Optimisation et évaluation d’un nouveau test PAMPA amélioré pour la prédiction de l’absorption intestinale de médicaments.

Ce mémoire rapporte l’optimisation et l’évaluation d’une nouvelle version du test PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeability Assay) appelée Néo-PAMPA. Ce test qui permet la prédiction de l’absorption intestinale de médicaments consiste en l’utilisation d’une membrane modèle de la paroi intestinale composée d’une bicouche lipidique déposée sur un coussin de polydopamine recouvrant un filtre poreux. En effet, nous nous sommes intéressés lors de ce projet à la mise en place d’une membrane artificielle qui serait plus représentative de la paroi intestinale humaine. Nous avons pu déterminer, suite à une étude comparative des propriétés de huit médicaments ainsi que les coefficients de perméabilité obtenus, que les filtres en polycarbonate présentaient le meilleur choix de support solide pour la membrane. Nous avons également vérifié la déposition du coussin de polydopamine qui apporte le caractère fluide à la bicouche lipidique. Les résultats des tests de perméabilité ont démontré que le coussin de polymère n’obstrue pas les pores du filtre après un dépôt de 4h. Nous avons par la suite étudié la déposition de la bicouche lipidique sur le filtre recouvert de polydopamine. Pour ce faire, deux méthodes de préparation de liposomes ainsi que plusieurs tailles de liposomes ont été testées. Aussi, la composition en phospholipides a été sujette à plusieurs changements. Tous ces travaux d’optimisation ont permis d’aboutir à des liposomes préparés selon la méthode du « film lipidique » à partir d’un mélange de dioléoylphosphatidylcholine (DOPC) et de cholestérol. Une dernière étape d’optimisation de la déposition de la bicouche reste à améliorer. Enfin, le test standard Caco-2, qui consiste à évaluer la perméabilité des médicaments à travers une monocouche de cellules cancéreuses du colon humain, a été implémenté avec succès dans le but de comparer des données de perméabilité avec un test de référence.

Validation et conditionnement d'un test PAMPA amélioré pour l'évaluation de la perméabilité membranaire de médicaments.

Les tests PAMPA et les tests Caco-2 sont des essais in vitro de l’évaluation de la perméabilité intestinale des médicaments. Ils sont réalisés lors de la phase de découverte du médicament. Les tests PAMPA ne sont pas biologiquement représentatifs de la paroi intestinale, mais ils sont rapides et peu coûteux. Les tests Caco-2 nécessitent plus de 21 jours pour la culture cellulaire et des installations spécifiques sont requises. Ils sont constitués d’une monocouche d’entérocytes à confluence et donc plus biologiquement représentatifs. Il y a un besoin pour le développement d’un essai qui est biologiquement représentatif de la membrane intestinale humaine, rapide et peu coûteux. Le premier but de ce projet était de développer une méthode analytique qui permettrait l’évaluation simultanée de huit médicaments témoins utilisés pour la validation de l’essai de perméabilité. Le deuxième but de ce projet était donc d’améliorer la membrane des tests PAMPA pour proposer un nouveau test : le néoPAMPA. Contrairement au test PAMPA traditionnel, cette membrane est constituée de trois composantes : (1) un filtre poreux qui agit à titre de support, (2) un coussin polydopamine chargé négativement qui sert d’ancrage et qui assure la fluidité de la bicouche et (3) une bicouche lipidique formée par fusion de vésicules. Une méthode analytique HPLC-MS/MS a été validée selon les spécifications de la FDA et de la EMA. Cette méthode a permis de quantifier simultanément les huit médicaments standards utilisés pour le test néoPAMPA. Le test PAMPA traditionnel a été mis en place à titre d’essai control. Les coefficients de perméabilité mesurés pour les huit médicaments au travers de la membrane PAMPA comparaient favorablement aux résultats de la littérature. Les composantes de la membrane néoPAMPA ont été optimisées. Les conditions optimales retenues étaient les filtres de polycarbonate hydrophile ayant des pores de 15 nm, les plaques Costar 12 puits comme dispositif des tests de perméabilité, une bicouche lipidique composée de 70 % DOPC et de 30 % cholestérol cationique ainsi qu’une déposition des liposomes en présence de 150 mM NaCl suivi d’un équilibre d’1 h en présence d’une solution saturée en DOPC. Les stabilités de la cassette de médicaments et des liposomes sont insuffisantes pour le conditionnement commercial des membranes néoPAMPA. Les différentes optimisations réalisées ont permis d’améliorer la membrane néoPAMPA sans toutefois la rendre fonctionnelle. La membrane néoPAMPA n’est toujours pas en mesure de discriminer des molécules en fonction de leur perméabilité attendue.