur et induisent les mêmes effets que le ligand naturel. Les antagonistes, par contre, sont des molécules qui interagissent avec le récepteur et bloquent l’action du ligand naturel en prévenant le changement conformationnel du complexe, et ils peuvent avoir une action compétitive ou non-compétitive. Nous avons étudié aussi des ligands orthostériques et allostériques du récepteur FP des prostaglandines et du récepteur PAF. Un ligand orthostérique peut se comporter comme agoniste ou antagoniste en se fixant au site de liaison du ligand (agoniste) naturel. Un ligand allostérique est un agoniste ou antagoniste se fixant à un site autre que celui du ligand naturel entraînant un changement de conformation ayant pour conséquence soit une augmentation (effecteur positif), soit une diminution (effecteur négatif) de l'activité du ligand naturel.

Rôle des GTPases ARF dans la migration des cellules endothéliales et la sécrétion du NO

ARF6 et ARF1 sont des petites GTPases de la famille des ARF(s) qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant, la formation et le mouvement des vésicules, la transformation des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. À ce jour, le rôle de la protéine ARF6 et de la protéine ARF1 dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) dans les cellules endothéliales est encore très peu étudié. Le but de cette étude a été de caractériser le rôle de la protéine ARF6 dans la migration des cellules endothéliales induite par l’endothéline-1, ainsi que le rôle de la protéine ARF1 dans la sécrétion du monoxyde d’azote (NO) stimulées par le VEGF. Dans cette étude, nous montrons qu’ARF6 est essentielle à la migration des cellules endothéliales induite par l’endotheline-1. L’inhibition de l’expression d’ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée de la kinase FAK et son association constitutive avec Src. Par ailleurs, cette inhibition affecte l’association entre GIT1 et la kinase FAK. Ceci se traduit par une inhibition du désassemblage des contacts focaux et une augmentation de l’adhésion cellulaire menant à une diminution de la motilité. De plus, nos résultats montrent que la protéine ARF1 est essentielle à l’activation d’eNOS et à la sécrétion du NO suite à l’activation du VEGFR2 dans les cellules endothéliales BAEC. En effet, l’inhibition de l’expression d’ARF1 par interférence à l’ARN entraîne une inhibition du recrutement de la kinase Akt à la membrane plasmique et une inhibition de son activation induite par le VEGF. L’inhibition de l’activation de la kinase Akt par le VEGF conduit à une inhibition de l’activation de eNOS et de la sécrétion du NO. Dans l’ensemble, nos résultats montrent que les protéines ARF6 et ARF1 sont essentielles à la signalisation de l’ETB et du VEGFR2 pour les processus menant à la migration cellulaire et à la sécrétion du NO respectivement, deux évènements essentiels à l’angiogenèse.

Rôle du dimère Gbetagamma dans l’organisation des systèmes de signalisation cellulaire

Selon le modèle classique, le signal reçu par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) se propage suite à des interactions transitoires et aléatoires entre les RCPGs, les protéines G et leurs effecteurs. Par les techniques de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), de complémentation bimoléculaire de protéines fluorescentes (BiFC) et de co-immunoprécipitation, nous avons observé que les récepteurs, les protéines G et les effecteurs forment un complexe stable, avant et après l’activation des récepteurs. L’interaction entre l’effecteur Kir3 et le dimère Gbetagamma se produit initialement au réticulum endoplasmique et est sensible à un agoniste liposoluble des récepteurs beta2-adrénergiques. Bien que peu de spécificité pour les nombreux isoformes des sous-unités Gbetagamma ait été observée pour l’activation du canal Kir3, les interactions précoces au RE sont plus sensibles aux différentes combinaisons de Gbetagamma présentes. En plus de son rôle dans la régulation des effecteurs, le dimère Gbetagamma peut interagir avec de nombreuses protéines possédant des localisations cellulaires autres que la membrane plasmique. Nous avons identifié une nouvelle classe de protéines interagissant avec la sous-unité Gbeta, autant en système de surexpression que dans des extraits de cerveaux de rats, soit les protéines FosB et cFos, qui forment le complexe de transcription AP-1, suite à leur dimérisation avec les protéines de la famille des Jun. La coexpression du dimère Gbetagamma réduit l’activité transcriptionnelle du complexe AP-1 induit par le phorbol 12-,myristate 13-acetate (PMA), sans toutefois interférer avec la formation du complexe Fos/Jun ou son interaction avec l’ADN. Toutefois, le dimère Gbetagamma colocalise au noyau avec le complexe AP-1 et recrute les protéines histones déacétylases (HDAC) afin d’inhiber l’activité transcriptionnelle du complexe AP-1.

Administration d'Eugénol intrathécal pour le traitement de la douleur neuropathique

Le projet porte sur l’étude de l’effet de l’eugénol, composant principal du clou de girofle, sur la douleur neuropathique. L’objectif principal du projet était de déterminer la contribution du système nerveux central dans l’effet analgésique de l’eugénol. Lors d’une étude préliminaire, la pénétrabilité de l’eugénol a été évaluée dans le système nerveux central du rat. Des échantillons de sang, de cerveau et de moelle épinière ont été prélevés et les concentrations d’eugénol dans ces différents tissus ont été analysées à l’aide d’un spectromètre de masse. Les résultats ont montré que l’eugénol pénètre bien le système nerveux central avec une distribution plus importante dans la moelle épinière. Après l’induction de la douleur neuropathique à des rats Sprague-Dawley par le modèle de ligatures du nerf sciatique, des injections intrathécales d’eugénol furent réalisées afin d’évaluer l’effet central de l’eugénol. La plus forte dose d’eugénol a atténué l’allodynie secondaire après 15min, 2h et 4h et a aussi amélioré l’hyperalgésie thermique après 2h et 4h. Ces résultats confirment l’hypothèse que l’eugénol atténue les deux aspects de la douleur neuropathique que sont l’allodynie et l’hyperalgésie. Les injections au niveau lombaire permettent de penser que l’eugénol, un agoniste/antagoniste des récepteurs vanilloïdes pourrait diminuer la douleur neuropathique en agissant notamment au niveau des récepteurs vanilloïdes situés dans la corne dorsale de la moelle épinière.

Étude du rôle de la dopamine et de la sérotonine dans l’effet atténuateur des antipsychotiques et de l’OSU-6162 sur la récompense induite par la stimulation du faisceau médian prosencéphalique chez le rongeur

La voie mésocorticolimbique est constitutée d’un ensemble d’éléments nerveux issus de l’aire tegmentaire ventrale mésencéphalique et projettant vers des régions corticales et sous-corticales. Les neurones à dopamine (DA) qui en font partie modulent plusieurs fonctions cognitives dont l’attention, l’apprentissage et la récompense. L’activité nerveuse des cellules à DA augmente lorsque l’organisme anticipe et reçoit une récompense, ainsi qu’au cours de la phase d’apprentissage des comportements d’appétence. Or, si l’activité dopaminergique de la voie mésocorticolimbique est désordonnée, voire aberrante, des stimuli neutres deviennent saillants et prennent une signification erronée. Cette anomalie fonctionnelle du système dopaminergique pourrait être à l’origine des symptômes psychotiques observés dans la schizophrénie. Cette hypothèse est renforcée par le fait que les médicaments antipsychotiques efficaces ont tous une activité antagoniste aux récepteurs à DA de type 2 (D2); les antipsychotiques dits classiques (i.e. halopéridole) possèdent une forte affinité pour les récepteurs D2 tandis que les antipsychotiques dits atypiques (i.e. clozapine) présentent une plus forte affinité pour les récepteurs à sérotonine de type 2a (5-HT2a) que pour les récepteurs D2. Les antipsychotiques atypiques semblent plus efficaces contre les symptômes négatifs (i.e. anhédonie) de la schizophrénie et induisent moins d’effets moteurs extrapyramidaux et de dysphorie que les antipsychotiques classiques. Il a été proposé que l’efficacité des antipsychotiques atypiques soit expliqué par leur double action antagoniste aux récepteurs 5-HT2a et D2. Afin de mieux comprendre les mécanismes de ces médicaments, nous avons étudié leurs effets sur la récompense en utilisant le modèle d’autostimulation intracérébrale (ASI) chez le rongeur. Le but de la première étude était d’évaluer l’effet d’un antagoniste sélectif des récepteurs 5-HT2a, le M100907, sur la récompense et sur l’atténuation de la récompense induite par l’halopéridole. L’hypothèse était que l’atténuation de la récompense induite par l’ajout du M100907 à l’halopéridole serait similaire à celle induite par la clozapine. Dans une seconde étude, l’effet sur la récompense d’un agoniste partiel aux récepteurs D2, l’OSU-6162, a été caractérisé sous deux conditions : i) en condition de base et ii) lorsque la neurotransmission dopaminergique est altérée par l’administration systémique de quinpirole, un agoniste des récepteurs D2/D3. Les hypothèses étaient que l’OSU-6162 i) atténuerait la récompense induite par la stimulation et ii) empêcherait l’atténuation et la facilitation de la récompense induites par le quinpirole. Les données obtenues montrent que le M100907 n’altère pas la récompense par lui-même mais réduit l’atténuation de la récompense induite par l’halopéridole. La co-administration du M100907 et de l’halopéridole induit une atténuation de la récompense d’amplitude similaire à celle induite par la clozapine, ce qui suggère que l’activité antagoniste aux récepteurs 5-HT2a de la clozapine contribue à son efficacité. Les données de la seconde étude montrent que l’OSU-6162 atténue la récompense, de manière dose-dépendante, ainsi que la facilitation, mais pas l’atténuation de la récompense induite par le quinpirole. Cette dernière observation suggère que l’OSU-6162 agit comme un antagoniste fonctionnel aux récepteurs D2 post-synaptiques. Un ensemble de données suggèrent que le comportement d’ASI constitue un modèle valide permettant d’évaluer l’efficacité antipsychotique potentielle de nouvelles molécules. Le comportement d’ASI est atténué par les antipsychotiques cliniquement efficaces mais est peu ou pas modifié par des molécules dépourvues d’activité antipsychotique. Les données obtenues dans cette thèse permettent de supposer que l’OSU-6162 possède une activité antipsychotique de nature atypique, et cela sans altérer la neurotransmission sérotoninergique.

Rôle de GPR40 dans la survie et la prolifération cellulaires induites par l’oléate dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de cancer de la prostate DU145

La relation entre l’obésité et le cancer, bien qu’établie par des études épidémiologiques, est peu connue. Pourtant, environ 25 % des cancers pourraient y être attribuables. Parmi les cancers reliés à l’obésité, les cancers du côlon, du sein chez les femmes ménopausées et de la prostate sont les plus fréquents. Des études sur modèles animaux ont suggéré une association positive entre une diète riche en gras et le développement du cancer mammaire et de la prostate. Nous avons étudié les mécanismes moléculaires par lesquels les acides gras influencent le devenir de lignées de cellules cancéreuses du sein et de la prostate. Ces travaux ont montré que les acides gras insaturés, dont l’oléate, induisent la prolifération cellulaire tandis que les acides gras saturés, dont le palmitate, diminuent la prolifération. Un traitement à l’oléate stimule la formation de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145 alors qu’un traitement au palmitate entraîne l’apoptose. Le mécanisme d’action de l’oléate sur la prolifération a été étudié de façon plus approfondie. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques nous a permis de déterminer que l’effet prolifératif de l’oléate implique la voie PI3K/Akt, la voie ERK1/2 et l’activation d’un ou de plusieurs récepteur(s) couplé(s) aux protéines G (GPCR). L’oléate induit la phosphorylation rapide des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145. Au cours des dernières années, deux GPCRs ont été identifiés comme étant activables par des acides gras à moyennes et à longues chaînes, GPR40 et GPR120. GPR40 étant exprimé dans plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein et de la prostate contrairement à l’expression de GPR120 qui était inexistante dans la plupart des lignées, nous avons étudié l’implication de GPR40 dans l’effet prolifératif de l’oléate. Ces deux récepteurs n’étant pas exprimés dans les cellules épithéliales mammaires humaines en culture primaire, ces cellules ne répondent pas aux effets de l’oléate sur la prolifération et l’activation des voies de signalisation. L’activation des voies Akt et ERK1/2 par l’oléate dans les cellules MDA-MB-231 et DU145 est potentialisée par la surexpression du récepteur GPR40 et inhibée par l’utilisation d’un siRNA dirigé contre ce récepteur. Cependant, la prolifération induite par l’oléate ne semble pas affectée par la présence d’un siRNA dirigé contre GPR40. L’oléate étant un acide gras, il est capable d’entrer librement dans les cellules et une partie de ses effets sur la prolifération pourrait être attribuée à sa métabolisation. Un agoniste de GPR40, le GW9508, est en mesure d’activer GPR40 sans toutefois entrer dans les cellules ni activer le métabolisme de l’oléate. Le GW9508 stimule la phosphorylation des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules du cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145, mais il n’est pas en mesure d’induire la prolifération cellulaire comme le fait l’oléate. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le mécanisme d’action de l’oléate sur les cellules de cancer du sein et de la prostate. L’oléate induit la signalisation de GPR40 qui est impliquée dans l’activation rapide des voies de signalisation Akt et ERK1/2. De son côté, l’effet prolifératif induit par l’oléate s’effectue par un mécanisme GPR40-indépendant, possiblement lié au métabolisme de l’oléate.