Modulation de l’expression du gène CFTR par le produit du gène FIC1 responsable de la cholestase familiale intra-hépatique progressive de type 1 : Identification des mécanismes moléculaires impliqués

Réalisé en cotutelle avec l'Université de Cergy-Pontoise

Nutrition parentérale du nouveau-né : modulation du stress oxydant et conséquences hépatiques

Introduction : Les enfants prématurés ont la particularité de naître alors que leur développement est souvent incomplet et nécessite la mise en œuvre de soins intensifs visant à poursuivre leur croissance en dehors de l’environnement utérin. Souvent cependant, le stade développemental de l’enfant ne lui permet pas d’assimiler une alimentation entérale du fait de l’immaturité de son système digestif. Le recours à une voie centrale délivrant les nutriments assurant le développement devient alors une nécessité. Ce type de nutrition, appelée nutrition parentérale (NP, ou total parenteral nutrition TPN), permet l’administration de molécules simples, directement dans le sang du prématuré. Il n’est toutefois pas exempt de risques puisqu’exposée à la lumière, la NP peut s’oxyder et générer des molécules oxydantes telles que des hydroperoxydes lipidiques susceptibles de se fragmenter par la suite en hydroxy-alkénals. Ceci devient problématique au vu de l’immaturité des systèmes de défenses antioxydants du nouveau-né prématuré. L’utilisation prolongée de la NP est d’ailleurs à l’origine de maladie hépatiques dans lesquelles le stress oxydant et la nécro-inflammation sont des composantes majeures. Nous avons émis l’hypothèse que l’infusion chez les enfants prématurés, d’aldéhydes d’origine lipidique est en relation avec le développement du stress oxydant et de l’inflammation hépatique. Objectif : Notre étude a consisté à évaluer la relation entre les quantités d’hydroxy-alkénals dans la NP et les effets hépatiques engendrés sur les marqueurs de stress oxydant et les voies de signalisation responsables d’une induction de processus inflammatoire. Dans ce but, nous avons cherché à mesurer la peroxydation lipidique dans l’émulsion lipidique de la NP et la conséquence de l’infusion en continue d’hydroxy-alkénals sur les marqueurs de stress oxydant, sur la voie de signalisation médiée par le Nuclear Factor κB et sur le déclenchement du processus inflammatoire hépatique. A la suite de ce travail, nous avons également travaillé sur des alternatives à la photoprotection, qui est la seule méthode réellement optimale pour réduire la peroxydation des lipides de la NP, mais cliniquement difficilement praticable. Résultats : Nos résultats ont mis en évidence la génération de 4-hydroxynonenal in vitro dans la NP, ce phénomène est augmenté par une exposition lumineuse. Dans ce cadre, nous avons montré l’inefficacité de l’ajout de multivitamines dans l’émulsion lipidique comme alternative à la photoprotection. Dans la validation biologique qui a suivi sur un modèle animal, nos résultats ont permis de démontrer que l’augmentation des adduits glutathion-hydroxynonenal était imputable à l’augmentation de 4-hydroxynonenal (4-HNE) dans la NP, et non à une peroxydation endogène. Nos données indiquent que la probable augmentation hépatique des niveaux de 4-HNE a conduit à une activation du NFκB responsable de l’activation de la transcription des gènes pro-inflammatoires du Tumour Necrosis Factor-α (TNF-α) et de l’interleukine-1 (IL-1). Nous avons alors évalué la capacité d’une émulsion lipidique enrichie en acides gras polyinsaturés (AGPI) n-3 à baisser les concentrations de 4-HNE dans la NP, mais également à moduler le stress oxydant et les marqueurs pro-inflammatoires. Enfin, nous avons démontré, en collaboration avec l’équipe du Dr Friel, que certains peptides isolés du lait humain (par un processus mimant la digestion) permettent également une modulation du stress oxydant et du processus inflammatoire. Conclusion : Le stress oxydant exogène issu de la NP a conduit par activation de facteurs de transcription intra-hépatiques au déclenchement d’un processus inflammatoire potentiellement responsable du développement de maladies hépatiques reliées à la NP telle que la cholestase. Dans ce sens, les AGPI n-3 et les peptides antioxydants peuvent se poser en tant qu’alternatives crédibles à la photoprotection.

Les partenaires d'interactions de Cirhin, la protéine portant la mutation responsable de la Cirrhose Amérindienne Infantile (NAIC)

La Cirrhose Amérindienne Infantile (CAI, NAIC) est une forme de cholestase non-syndromique héréditaire à transmission autosomique récessive, décrite uniquement chez les enfants autochtones du Nord-Ouest québécois et issue d’un effet fondateur. La maladie se présente d’abord sous la forme d’une jaunisse néonatale chez un enfant autrement en bonne santé, qui progresse en cirrhose de type biliaire dans l’enfance et dans l’adolescence. Le taux de survie à l’âge adulte est inférieur à 50% et la seule thérapie efficace à ce jour pour les patients avancés dans la maladie demeure la transplantation hépatique. Les recherches antérieures menées par le groupe ont permis d’identifier le locus ainsi que le gène responsable de NAIC, qui encode la protéine nucléolaire Cirhin. Cirhin est exprimée uniquement dans le foie et tous les patients sont homozygotes pour la mutation R565W. La fonction de Cirhin est inconnue, mais les motifs WD40 retrouvés dans sa séquence indiquent qu’elle participerait à des interactions protéine-protéine et serait impliquée dans un mécanisme moléculaire de base. Cirhin interagit avec la protéine nucléaire Cirip, qui a un effet positif important sur la transcription de l’élément activateur HIV-1 LTR et qui a un rôle dans la prolifération cellulaire. L’interaction de Cirhin et Cirip est affectée par la mutation R565W. À l’aide de la technique du double hybride chez la levure, la protéine nucléolaire Nol11 a été identifiée comme étant un partenaire d’interaction de Cirhin. Par son interaction avec MARK3 et c-Myc, Nol11 serait impliquée dans des processus cellulaires tels que le contrôle du cycle cellulaire, la polarité, la croissance cellulaire et possiblement la biogenèse des ribosomes. La portion C-terminale de Nol11 interagirait avec Cirhin, et la mutation R565W abolit cette interaction. Le résidu R565 serait donc important pour la fonctionnalité de Cirhin.

Carence en œstrogènes et bases moléculaires du métabolisme des triglycérides et du cholestérol dans le foie et l'intestin : effet de l'exercice physique

La stéatose hépatique et la détérioration du profil lipidique plasmatique sont des pathologies métaboliques favorisées par la carence œstrogénique post-ménopausique. Cependant les mécanismes à la base de ces pathologies n’ont été que très peu étudiés. Le but de cette thèse a été d’investiguer les mécanismes moléculaires possibles à l’origine de l’hypercholestérolémie et de l’accumulation des lipides (triglycérides : TG et cholestérol) dans le foie en utilisant un modèle animal de la ménopause, la rate Sprague Dawley ovariectomisée (Ovx). Nous avons également examiné si le changement des habitudes de vie comme la pratique de l’exercice physique pouvait prévenir ou corriger les modifications induites par l’Ovx. Enfin, rosuvastatine (statine) a été utilisée comme thérapie pharmacologique de l’hypercholestérolémie dans le but de comprendre son effet au niveau moléculaire chez la rate Ovx. L’objectif de la première étude était de déterminer comment l’Ovx peut affecter les niveaux de TG et de cholestérol dans le foie des rates nourries avec une diète riche en lipides (HF : 42% gras). Les rates ont été soumises à la diète HF ou normale pendant 6 semaines avant d’être Ovx ou Sham (ovariectomie simulée), puis maintenues aux mêmes conditions diététiques pour 6 autres semaines. L’Ovx a provoqué une accumulation de TG dans le foie, mais pas la diète HF seule. Cependant, lorsque l’Ovx était combinée à la diète HF, l’accumulation des TG était beaucoup plus importante comparé à ce qui était observé chez les rates Ovx soumises à la diète normale. L’expression génique (ARNm) de CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1), PGC1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1) et PPARα (Peroxysome proliferetor activated receptor alpha) intervenant dans l’oxydation des acides gras dans le foie était augmentée par la diète HF (p ˂ 0.001; p ˂ 0.01; p ˂ 0.05 respectivement) ; mais atténuée (p ˂ 0.05; p ˂ 0.05; p ˂ 0.07 respectivement) lorsque les rates ont été Ovx, favorisant ainsi l’accumulation des TG dans le foie. La combinaison de la diète HF à l’Ovx a également provoqué une hypercholestérolémie et une accumulation de cholestérol dans le foie malgré la diminution de l’expression de la HMGCoA-r (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase), enzyme clé de la synthèse du cholestérol. Ceci était associé à l’inhibition de l’expression génique de CYP7a1 (Cytochrome P450, family 7, subfamily a, polypeptide 1), suggérant une diminution de la synthèse des acides biliaires. Ayant constaté dans la première étude que l’Ovx élevait les niveaux de cholestérol hépatique et plasmatique, nous nous sommes fixés comme objectif dans la deuxième étude d’évaluer les effets de l’Ovx sur l’expression génique des transporteurs et enzymes responsables du métabolisme du cholestérol et des acides biliaires dans le foie et l’intestin, et de vérifier si l’exercice sur tapis roulant pouvait prévenir ou corriger les changements causés par l’Ovx. L’hypercholestérolémie constatée chez les rates Ovx comparativement aux Sham était accompagnée de la diminution de l’expression génique des récepteurs des LDL (R-LDL), des résidus de lipoprotéines (LRP1), de SREBP-2 (Sterol regulatory element binding protein 2) et de PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) dans le foie, suggérant une défaillance dans la clairance des lipoprotéines plasmatiques. L’Ovx a aussi inhibé l’expression génique de la MTP (Microsomal triglyceride transfer protein) et stimulé celle de SR-B1 (Scavenger receptor class B, member 1); mais aucun changement n’a été observé avec CYP7a1. Ces changements moléculaires pourraient par conséquent favoriser l’accumulation de cholestérol dans le foie. L’exercice physique n’a pas corrigé les modifications causées par l’Ovx sur l’expression génique de ces molécules au niveau hépatique à l’exception de SREBP-2. Par contre, au niveau intestinal (iléum), l’exercice sur tapis roulant a inhibé l’expression génique des marqueurs moléculaires intervenant dans l’absorption des acides biliaires (OSTα/β, FXR, RXRα, Fgf15) et du cholestérol (LXRα, NCP1L1) au niveau de l’iléum chez les rates Sham entraînées. Ces adaptations pourraient prévenir le développement de l’hypercholestérolémie protégeant en partie contre la survenue de l’athérosclérose. Au vue des effets délétères (hypercholestérolémie et diminution de l’expression du R-LDL, PCSK9, LRP1, SREBP-2 et HMGCOA-r dans le foie) causés par l’Ovx sur le métabolisme du cholestérol constatés dans l’étude 2, la 3ième étude a été conçue pour évaluer l’efficacité de rosuvastatine (Ros) sur l’expression génique de ces marqueurs moléculaires chez les rates Ovx sédentaires ou soumises à l’entraînement volontaire. Ros a été administrée aux rates Ovx pendant 21 jours par voie sous-cutanée à la dose de 5mg/kg/j à partir de la 9ième semaine après l’Ovx. Ros n’a pas diminué la concentration plasmatique de LDL-C et de TC chez les rates Ovx. Par contre, Ros a stimulé (P ˂ 0.05) l’expression génique de PCSK9, SREBP-2, LRP1, HMGCoA-r et ACAT2 (Acyl-CoA cholesterol acyltransferase) mais pas significativement (P = 0.3) celle du R-LDL dans le foie des rates Ovx sédentaires et entraînées. Ros n’a pas réduit la concentration plasmatique de LDL-C probablement à cause de l’induction plus importante de PCSK9 par rapport au R-LDL. Cependant, la stimulation de LRP1 par Ros protège partiellement contre la survenue des maladies cardiovasculaires. En conclusion, les études de cette thèse indiquent que la baisse du niveau des œstrogènes entraîne des changements radicaux du métabolisme hépatique des TG et du cholestérol provoqués par des altérations de l’expression des gènes clés des voies métaboliques associées.