Dissecting cell cycle protein complexes using the pptimized yeast cytosine deaminase protein-fragment complementation assay “You too can play with an edge”

Les protéines sont les produits finaux de la machinerie génétique. Elles jouent des rôles essentiels dans la définition de la structure, de l'intégrité et de la dynamique de la cellule afin de promouvoir les diverses transformations chimiques requises dans le métabolisme et dans la transmission des signaux biochimique. Nous savons que la doctrine centrale de la biologie moléculaire: un gène = un ARN messager = une protéine, est une simplification grossière du système biologique. En effet, plusieurs ARN messagers peuvent provenir d’un seul gène grâce à l’épissage alternatif. De plus, une protéine peut adopter plusieurs fonctions au courant de sa vie selon son état de modification post-traductionelle, sa conformation et son interaction avec d’autres protéines. La formation de complexes protéiques peut, en elle-même, être déterminée par l’état de modifications des protéines influencées par le contexte génétique, les compartiments subcellulaires, les conditions environmentales ou être intrinsèque à la croissance et la division cellulaire. Les complexes protéiques impliqués dans la régulation du cycle cellulaire sont particulièrement difficiles à disséquer car ils ne se forment qu’au cours de phases spécifiques du cycle cellulaire, ils sont fortement régulés par les modifications post-traductionnelles et peuvent se produire dans tous les compartiments subcellulaires. À ce jour, aucune méthode générale n’a été développée pour permettre une dissection fine de ces complexes macromoléculaires. L'objectif de cette thèse est d'établir et de démontrer une nouvelle stratégie pour disséquer les complexes protéines formés lors du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Dans cette thèse, je décris le développement et l'optimisation d'une stratégie simple de sélection basée sur un essai de complémentation de fragments protéiques en utilisant la cytosine déaminase de la levure comme sonde (PCA OyCD). En outre, je décris une série d'études de validation du PCA OyCD afin de l’utiliser pour disséquer les mécanismes d'activation des facteurs de transcription et des interactions protéine-protéines (IPPs) entre les régulateurs du cycle cellulaire. Une caractéristique clé du PCA OyCD est qu'il peut être utilisé pour détecter à la fois la formation et la dissociation des IPPs et émettre un signal détectable (la croissance des cellules) pour les deux types de sélections. J'ai appliqué le PCA OyCD pour disséquer les interactions entre SBF et MBF, deux facteurs de transcription clés régulant la transition de la phase G1 à la phase S. SBF et MBF sont deux facteurs de transcription hétérodimériques composés de deux sous-unités : une protéine qui peut lier directement l’ADN (Swi4 ou Mbp1, respectivement) et une protéine commune contenant un domain d’activation de la transcription appelée Swi6. J'ai appliqué le PCA OyCD afin de générer un mutant de Swi6 qui restreint ses activités transcriptionnelles à SBF, abolissant l’activité MBF. Nous avons isolé des souches portant des mutations dans le domaine C-terminal de Swi6, préalablement identifié comme responsable dans la formation de l’interaction avec Swi4 et Mbp1, et également important pour les activités de SBF et MBF. Nos résultats appuient un modèle où Swi6 subit un changement conformationnel lors de la liaison à Swi4 ou Mbp1. De plus, ce mutant de Swi6 a été utilisé pour disséquer le mécanisme de régulation de l’entrée de la cellule dans un nouveau cycle de division cellulaire appelé « START ». Nous avons constaté que le répresseur de SBF et MBF nommé Whi5 se lie directement au domaine C-terminal de Swi6. Finalement, j'ai appliqué le PCA OyCD afin de disséquer les complexes protéiques de la kinase cycline-dépendante de la levure nommé Cdk1. Cdk1 est la kinase essentielle qui régule la progression du cycle cellulaire et peut phosphoryler un grand nombre de substrats différents en s'associant à l'une des neuf protéines cycline régulatrice (Cln1-3, Clb1-6). Je décris une stratégie à haut débit, voir à une échelle génomique, visant à identifier les partenaires d'interaction de Cdk1 et d’y associer la cycline appropriée(s) requise(s) à l’observation d’une interaction en utilisant le PCA OyCD et des souches délétées pour chacune des cyclines. Mes résultats nous permettent d’identifier la phase(s) du cycle cellulaire où Cdk1 peut phosphoryler un substrat particulier et la fonction potentielle ou connue de Cdk1 pendant cette phase. Par exemple, nous avons identifié que l’interaction entre Cdk1 et la γ-tubuline (Tub4) est dépendante de Clb3. Ce résultat est conforme au rôle de Tub4 dans la nucléation et la croissance des faisceaux mitotiques émanant des centromères. Cette stratégie peut également être appliquée à l’étude d'autres IPPs qui sont contrôlées par des sous-unités régulatrices.

Vers une grammaire d'unification Sens-Texte du français : le temps verbal dans l'interface sémantique-syntaxe

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Défi verbal et auto-analgésie : une étude psychophysiologique chez les Quichuas

La douleur est une expérience humaine des plus universelles et d’une riche variabilité culturelle. Néanmoins, il y a peu d’études sur ce sujet en général et qui plus est, la recherche sur la douleur chez les Amérindiens est presque inexistante. L’expérience de douleur de quelques 28 millions d’Amérindiens en Amérique du Sud, dont les Quichuas (Inca), est encore méconnue. Cette recherche interdisciplinaire, psychophysiologique et anthropologique, vise deux buts : (1) Étudier les effets de type analgésique du défi verbal culturellement significatif chez les Quichuas ; et (2) Faire un survol de leur système de croyances concernant la douleur, leur façon de la percevoir, de la décrire, et de la contrôler. Pour le volet expérimental, on a recruté 40 hommes en bonne santé. Les volontaires étaient assignés de façon alternée soit au groupe expérimental (20) soit au groupe contrôle (20). On a enregistré chez eux les seuils de la douleur, et celui de la tolérance à la douleur. Chez le groupe expérimental, on a, de plus, mesuré le seuil de la tolérance à la douleur avec défi verbal. La douleur était provoquée par pression au temporal, et mesurée à l’aide d’un algésimètre. Après chaque seuil, on a administré une échelle visuelle analogique. Pour le deuxième volet de l’étude, un groupe de 40 participants (15 femmes et 25 hommes) a répondu verbalement à un questionnaire en quichua sur la nature de la douleur. Celui-ci touchait les notions de cause, de susceptibilité, les caractéristiques de la douleur, les syndromes douloureux, les méthodes de diagnostic et de traitement, ainsi que la prévention. Notre étude a révélé que les participants ayant reçu le défi verbal ont présenté une tolérance accrue à la douleur statistiquement significative. Les valeurs de l’échelle visuelle analogique ont aussi augmenté chez ce groupe, ce qui indique un état accru de conscience de la douleur. L’expérience de la douleur chez les Quichuas est complexe et les stratégies pour la combattre sont sophistiquées. Selon leur théorie, le vécu d’émotions intenses, dues à des évènements de la vie, à l’existence d’autres maladies qui affectent la personne de façon concomitante, et aux esprits présents dans la nature ou chez d’autres personnes joue un rôle dans l’origine, le diagnostic et le traitement de la douleur. Les Quichuas accordent une grande crédibilité à la biomédecine ainsi qu’à la médecine traditionnelle quichua. Ils perçoivent la famille et le voisinage comme étant des sources supplémentaires de soutien. Il ressort également que les Quichuas préfèrent un service de santé de type inclusif et pluraliste. En conclusion, cette étude a révélé que des mots culturellement significatifs ayant une connotation de défi semblent augmenter la tolérance à la douleur chez les Quichuas. Il s’agit de la première étude à documenter les effets analgésiques de la parole. D’autre part, cette étude souligne également la potentielle utilité clinique de connaître le système quichua de croyances entourant la douleur et le contrôle de cette dernière. Ceci s’avère particulièrement utile pour les cliniciens soucieux d’offrir des soins de santé de meilleure qualité, culturellement adaptés, dans les Andes.

Procès-verbal ; suivi de Filiation(s) rompue(s) : mémoire en pièces et tissus de parole dans Parents et amis sont invités à y assister d’Hervé Bouchard

La première partie du mémoire consiste en un court texte théâtral intitulé Procès-Verbal. Il met en scène un récit fragmentaire et explore les idées d’éclatement identitaire, de rupture de la mémoire et de mimétisme. Ces thèmes sont mis en relation avec des mécanismes de répétition, un traitement formel minimaliste et d’abondants silences, représentatifs de l’effacement identitaire des personnages. La seconde partie du mémoire, intitulée Filiation(s) rompue(s) : mémoire en pièces et tissus de parole, porte sur le traitement des thèmes de la mémoire et de l’héritage dans le roman Parents et amis sont invités à y assister d’Hervé Bouchard. L’analyse vise à mettre en lumière le lien entre la fragmentation textuelle et la rupture filiale, et s’attarde spécifiquement à la dislocation de la parole, qui témoigne d’une construction identitaire problématique.

Searching for novel gene functions in yeast : identification of thousands of novel molecular interactions by protein-fragment complementation assay followed by automated gene function prediction and high-throughput lipidomics

La compréhension de processus biologiques complexes requiert des approches expérimentales et informatiques sophistiquées. Les récents progrès dans le domaine des stratégies génomiques fonctionnelles mettent dorénavant à notre disposition de puissants outils de collecte de données sur l’interconnectivité des gènes, des protéines et des petites molécules, dans le but d’étudier les principes organisationnels de leurs réseaux cellulaires. L’intégration de ces connaissances au sein d’un cadre de référence en biologie systémique permettrait la prédiction de nouvelles fonctions de gènes qui demeurent non caractérisées à ce jour. Afin de réaliser de telles prédictions à l’échelle génomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons développé une stratégie innovatrice qui combine le criblage interactomique à haut débit des interactions protéines-protéines, la prédiction de la fonction des gènes in silico ainsi que la validation de ces prédictions avec la lipidomique à haut débit. D’abord, nous avons exécuté un dépistage à grande échelle des interactions protéines-protéines à l’aide de la complémentation de fragments protéiques. Cette méthode a permis de déceler des interactions in vivo entre les protéines exprimées par leurs promoteurs naturels. De plus, aucun biais lié aux interactions des membranes n’a pu être mis en évidence avec cette méthode, comparativement aux autres techniques existantes qui décèlent les interactions protéines-protéines. Conséquemment, nous avons découvert plusieurs nouvelles interactions et nous avons augmenté la couverture d’un interactome d’homéostasie lipidique dont la compréhension demeure encore incomplète à ce jour. Par la suite, nous avons appliqué un algorithme d’apprentissage afin d’identifier huit gènes non caractérisés ayant un rôle potentiel dans le métabolisme des lipides. Finalement, nous avons étudié si ces gènes et un groupe de régulateurs transcriptionnels distincts, non préalablement impliqués avec les lipides, avaient un rôle dans l’homéostasie des lipides. Dans ce but, nous avons analysé les lipidomes des délétions mutantes de gènes sélectionnés. Afin d’examiner une grande quantité de souches, nous avons développé une plateforme à haut débit pour le criblage lipidomique à contenu élevé des bibliothèques de levures mutantes. Cette plateforme consiste en la spectrométrie de masse à haute resolution Orbitrap et en un cadre de traitement des données dédié et supportant le phénotypage des lipides de centaines de mutations de Saccharomyces cerevisiae. Les méthodes expérimentales en lipidomiques ont confirmé les prédictions fonctionnelles en démontrant certaines différences au sein des phénotypes métaboliques lipidiques des délétions mutantes ayant une absence des gènes YBR141C et YJR015W, connus pour leur implication dans le métabolisme des lipides. Une altération du phénotype lipidique a également été observé pour une délétion mutante du facteur de transcription KAR4 qui n’avait pas été auparavant lié au métabolisme lipidique. Tous ces résultats démontrent qu’un processus qui intègre l’acquisition de nouvelles interactions moléculaires, la prédiction informatique des fonctions des gènes et une plateforme lipidomique innovatrice à haut débit , constitue un ajout important aux méthodologies existantes en biologie systémique. Les développements en méthodologies génomiques fonctionnelles et en technologies lipidomiques fournissent donc de nouveaux moyens pour étudier les réseaux biologiques des eucaryotes supérieurs, incluant les mammifères. Par conséquent, le stratégie présenté ici détient un potentiel d’application au sein d’organismes plus complexes.

Development of a binary positive and negative protein fragment complementation assay using yeast cytosine deaminase

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.