Portée et limites de l'encadrement juridique de la xénotransplantation : étude de droit comparé

"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Maître en droit (LL.M.)"

Caractérisation de la SERPINA1, une antiprotéase différentiellement exprimée dans le cancer épithélial de l’ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive (TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité ou borderline (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN U133 d’Affymetrix a révélé que la SERPINA1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. La validation par Q-PCR nous a confirmé que cette antiprotéase est majoritairement surexprimée dans les tumeurs LMP, par rapport aux tumeurs bénignes (BOV) et aux tumeurs TOV. Nous avons donc surexprimé la SERPINA1 dans les lignées cellulaires invasives TOV 112D et TOV 1946 du cancer de l’ovaire et dérivé des clones stables. Les résultats obtenus nous indiquent que la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la capacité d’invasion et de migration cellulaire et non au niveau de la croissance cellulaire et la formation de structures tridimensionnelles. Les résultats issus de l’étude in vivo dans les souris SCID nous permettront de déterminer si la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la tumorigénèse ovarienne. Ainsi, la SERPINA1 demeure à notre avis un candidat d’intérêt pour tenter de mieux comprendre les différences biologiques entre les tumeurs LMP et TOV, ainsi que le rôle des protéases et de leurs inhibiteurs dans la progression tumorale du cancer de l’ovaire.

Étude de l'activité anti-cancéreuse du PCK3145, un peptide dérivé de PSP-94, sur les cancers hématologiques

Le PCK3145 est un peptide de 15 acides aminés inhibant la sécrétion de MMP-9 et démontrant une activité anti-tumorale contre le cancer de la prostate. Comme les cancers hématologiques sécrètent MMP-9, nous avons donc évalué l’effet du PCK3145 sur ces cancers. Nous avons démontré que les lignées humaines de lymphome non- Hodgkinien (LNH) SR et de myélome multiple RPMI-8226 ainsi que la lignée murine de mastocytome P815 ont une prolifération réduite suite à une exposition au PCK3145. Ce peptide diminue également la clonogénicité de ces cellules. In vivo, le PCK3145 diminue significativement la croissance des tumeurs sous-cutanées P815 comparativement au PBS (p<0.001) et aux peptides contrôles (« scrambled peptide » (p<0.05) et PCK5266 (p<0.01)). De plus, le traitement au PCK3145 diminue le nombre de métastases au niveau du foie par rapports aux contrôles (p<0.05). Les niveaux de MMP-9 dans le sang des souris traitées au PCK3145 sont similaires à ceux dans le sang des souris sans tumeur. Par contre, chez les souris recevant le PBS ou le « scrambled peptide », les niveaux de MMP-9 étaient significativement plus élevés que dans les souris sans tumeur et les souris traitées au PCK3145 (p<0.05). De surcroît, dans un modèle de xénogreffe, le PCK3145 diminue significativement la croissance des lymphomes SR par rapport au PBS (p<0.01) et au « scrambled peptide » (p<0.001). Ces résultats indiquent que le PCK3145 possède une activité anti-tumorale et pourrait représenter un agent intéressant pour le traitement de plusieurs cancers hématologiques.

Caractérisation fonctionnelle de la GTPase Ran dans le cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le plus létal des cancers gynécologiques. Les tumeurs de l’ovaire se divisent en différentes classes reflétant l’étendue de la maladie. Les tumeurs à faible potentiel de malignité présentent une survie relative à 5 ans de 90%, alors que pour les tumeurs invasives, la survie à 5 ans chute drastiquement à 35-40%. Au laboratoire, nous avons précédemment identifié la protéine Ran, un membre de la superfamille des GTPases Ras, comme marqueur fortement exprimé dans les cancers épithéliaux de l’ovaire de haut grade et de haut stade dont la surexpression est associée à un mauvais pronostic. Ran est déjà connue pour contribuer au transport nucléocytoplasmique et à la progression du cycle cellulaire, mais son rôle dans le cancer ovarien n’est pas bien défini. En utilisant une approche de shRNA inductibles à la tétracycline basée sur les lentivirus, nous avons montré que la diminution de l’expression de Ran dans des lignées cellulaires agressives du cancer de l’ovaire affecte drastiquement la prolifération cellulaire par l’induction d’une apoptose caspase-3 dépendante. Par un essai de tumeurs en xénogreffes, nous avons démontré que la déplétion de Ran résulte en une diminution de la tumorigenèse et que la formation éventuelle de tumeurs est associée à une sélection des cellules tumorales ayant la capacité de ré-exprimer la protéine Ran. Ces résultats suggèrent un rôle critique pour Ran dans la survie et la tumorigénicité des cellules du cancer ovarien, indiquant que Ran pourrait être une cible thérapeutique intéressante.

Rôle du gène Polycomb BMI1 dans le maintien et la radiorésistance des cellules souches cancéreuses

Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale la plus commune et létale chez l’adulte. Malgré les avancés fulgurantes dans la dernière décennie au niveau des thérapies contre le cancer, le pronostique reste inchangé. Le manque de spécificité des traitements est la cause première de la récurrence de cette tumeur. Une meilleure compréhension au niveau des mécanismes moléculaires et biologiques de cette tumeur est impérative. La découverte des cellules souches cancéreuses (CD133+) au niveau du GBM offre une nouvelle opportunité thérapeutique contre cette tumeur. Effectivement, les cellules CD133+ seraient responsables de l’établissement, le maintien et la progression du GBM. De plus, elles sont également la cause de la résistance du GBM faces aux traitements de radiothérapies. Ces cellules représentent une cible de choix dans le but d’éradiquer le GBM. L’oncogène BMI1 a été associé à plusieurs types de tumeurs et est également essentielle au maintien de différentes populations de cellules souches normales et cancéreuses. Une forte expression de BMI1 est observée au niveau du GBM et plus précisément, un enrichissement préférentiel de cette protéine est noté au niveau des cellules CD133+. L’objectif principal de cette thèse est d’évaluer le rôle potentiel de BMI1 dans le maintien et la radiorésistance des cellules souches cancéreuses (CSC), CD133+ du GBM. La fonction principale de BMI1 est la régulation négative du locus INK4A/ARF. Ce locus est impliqué dans l’activation de deux voies majeurs anti-tumorales : P53 et RB. Or, la perte de BMI1 induit in vitro une diminution des capacités prolifératives, une augmentation de la différentiation et de l’apoptose, ainsi qu’une augmentation de la radiosensibilité des CSC du GBM indépendamment de la présence du locus INK4A/ARF. Effectivement, deux tumeurs sur trois possèdent une délétion de ce locus, ce qui suggère que BMI1 possède d’autre(s) cible(s) transcriptionnelle(s). Parmi ces nouvelles cibles ont retrouve la protéine P21, un régulateur négatif du cycle cellulaire. De plus, la perte de BMI1 inhibe l’établissement d’une tumeur cérébrale lors d’études de xénogreffe chez la souris NOD/SCID. Également, une nouvelle fonction de BMI1 indépendante de son activité transcriptionnel a été démontrée. Effectivement, suite à l’induction d’un bris double brin (BDB) de l’ADN, BMI1 est rapidement recruté au niveau de la lésion et influence le recrutement des protéines de reconnaissance du dommage à l’ADN. La perte de BMI1 mène à un défaut au niveau de la reconnaissance et la réparation de l’ADN, alors que sa surexpression induit plutôt une augmentation de ces mécanismes et procure une radiorésistance. Ces résultats décrivent pour la première fois l’importance de BMI1 au niveau du maintien, de l’auto-renouvellement et la radiorésistance des CSC du GBM. Ainsi, ces travaux démontrent que la protéine BMI1 représente une cible thérapeutique de choix dans le but d’éradiquer le GBM, une tumeur cérébrale létale.

Étude de Necdin par un modèle de carcinogénèse lié à l’antigène grand T du Virus du polyome

Les virus sont utilisés depuis longtemps dans la recherche sur le cancer et ont grandement contribué à l’avancement des connaissances de même qu’à l’établissement de préceptes importants encore valables aujourd’hui dans le domaine. L’un des défis actuels est de mieux définir les étapes menant à la transition d’une cellule normale à une cellule transformée et c’est sur cette problématique que nous nous sommes penchés. Pour ce faire, nous avons tiré profit de l’utilisation de l’antigène grand-T du virus de polyome (PyLT), un virus capable d’induire des tumeurs chez les rongeurs. Cet oncogène viral à lui seul possède des propriétés intéressantes qui suggèrent que, en plus de l’immortalisation, il peut également contribuer aux événements précoces de la carcinogénèse. Ceci repose principalement sur la capacité de PyLT à induire des tumeurs en souris transgéniques et ce, avec une certaine latence ce qui suggère que des événements supplémentaires sont nécessaires. Ainsi, l’utilisation de PyLT dans un modèle de culture cellulaire permet de disséquer les changements qui lui sont attribuables. Dans un premier temps, l’établissement du profil d'expression génique associé à l'expression de PyLT dans un modèle murin nous a permis de sélectionner un bon nombre de gènes, parmi lesquels figurait Necdin. Nous avons choisi d’étudier Necdin plus en détail puisque peu d’attention était accordée à cette protéine dans le domaine du cancer, malgré que différentes données de la littérature lui suggèrent à la fois des fonctions suppresseurs de tumeur et oncogéniques. Nous avons démontré que, malgré sa fonction proposée de suppresseur de croissance, l’expression de Necdin n’est pas incompatible avec la prolifération dans la lignée cellulaire de souris NIH 3T3 et les cellules primaires humaines (IMR90), bien que l’inhibition de son expression par shARN confère un avantage prolifératif. Nous avons confirmé que Necdin est un gène cible de p53 induit par différents agents génotoxiques, toutefois son expression peut également être régulée de façon p53-indépendante. De plus, Necdin agit négativement sur l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à l’activation de p53. Ceci suggère que Necdin est impliqué dans une boucle de régulation négative de la voie de p53 et que l’augmentation anormale de l’expression de Necdin pourrait contribuer à la perturbation la voie du suppresseur de tumeur p53. L’activation de p53 permet l’arrêt transitoire du cycle cellulaire en condition de stress, mais est aussi impliquée dans l’établissement d’un arrêt permanent nommé sénescence. La sénescence est un mécanisme de protection contre l’accumulation de mutations qui peut contribuer à l’initiation du cancer. Vu l’intéressante implication de Necdin dans la régulation de l’activité de p53, nous avons transposé les connaissances acquises du modèle murin à un modèle humain, plus adapté pour l’étude de la sénescence. La caractérisation de l’expression de Necdin dans des fibroblastes primaires humains à différents passages montre que les jeunes cellules en prolifération active expriment Necdin et que son niveau diminue avec l’établissement de la sénescence réplicative. Le même phénomène est observé lors de la sénescence prématurée provoquée par l’expression d’un oncogène et par l’exposition aux radiations ionisantes. De plus, dans des conditions normales de prolifération, la modulation de Necdin par des essais de gain et de perte de fonction n’affecte pas la durée de vie des cellules primaires. Toutefois, en condition de stress génotoxique dû à l’exposition aux irradiations, les cellules surexprimant Necdin présentent une radiorésistance accrue de la même façon que lorsque p53 est inactivé directement. Ce résultat en cellules humaines vient appuyer l’effet observé dans les cellules de souris sur l’impact qu’aura le niveau de Necdin sur la réponse de p53 en condition de stress. Un bref survol a été fait pour aborder de quelle façon nos résultats en culture cellulaire pouvaient se traduire dans des modèles de cancer chez l’humain. Nous avons caractérisé l’expression de Necdin dans deux types différents de cancer. D’abord, dans le cancer de l’ovaire, le niveau élevé de Necdin dans les tumeurs à faible potentiel de malignité (LMP) en comparaison aux cancers agressifs de l’ovaire de type séreux suggère que l’expression de Necdin se limite aux cellules de cancer LMP, qui présente généralement un p53 de type sauvage. Son expression est aussi retrouvée dans deux lignées cellulaires du cancer de l’ovaire non-tumorigéniques en xénogreffe de souris, dont l’une possède un p53 fonctionnel. De plus, la caractérisation de Necdin dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate suggère une relation entre son expression et la présence de p53 fonctionnel. Dans le cancer de la prostate, tout comme pour le cancer de l’ovaire, Necdin semble être présent dans les lignées représentant un stade moins avancé de la maladie. L’utilisation de l’oncoprotéine virale PyLT nous a permis de révéler des propriétés intéressantes de Necdin. Nous proposons que dans certains contextes, l’expression constitutive de Necdin pourrait contribuer au cancer en retardant une réponse par p53 appropriée et possiblement en participant à l’augmentation de l’instabilité génomique. La fonction potentiellement oncogénique de Necdin quant à sa relation avec p53 que nous avons révélée requiert davantage d’investigation et les cancers caractérisés ici pourraient constituer de bons modèles à cette fin.

L'implication de l'autophagie dans la chimiorésistance du neuroblastome et l'intérêt de son inhibition

Le neuroblastome (NB) est une tumeur fréquente et agressive du jeune enfant. Les tumeurs de haut grade de forme métastatique, généralement développées chez l'enfant de plus de 1 an, sont associées à une importante mortalité malgré un traitement lourd incluant une chimiothérapie à haute dose. La chimiorésistance est donc un problème majeur qui caractérise ces NB de haut grade. Une des hypothèses pour expliquer cette chimiorésistance est celle de l’activation de l’autophagie, un mécanisme auquel recourent les cellules afin de faire face aux situations de stress. D’ailleurs, plusieurs études ont démontré que l'autophagie était activée à la suite des thérapies anticancéreuses. Son inhibition pourrait donc représenter une stratégie thérapeutique très intéressante pour le traitement de cancers. Le but de ce projet de recherche a été de mettre en évidence l'importance de l'autophagie dans les cellules du NB ainsi que l'effet de son inhibition sur la sensibilité des cellules du NB à la chimiothérapie conventionnelle. La présence d'autophagie dans les cellules de NB et sa valeur pronostic ont été évaluées par une étude immunohistochimique et par western blot sur 184 tumeurs patient. Ensuite, dans le but de déterminer l'effet de la chimiothérapie conventionnelle sur le niveau d'autophagie, des études in vitro sur 6 lignées cellulaires ont été effectuées utilisant des tests de mesure d'autophagie (MDC, monodanylcadaverine), de viabilité cellulaire (MTT) et de western blot. Celles ci ont été suivies par des tests d'inhibition de l'autophagie par deux méthodes: l’inactivation du gène ATG5 par un lentivirus contenant un shRNA ciblant ATG5 ou de l'hydroxychloroquine (HCQ), un inhibiteur pharmacologique de l’autophagie. Cette inhibition a été testée seule ou en combinaison avec une chimiothérapie conventionnelle dans le but de déterminer le rôle de l'autophagie dans la sensibilisation des cellules de NB à la chimiothérapie. Ensuite, l’intérêt de l’inhibition de l’autophagie a été évalué sur des modèles murins. Enfin, le niveau d'autophagie a été testé dans des cellules souches de NB. Notre étude a démonté que l'autophagie est présente à un niveau basal dans une majorité des NB mais qu'elle ne représentait pas un facteur pronostic dans ce type de tumeur. Les différentes chimiothérapies testées induisent une augmentation de l'autophagie dans les cellules du NB. Les deux tests d'inhibition ont démontré in vitro que l'autophagie participe à la résistance des cellules aux traitements chimiothérapeutiques classiques du NB. Le blocage de l’autophagie in vivo augmente l’efficacité de la chimiothérapie, cependant certaines données associées au traitement par HCQ devront être complétées. Cette étude démontre que l'inhibition de l'autophagie en combinaison avec la chimiothérapie classique représente une approche thérapeutique prometteuse dans le traitement du NB.

Cell lines and animal model in the analysis of pharmacogenomics markers in childhood acute lymphoblastic leukemia

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Elle est la cause principale de mortalité liée au cancer chez les enfants due à un groupe de patient ne répondant pas au traitement. Les patients peuvent aussi souffrir de plusieurs toxicités associées à un traitement intensif de chimiothérapie. Les études en pharmacogénétique de notre groupe ont montré une corrélation tant individuelle que combinée entre les variants génétiques particuliers d’enzymes dépendantes du folate, particulièrement la dihydrofolate réductase (DHFR) ainsi que la thymidylate synthase (TS), principales cibles du méthotrexate (MTX) et le risque élevé de rechute chez les patients atteints de la LAL. En outre, des variations dans le gène ATF5 impliqué dans la régulation de l’asparagine synthetase (ASNS) sont associées à un risque plus élevé de rechute ou à une toxicité ASNase dépendante chez les patients ayant reçu de l’asparaginase d’E.coli (ASNase). Le but principal de mon projet de thèse est de comprendre davantage d’un point de vue fonctionnel, le rôle de variations génétiques dans la réponse thérapeutique chez les patients atteints de la LAL, en se concentrant sur deux composants majeurs du traitement de la LAL soit le MTX ainsi que l’ASNase. Mon objectif spécifique était d’analyser une association trouvée dans des paramètres cliniques par le biais d’essais de prolifération cellulaire de lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCLs, n=93) et d’un modèle murin de xénogreffe de la LAL. Une variation génétique dans le polymorphisme TS (homozygosité de l’allèle de la répétition triple 3R) ainsi que l’haplotype *1b de DHFR (défini par une combinaison particulière d’allèle dérivé de six sites polymorphiques dans le promoteur majeur et mineur de DHFR) et de leurs effets sur la sensibilité au MTX ont été évalués par le biais d’essais de prolifération cellulaire. Des essais in vitro similaires sur la réponse à l’ASNase de E. Coli ont permis d’évaluer l’effet de la variation T1562C de la région 5’UTR de ATF5 ainsi que des haplotypes particuliers du gène ASNS (définis par deux variations génétiques et arbitrairement appelés haplotype *1). Le modèle murin de xénogreffe ont été utilisé pour évaluer l’effet du génotype 3R3R du gène TS. L’analyse de polymorphismes additionnels dans le gène ASNS a révélé une diversification de l’haplotype *1 en 5 sous-types définis par deux polymorphismes (rs10486009 et rs6971012,) et corrélé avec la sensibilité in vitro à l’ASNase et l’un d’eux (rs10486009) semble particulièrement important dans la réduction de la sensibilité in vitro à l’ASNase, pouvant expliquer une sensibilité réduite de l’haplotype *1 dans des paramètres cliniques. Aucune association entre ATF5 T1562C et des essais de prolifération cellulaire en réponse à ASNase de E.Coli n’a été détectée. Nous n’avons pas détecté une association liée au génotype lors d’analyse in vitro de sensibilité au MTX. Par contre, des résultats in vivo issus de modèle murin de xénogreffe ont montré une relation entre le génotype TS 3R/3R et la résistance de manière dose-dépendante au traitement par MTX. Les résultats obtenus ont permis de fournir une explication concernant un haut risque significatif de rechute rencontré chez les patients au génotype TS 3R/3R et suggèrent que ces patients pourraient recevoir une augmentation de leur dose de MTX. À travers ces expériences, nous avons aussi démontré que les modèles murins de xénogreffe peuvent servir comme outil préclinique afin d’explorer l’option d’un traitement individualisé. En conclusion, la connaissance acquise à travers mon projet de thèse a permis de confirmer et/ou d’identifier quelques variants dans la voix d’action du MTX et de l’ASNase qui pourraient faciliter la mise en place de stratégies d’individualisation de la dose, permettant la sélection d’un traitement optimum ou moduler la thérapie basé sur la génétique individuelle.

Caractérisation fonctionnelle du suppresseur de tumeurs BAP1

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie.

Anatomic and molecular characterization of the 1 endocrine pancreas of a teleostean fish: Atlantic wolffish (Anarhichas lupus)

Background: The biologic attributes of the endocrine pancreas and the comparative endocrinology of islet amyloid polypeptide (IAPP) of fish are not well described in the literature. This study describes the endocrine pancreas of one teleostean fish. Ten captive Atlantic wolffish (Anarhichas lupus) from the Montreal Biodome were submitted for necropsy and their pancreata were collected. Results: Grossly, all the fish pancreata examined contained 1-3 nodules of variable diameter (1-8 mm). Microscopically, the nodules were uniform, highly cellular, and composed of polygonal to elongated cells. Immunofluorescence for pancreatic hormones was performed. The nodules were immunoreactive for insulin most prominent centrally, but with IAPP and glucagon only in the periphery of the nodules. Exocrine pancreas was positive for chromogranin A. Not previously recognized in fish, IAPP immunoreactivity occurred in α, glucagon-containing, cells and did not co-localize with insulin in β cells. The islet tissues were devoid of amyloid deposits. IAPP DNA sequencing was performed to compare the sequence among teleost fish and the potency to form amyloid fibrils. In silico analysis of the amino acid sequences 19-34 revealed that it was not amyloidogenic. Conclusions: Amyloidosis of pancreatic islets would not be expected as a spontaneous disease in the Atlantic wolffish. Our study underlines that this teleost fish is a potential candidate for pancreatic xenograft research.

Modèle cellulaire de carcinogenèse pour les cancers de l’oropharynx induits par le VPH

Problématique: Le virus du papillome humain (VPH) est présent dans près de 50% des cancers de l’oropharynx. Le potentiel oncogénique du VPH est encodé dans les oncoprotéines E6 et E7, qui agissent en modulant différents gènes, dont les gènes suppresseurs de tumeur p53 et pRb. Les cellules VPH positives démontrent une altération au niveau de la signalisation de la réponse aux dommages à l’ADN (RDA), un mécanisme de contrôle dans l’arrêt de la croissance des cellules ayant subit des dommages au niveau de leur ADN. Hypothèse et objectifs : Nous croyons que les défauts au niveau de la RDA des cancers VPH positifs peuvent être exploités afin de sensibiliser préférentiellement les cellules cancéreuses aux traitements de radiothérapie. Cette stratégie de recherche nécessite l’élaboration d’un modèle cellulaire de carcinogenèse isogénique pour le cancer de l’oropharynx que nous proposons de développer et de caractériser. L’étude vise à dériver des lignées isogéniques à partir de kératinocytes primaires et cellules épithéliales de l’oropharynx pour ensuite valider la carcinogenèse de notre modèle in vitro & in vivo Méthodologie : Des lignées cellulaires de kératinocytes primaires et de cellules épithéliales de l’oropharynx ont été successivement modifiées par transduction afin de présenter les mutations associées aux cancers de l’oropharynx induits par le VPH. Les cellules ont été modifiées avec des lentivirus codants pour la télomérase (hTERT), les oncogènes E6, E7 et RasV12. Afin de valider la cancérogenèse in vitro de notre modèle, des études d’invasion en matrigel et de croissance sans ancrage en agar mou ont été réalisées. Les populations cellulaires transformées ont été ensuite introduites dans des souris immunodéficientes afin d’évaluer leur tumorogénicité in vivo. Résultats : À partir des plasmides recombinés construits par méthodes de clonage traditionnelle et de recombinaison « Gateway », nous avons produit des lentivirus codants pour la télomérase humaine (hTERT), les oncogènes viraux E6 et E7 et l’oncogène Ras. Les kératinocytes primaires et cellules épithéliales de l’oropharynx ont été infectés successivement par transduction et sélectionnés. Nous avons validé l’expression de nos transgènes par méthode d’immunofluorescence, de Western Blot et de réaction de polymérisation en chaîne quantitative en temps réel (qRT-PCR). Nous avons établi trois lignées des cellules épithéliales de l’oropharynx (HNOE) à partir d’échantillons tissulaires prélevés lors d’amygdalectomie (HNOE42, HNO45, HNOE46). Les cellules transduites avec le lentivirus exprimant le promoteur fort CMV/TO de l’oncogène RasV12 ont présenté un changement morphologique compatible avec une sénescence prématurée induite par l’oncogène Ras. En exprimant des quantités plus faibles du RasV12 mutant, la lignée cellulaire HEKn hTERT-E6-E7 PGK RasV12 a réussi à échapper à la sénescence induite par l’oncogène Ras. La population cellulaire exprimant HEKn hTERT-E6-E7-PGK RasV12 a présenté un phénotype malin en culture et à l’étude d'invasion, mais n’a pas démontré de résultats positifs à l’étude de croissance sans ancrage en agar mou ni en xénogreffe en souris immunodéficientes. Conclusion : Nos résultats démontrent qu’en présence des oncogènes viraux E6 et E7, il y a un troisième mécanisme suppresseur de tumeur qui médie la sénescence induite par l’oncogène Ras. Nous avons identifié que la présence de E6 seule ne suffit pas à immortaliser les kératinocytes primaires humains (HEKn). Nous n’avons pas réussi à créer un modèle in vitro de carcinogenèse pour les cancers de l’oropharynx induits par le VPH.