Longitudinal changes in HIV-specific IFN-? secretion in subjects who received Remune™ vaccination prior to treatment interruption

Affiliation: Maude Loignon, Lise Cyr & Emil Toma : Département de microbiologie et immunologie, Faculté de médecine, Université de Montréal

Rôle des GTPases ARF dans la migration des cellules endothéliales et la sécrétion du NO

ARF6 et ARF1 sont des petites GTPases de la famille des ARF(s) qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant, la formation et le mouvement des vésicules, la transformation des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. À ce jour, le rôle de la protéine ARF6 et de la protéine ARF1 dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) dans les cellules endothéliales est encore très peu étudié. Le but de cette étude a été de caractériser le rôle de la protéine ARF6 dans la migration des cellules endothéliales induite par l’endothéline-1, ainsi que le rôle de la protéine ARF1 dans la sécrétion du monoxyde d’azote (NO) stimulées par le VEGF. Dans cette étude, nous montrons qu’ARF6 est essentielle à la migration des cellules endothéliales induite par l’endotheline-1. L’inhibition de l’expression d’ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée de la kinase FAK et son association constitutive avec Src. Par ailleurs, cette inhibition affecte l’association entre GIT1 et la kinase FAK. Ceci se traduit par une inhibition du désassemblage des contacts focaux et une augmentation de l’adhésion cellulaire menant à une diminution de la motilité. De plus, nos résultats montrent que la protéine ARF1 est essentielle à l’activation d’eNOS et à la sécrétion du NO suite à l’activation du VEGFR2 dans les cellules endothéliales BAEC. En effet, l’inhibition de l’expression d’ARF1 par interférence à l’ARN entraîne une inhibition du recrutement de la kinase Akt à la membrane plasmique et une inhibition de son activation induite par le VEGF. L’inhibition de l’activation de la kinase Akt par le VEGF conduit à une inhibition de l’activation de eNOS et de la sécrétion du NO. Dans l’ensemble, nos résultats montrent que les protéines ARF6 et ARF1 sont essentielles à la signalisation de l’ETB et du VEGFR2 pour les processus menant à la migration cellulaire et à la sécrétion du NO respectivement, deux évènements essentiels à l’angiogenèse.

Rôle de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans la régulation du programme angiogénique induit par le VEGF

Depuis la découverte de la première protéine possédant une activité tyrosine kinase (protein tyrosine kinase [PTK]) dans les années 1980, l’importance des PTKs et de la phosphorylation sur résidu tyrosine dans la régulation des événements de signalisation intracellulaire est bien établie. Quant aux protéines qui possèdent une activité tyrosine phosphatase (protein tyrosine phosphatase [PTP]), dont l’existence n’a été dévoilée qu’une dixaine d’années plus tard, elles ont longtemps été perçues comme des enzymes dont le rôle ne se résumait qu'à contrecarrer passivement les activités des PTKs. Il est maintenant clair que les activités des PTPs sont spécifiques, hautement régulées, et qu’elles doivent être coordonnées avec celles des PTKs pour une régulation adéquate des événements de signalisation intracellulaire. En dépit de cette évidence, la contribution des PTPs à la régulation des différents processus physiologiques fondamentaux demeure encore peu caractérisée. C’est le cas, notamment, de l’angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir de ceux préexistants. Le VEGF (Vascular endothelial growth factor), un des facteurs angiogéniques les plus importants, est connu pour induire majoritairement ses effets biologiques via l’activation du récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). Puisque l’angiogenèse est impliquée dans le développement d’une multitude de pathologies, dont la progression tumorale, une meilleure caractérisation des PTPs qui assurent la qualité de la réponse angiogénique en agissant de pair avec le VEGFR2 s’avère cruciale et ce, afin de raffiner les outils thérapeutiques actuels. L’expression de la PTP DEP-1 corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2 localisé au niveau des jonctions cellules-cellules et contribue à l’inhibition de la prolifération des cellules endothéliales en réponse au VEGF lorsque les cellules sont à confluence. Par contre, la contribution spécifique de DEP-1 à la régulation des voies de signalisation et des réponses biologiques induites par le VEGF demeurait toujours inconnue. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent tout d’abord que DEP-1 régule négativement l’activité tyrosine kinase de VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement les résidus tyrosine Y1054/Y1059 de sa boucle d’activation. Cette déphosphorylation mène par conséquent à une diminution générale de la phosphorylation du récepteur et à une atténuation de la plupart des voies de signalisation induites par le VEGF, incluant la voie mitogénique PLCγ-ERK1/2. Par ailleurs, malgré ce rôle négatif global, nos travaux révèlent étonnement, et pour la première fois, que DEP-1 contribue d’une manière positive à la promotion de la survie des cellules endothéliales via l’activation de la voie Src-Gab1-Akt en aval du récepteur VEGFR2. Ce pouvoir pro-survie de DEP-1 dans les cellules endothéliales réside avant tout dans sa capactié à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529). Au cours de notre étude, nous avons pu identifier deux résidus tyrosine au niveau de l’extrémité carboxy-terminale de DEP-1, Y1311 et Y1320, dont la phosphorylation est dépendante de Src. Nos travaux révèlent par ailleurs que ces deux résidus tyrosine phosphorylés lient le domaine SH2 de Src et que la Y1320 est principalement requise pour l’activation de Src et d’Akt en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces résultats constituent donc une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels DEP-1 peut réguler le programme angiogénique dépendant du VEGF. De plus, cette découverte d’un rôle positif pour DEP-1 dans la survie des cellules endothéliales pourrait mener à l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques visant à inhiber cette fonction spécifique de DEP-1 pour bloquer l'angiogenèse pathologique.

Le VEGF induit la synthèse du PAF par l’entremise de l’activation du VEGFR-2 : identification des phosphotyrosines impliquées

Notre laboratoire a démontré que la capacité proinflammatoire du vascular endothelial growth factor (VEGF-A165) implique la synthèse endothéliale du facteur d’activation plaquettaire (PAF) via l’activation du récepteur tyrosine kinase homodimérique VEGFR-2/R-2. La synthèse du PAF requiert l’activation de la p38 MAPK et p42/44 MAPK qui activent la phospholipase A2 secrétée de type V (sPLA2-V). Nous avons découvert que la synthèse aigue de prostacycline (PGI2) induite par le VEGF-A165 requiert l’activation des récepteurs hétérodimériques VEGFR-1/R-2. L’activation sélective des récepteurs du VEGF peut donc agir comme balance dans la synthèse de facteurs pro-(PAF) et anti-(PGI2) inflammatoire. Cependant, les tyrosines impliquées dans la transphosphorylation de VEGFR-2/R-2 menant à la synthèse du PAF sont inconnues. Par mutagenèse dirigée, nous avons effectué des transfections transitoires de cellules endothéliales avec des plasmides codant pour le VEGFR-2 dont les tyrosines ciblées ont été remplacées de façon séquentielle par une phénylalanine. Un vecteur vide pcDNA a été utilisé comme contrôle négatif. La stimulation des cellules endothéliales de l’aorte bovine (BAEC) transfectées avec le VEGF-A165 (1nM) pendant 15 minutes augmente la synthèse du PAF de 300%, laquelle était similaire dans les BAEC non transfectées. Dans les BAEC transfectées avec les vecteurs pcDNA codant pour les mutations Y801F, Y1059F, Y1175F et Y1214F, nous avons observé une réduction de 54, 73, 68, et 57% respectivement de la synthèse du PAF induite par le VEGF par rapport au pcDNA témoin. Nos résultats apportent un nouvel aperçu sur le mécanisme par lequel le VEGF induit la synthèse du PAF qui est connu pour sa contribution dans l’activité pro-inflammatoire du VEGF.

Monoacylglycerol as a metabolic coupling factor in glucose-stimulated insulin secretion

Les cellules beta pancréatiques sécrètent l’insuline lors d’une augmentation post-prandiale du glucose dans le sang. Ce processus essentiel est contrôlé par des facteurs physiologiques, nutritionnels et pathologiques. D’autres sources d’énergie, comme les acides aminés (leucine et glutamine) ou les acides gras potentialisent la sécrétion d’insuline. Une sécrétion d’insuline insuffisante au besoin du corps déclanche le diabète. Le rôle que joue l’augmentation du calcium intracellulaire et les canaux K+/ATP dans la sécrétion d’insuline est bien connu. Bien que le mécanisme exact de la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les lipides est inconnu, le cycle Glycérolipides/Acides gras (GL/FFA) et son segment lipolytique ont été reconnu comme un composant essentiel de la potentialisation lipidique de la sécrétion d’insuline. Le diacylglycérol, provenant de la lipolyse, a été proposé comme un signal lipidique important d’amplification. Cependant, l’hydrolyse des triglycérides et des diacylglycérides a été démontrée essentielle pour la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, en suggérant un rôle du monoacylglycérol (MAG) dans ce processus. Dans cette étude, on démontre que la réduction de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, lors d’une inhibition de la lipolyse, est restaurée par l’addition de MAG. Dans les cellules beta pancréatiques, le niveau de MAG augmente en présence des concentrations élevées du glucose, et également lorsqu’on inhibe l’enzyme MAG hydrolase abhydrolase-6 (ABHD6) avec l’inhibiteur spécifique WWL70. L’analyse lipidomique a démontré qu’après la stimulation des cellules beta pancréatiques avec le glucose et aussi avec le WWL70, l’espèce la plus accumulée de MAG était le 1-stearoylglycérol (1-SG). L’addition de 1-SG, de 1-palmitoylglycérol (1-PG) ou de WWL70 augmente la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, et cette augmentation est indépendante de la génération de acides gras à partir de MAG. Cela suggère que le MAG est un signal lipidique pour la potentialisation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. De plus, la surexpression du gène d’ABHD6 dans les cellules INS832/13 cause une réduction de la sécrétion d’insuline, due probablement à la diminution des niveaux intracellulaire de MAG. Avec le but de comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par le MAG, on a bloqué l’action du récepteur vanilloid-1 (TRPV1) liant le MAG par l’agent pharmacologiste, AMG9810. Le traitement des cellules beta pancréatique par AMG9810 entraîne une diminution de la potentialisation de la sécrétion de l’insuline induite par le MAG. Il est a noter que le MAG pourrait activer TRPV1 par une liaison physique dans la membrane cellulaire interne; ce qui entraînerai l’entrée du calcium dans la cellule, et ensuite la stimulation de l’exocytose des granules à insuline. En soutien de cette hypothèse, on a trouvé une diminution du calcium intracellulaire lorsqu’on traite au AMG9810 des cellules beta pancréatique de rat (provenant des îlots dispersés) stimulées au glucose et au WWL70. L’ensemble des résultats suggère que le MAG est un médiateur de la potentialisation lipidique de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. Vu que l’inhibition pharmacologique d’ABHD6 augmente la sécrétion d’insuline, on pourra conclure que cette enzyme représente une cible thérapeutique potentielle dans le développement des médicaments anti-diabétiques, visant une augmentation de la sécrétion d’insuline.

La protéine adaptatrice Gab1 est requise pour la migration et le réarrangement adéquat du cytosquelette des cellules endothéliales en réponse au VEGF

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Implication de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans la perméabilité vasculaire induite par le VEGF

La perméabilité vasculaire est une caractéristique cruciale de l’angiogenèse. Les acteurs principaux sont les cellules endothéliales qui la régulent en réponse à divers facteurs perméabilisant, tels que le « Vascular Endothelial Growth Factor » (VEGF). Dans le contexte pathologique du cancer, les cellules tumorales produisent de grandes quantités de VEGF qui stimulent la perméabilité, ce qui leur permet d’infiltrer le réseau vasculaire. Il est connu que la tyrosine kinase Src contrôle cette modulation de la perméabilité. Puisque notre laboratoire a préalablement démontré que la phosphatase de type récepteur (PTP) DEP-1 est impliquée dans l’activation de Src en réponse au VEGF, nous avons émis l'hypothèse que DEP-1 pourrait aussi jouer un rôle dans la perméabilité des cellules endothéliales. Grâce à des expériences de transfections d’ARN interférant, nous démontrons que DEP-1 est important pour la régulation de la phosphorylation de la VE-Cadhérine, un médiateur critique de la perméabilité. L’impact de DEP-1 sur la dissociation de jonctions intercellulaires est également démontré par microscopie à immunofluorescence de cellules endothéliales. DEP-1 est également nécessaire à l’augmentation de la perméabilité induite par VEGF in vitro. Deux résidus tyrosine retrouvés dans la queue carboxy-terminale de DEP-1 sont essentiels à l’activation de Src en réponse au VEGF. Suite à la transfection d’un plasmide encodant DEP-1 muté pour ces deux résidus, nous démontrons aussi leur implication dans la régulation de la perméabilité in vitro par DEP-1. Ces travaux permettent ainsi d’approfondir nos connaissances sur un nouveau régulateur potentiel de la perméabilité vasculaire.

Étude des mécanismes cellulaires activés par l'Angiopoïétine-1 et le VEGF régulant la perméabilité et la migration endothéliales

L’angiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d’un réseau vasculaire existant. C’est un phénomène essentiel pour des processus physiologiques et pathologiques. L’activation des cellules endothéliales est contrôlée par plusieurs facteurs de croissance. Le VEGF et son récepteur le VEGFR-2 ont été prouvés comme étant spécifiques et critiques pour la formation des vaisseaux sanguins alors que Tie2, le récepteur auquel se lie l’Ang-1, est requis aussi bien dans le développement vasculaire que dans l’angiogenèse tumorale. Il est connu que l’activation de Tie2 est nécessaire à la stabilisation finale de la vascularisation en inhibant la perméabilité vasculaire induite par le VEGFR-2. Nous avons premièrement découvert que le facteur de croissance pro-angiogénique, l’Ang-1 contrecarre les effets de perméabilité cellulaire induits par le VEGF en inhibant la production de NO dans les cellules endothéliales. Cet effet inhibiteur de Tie2 intervient directement au niveau de l’activité de l’enzyme eNOS. Suite à l’activation de Tie2 par l’Ang-1, eNOS devient fortement phosphorylé sur la Thr497 après la phosphorylation et l’activation de la PKCζ. Nos résultats suggèrent que l’inhibition, par Tie2, de la perméabilité vasculaire durant l’angiogenèse serait due, en partie, à l’inhibition de la production de NO. Deuxièmement nous avons pu distinguer entre deux modes de migration cellulaire endothéliale induits par l’Ang-1 et le VEGF. À l’opposé du VEGF qui promeut une migration individuelle aléatoire, l’Ang-1 induit une migration collective directionnelle. Dans cette étude, nous avons identifié la β-caténine comme un nouveau partenaire moléculaire de la PKCζ. Cette association de la PKCζ à la β-caténine amène le complexe de polarité Par6-aPKC et le complexe des jonctions d’adhérences cellulaires à interagir ensemble à deux localisations différentes au niveau de la cellule endothéliale. Au niveau des contacts intercellulaires, le complexe PKCζ/β-caténine maintien la cohésion et l’adhésion cellulaire nécessaire pour le processus migratoire collectif. Ce complexe se retrouve aussi au niveau du front migratoire des cellules endothéliales afin d’assurer la directionalité et la persistance de la migration endothéliale en réponse à l’Ang-1. D’une manière intéressante, lors de l’inhibition de la PKCζ ou de la β-caténine on assiste à un changement du mode de migration en réponse à l’Ang-1 qui passe d’une migration directionnelle collective à une migration individuelle aléatoire. Ce dernier mode de migration est similaire à celui observé chez des cellules endothéliales exposées au VEGF. Ces résultats ont été corroborés in vivo par une polarité et une adhésion défectueuses au cours de la vasculogenèse chez le poisson zèbre déficient en PKCζ. En résumé, Ang-1/Tie2 module la signalisation et les réponses biologiques endothéliales déclenchées par le VEGF/VEGFR-2. L’identification des mécanismes moléculaires en aval de ces deux récepteurs, Tie2 et VEGFR-2, et la compréhension des différentes voies de signalisation activées par ces complexes moléculaires nous permettra de mettre la lumière sur des nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des maladies angiogéniques.

Pro-inflammatory and angiogenic activities of VEGF and angiopoietins in murine sponge/Matrigel model

La dérégulation de la formation et l'intégrité des vaisseaux sanguins peut conduire à un état pathologique tel qu’observé dans de nombreuses maladies ischémiques telles que: la croissance de tumeur solide, l’arthrite rhumatoïde, le psoriasis, les rétinopathies et l'athérosclérose. Par conséquent, la possibilité de moduler l'angiogenèse régionale chez les patients souffrant d'ischémie est cliniquement pertinente. Un élément clé dans l'induction de l'angiogenèse pathologique est une inflammation qui précède et accompagne la formation des nouveaux vaisseaux. Ce phénomène est démontré par l'augmentation de la perméabilité vasculaire et le recrutement de monocytes/ macrophages et cellules polynucléaires (neutrophiles). En collaboration avec d'autres groupes, nous avons montré que différents facteurs de croissance tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire et les angiopoïétines peuvent non seulement promouvoir l'angiogenèse mais aussi induire diverses étapes connexes au processus de la réaction inflammatoire, y compris la synthèse et la libération des médiateurs inflammatoires et la migration des neutrophiles. Les objectifs de notre étude étaient d'adresser si le vascular endothelial growth factor (VEGF) et les angiopoïétines (Ang1 et Ang2) sont capables de promouvoir la formation des nouveaux vaisseaux sanguins au fil du temps et d'identifier la présence de différentes cellules inflammatoires dans ce processus. Des éponges d'alcool polyvinylique stérilisées et imbibées de Matrigel appauvri en facteur de croissance (contenant PBS, VEGF, Ang1 ou Ang2 (200 ng/200 μl)) ont été insérées sous la peau de souris C57/Bl6 anesthésiées. Les éponges ont ensuite été retirées aux jours 4, 7, 14 ou 21 après la procédure pour des analyses histologiques, immunohistologiques et cytométriques. La formation des nouveaux vaisseaux a été validée par la coloration au Trichrome de Masson et des analyses histologiques et immunohistologiques contre les cellules endothéliales (anti-CD31). De plus, la maturation des vaisseaux a été démontrée par la coloration séquentielle contre les cellules endothéliales (anti-CD31) et musculaires lisses (anti-alpha-actine). Nous avons effectué la même procédure pour caractériser le recrutement de neutrophiles (anti-MPO), et de macrophages (anti-F4/80). Afin de mieux délimiter la présence de différents sous-ensembles de leucocytes recrutés dans les éponges, nous avons utilisé une technique de cytométrie en flux sur des préparations de cellules isolées à partir de ces éponges. Nous avons observé que le VEGF et les angiopoïétines favorisent le recrutement de cellules endothéliales et la formation de nouveaux vaisseaux plus rapidement qu’en présence de PBS. Une fois formé au jour 7, ces nouveaux vaisseaux restent stables en nombre, et ne subissent pas une réorganisation importante de leur surface. Ces vaisseaux maturent grâce au recrutement et au recouvrement par les cellules musculaires lisses des néovaisseaux. En outre, le microenvironnement angiogénique est composé de cellules inflammatoires, principalement de neutrophiles, macrophages et quelques cellules de type B et T. Donc, le VEGF, l’Ang1 et l’Ang2 induisent séparément la formation et la stabilisation de nouveaux vaisseaux sanguins, ainsi que le recrutement de cellules inflammatoires avec des puissances différentes et une action temps-dépendante dans un modèle d’éponge/Matrigel.

Étude rétrospective évaluant le VEGF comme biomarqueur d’athérosclérose mesurée par coronarographie quantitative et ultrason intra-vasculaire

Introduction : Puisque le VEGF promeut l’inflammation et la néovascularisation des plaques athérosclérotiques, il pourrait contribuer à l’athérogénèse. Cependant, les données cliniques tentant de lier le VEGF à la maladie cardiaque athérosclérotique (MCAS) sont controversées. Nous avons investigué l’association entre les niveaux de VEGF et la sévérité de la MCAS. Méthode : Nous avons effectué une étude rétrospective transversale : 56 patients présentant une MCAS stable et 112 patients avec un syndrome coronarien aigue (SCA) ont été étudiés. Nous avons investigué la relation entre la charge athérosclérotique et les niveaux sériques de VEGF en utilisant la coronarographie par analyse quantitative (QCA) et avons évalué la morphologie des plaques athérosclérotiques en utilisant l’imagerie intravasculaire ultrasonore (IVUS). Résultats : Les niveaux de VEGF étaient plus bas chez les patients avec SCA que chez ceux avec MCAS stable. On observe une corrélation positive entre les niveaux de VEGF et le fardeau de la MCAS stable mesurée par le QCA Cumulative Coronary Stenosis Score - CCSS (Pearson r= 0,423 et p = 0,001). En analyse multivariée, les niveaux sériques de VEGF demeuraient prédicteurs du CCSS (p=0,003) des patients avec une MCAS stable. Nous avons observé une corrélation positive entre les niveaux de VEGF et le volume de plaque (Spearman r = 0.381, p = 0.035) ainsi que le pourcentage de volume d’athérome (Spearman r = 0.466, p = 0.008) mesurés par IVUS. Conclusions : Notre étude suggère un usage potentiel des niveaux sérique de VEGF comme biomarqueur de MCAS.

Rôles des protéines d’échafaudage Gab dans la signalisation et l’angiogenèse médiées par le VEGF

La protéine d’échafaudage Gab1 amplifie la signalisation de plusieurs récepteurs à fonction tyrosine kinase (RTK). Entre autres, elle promeut la signalisation du VEGFR2, un RTK essentiel à la médiation de l’angiogenèse via le VEGF dans les cellules endothéliales. En réponse au VEGF, Gab1 est phosphorylé sur tyrosine, ce qui résulte en la formation d’un complexe de protéines de signalisation impliqué dans le remodelage du cytosquelette d’actine et la migration des cellules endothéliales. Gab1 est un modulateur essentiel de l’angiogenèse in vitro et in vivo. Toutefois, malgré l’importance de Gab1 dans les cellules endothéliales, les mécanismes moléculaires impliqués dans la médiation de ses fonctions, demeurent mal définis et la participation du second membre de la famille, Gab2, reste inconnue. Dans un premier temps, nous avons démontré que tout comme Gab1, Gab2 est phosphorylé sur tyrosine, qu’il s’associe de façon similaire avec des protéines de signalisation et qu’il médie la migration des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Cependant, contrairement à Gab1, Gab2 n’interagit pas avec le VEGFR2 et n’est pas essentiel pour l’activation d’Akt et la promotion de la survie cellulaire. En fait, nous avons constaté que l’expression de Gab2 atténue l’expression de Gab1 et l’activation de la signalisation médiée par le VEGF. Ainsi, Gab2 semble agir plutôt comme un régulateur négatif des signaux pro-angiogéniques induits par Gab1. La migration cellulaire est une des étapes cruciales de l’angiogenèse. Nous avons démontré que Gab1 médie l’activation de la GTPase Rac1 via la formation et la localisation d’un complexe protéique incluant la GEF VAV2, la p120Caténine et la Cortactine aux lamellipodes des cellules endothéliales en réponse au VEGF. De plus, nous montrons que l’assemblage de ce complexe corrèle avec la capacité du VEGF à induire l’invasion des cellules endothéliales et le bourgeonnement de capillaires, deux phénomènes essentiels au processus angiogénique. La régulation des RhoGTPases est également régulée par des inactivateurs spécifiques les « Rho GTPases activating proteins », ou GAPs. Nous décrivons ici pour la première fois le rôle de la GAP CdGAP dans les cellules endothéliales et démontrons son importance dans la médiation de la signalisation du VEGF via la phosphorylation sur tyrosine de Gab1 et l’activation des RhoGTPases Rac1 et Cdc42. Ainsi, dù à son importance sur l’activation de voies de signalisation du VEGF, CdGAP représente un régulateur crucial de la promotion de diverses activités biologiques essentielles à l’angiogenèse telles que la migration cellulaire, et le bourgeonnement de capillaires in vitro et d’aortes de souris ex vivo. De plus, les embryons de souris CdGAP KO présentent des hémorragies et de l’œdème, et ces défauts vasculaires pourraient être responsables de la mortalité de 44% des souris CdGAP knock-out attendues. Nos études amènent donc une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires induits par le VEGF et démontrent l’implication centrale de Gab1 et des régulateurs des RhoGTPases dans la promotion de l’angiogenèse. Cette meilleure compréhension pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles ou approches thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients souffrant de maladies associées à une néovascularisation incontrôlée telles que le cancer.

Monoacylglycerol, alpha/beta-hydrolase domain-6, and the regulation of insulin secretion and energy metabolism

Le cycle glycérolipides/acides gras libres (GL/FFA) est une voie métabolique clé qui relie le métabolisme du glucose et des acides gras et il est composé de deux processus métaboliques appelés lipogenèse et lipolyse. Le cycle GL/FFA, en particulier la lipolyse des triglycérides, génère diverses molécules de signalisation pour réguler la sécrétion d'insuline dans les cellules bêta pancréatiques et la thermogenèse non-frissonnante dans les adipocytes. Actuellement, les lipides provenant spécifiquement de la lipolyse impliqués dans ce processus sont mal connus. L’hydrolyse des triglycérides dans les cellules β est réalisée par les actions successives de la triglycéride lipase adipocytaire pour produire le diacylglycérol, ensuite par la lipase hormono-sensible pour produire le monoacylglycérol (MAG) et enfin par la MAG lipase (MAGL) qui relâche du glycerol et des acides gras. Dans les cellules bêta, la MAGL classique est très peu exprimée et cette étude a démontré que l’hydrolyse de MAG dans les cellules β est principalement réalisée par l'α/β-Hydrolase Domain-6 (ABHD6) nouvellement identifiée. L’inhibition d’ABHD6 par son inhibiteur spécifique WWL70, conduit à une accumulation des 1-MAG à longues chaines saturées à l'intérieur des cellules, accompagnée d’une augmentation de la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS). Baisser les niveaux de MAG en surexprimant ABHD6 dans la lignée cellulaire bêta INS832/13 réduit la GSIS, tandis qu’une augmentation des niveaux de MAG par le « knockdown » d’ABHD6 améliore la GSIS. L'exposition aiguë des monoacylglycérols exogènes stimule la sécrétion d'insuline de manière dose-dépendante et restaure la GSIS supprimée par un inhibiteur de lipases appelé orlistat. En outre, les souris avec une inactivation du gène ABHD6 dans tous les tissus (ABHD6-KO) et celles avec une inactivation du gène ABHD6 spécifiquement dans la cellule β présentent une GSIS stimulée, et leurs îlots montrent une augmentation de la production de monoacylglycérol et de la sécrétion d'insuline en réponse au glucose. L’inhibition d’ABHD6 chez les souris diabétiques (modèle induit par de faibles doses de streptozotocine) restaure la GSIS et améliore la tolérance au glucose. De plus, les résultats montrent que les MAGs non seulement améliorent la GSIS, mais potentialisent également la sécrétion d’insuline induite par les acides gras libres ainsi que la sécrétion d’insuline induite par divers agents et hormones, sans altération de l'oxydation et l'utilisation du glucose ainsi que l'oxydation des acides gras. Nous avons démontré que le MAG se lie à la protéine d’amorçage des vésicules appelée Munc13-1 et l’active, induisant ainsi l’exocytose de l'insuline. Sur la base de ces observations, nous proposons que le 1-MAG à chaines saturées agit comme facteur de couplage métabolique pour réguler la sécrétion d'insuline et que ABHD6 est un modulateur négatif de la sécrétion d'insuline. En plus de son rôle dans les cellules bêta, ABHD6 est également fortement exprimé dans les adipocytes et son niveau est augmenté avec l'obésité. Les souris dépourvues globalement d’ABHD6 et nourris avec une diète riche en gras (HFD) montrent une faible diminution de la prise alimentaire, une diminution du gain de poids corporel et de la glycémie à jeun et une amélioration de la tolérance au glucose et de la sensibilité à l'insuline et ont une activité locomotrice accrue. En outre, les souris ABHD6-KO affichent une augmentation de la dépense énergétique et de la thermogenèse induite par le froid. En conformité avec ceci, ces souris présentent des niveaux élevés d’UCP1 dans les adipocytes blancs et bruns, indiquant le brunissement des adipocytes blancs. Le phénotype de brunissement est reproduit dans les souris soit en les traitant de manière chronique avec WWL70 (inhibiteur d’ABHD6) ou des oligonucléotides anti-sense ciblant l’ABHD6. Les tissus adipeux blanc et brun isolés de souris ABHD6-KO montrent des niveaux très élevés de 1-MAG, mais pas de 2-MAG. L'augmentation des niveaux de MAG soit par administration exogène in vitro de 1-MAG ou par inhibition ou délétion génétique d’ABHD6 provoque le brunissement des adipocytes blancs. Une autre évidence indique que les 1-MAGs sont capables de transactiver PPARα et PPARγ et que l'effet de brunissement induit par WWL70 ou le MAG exogène est aboli par les antagonistes de PPARα et PPARγ. L’administration in vivo de l’antagoniste de PPARα GW6471 à des souris ABHD6-KO inverse partiellement les effets causés par l’inactivation du gène ABHD6 sur le gain de poids corporel, et abolit l’augmentation de la thermogenèse, le brunissement du tissu adipeux blanc et l'oxydation des acides gras dans le tissu adipeux brun. L’ensemble de ces observations indique que ABHD6 régule non seulement l’homéostasie de l'insuline et du glucose, mais aussi l'homéostasie énergétique et la fonction des tissus adipeux. Ainsi, 1-MAG agit non seulement comme un facteur de couplage métabolique pour réguler la sécrétion d'insuline en activant Munc13-1 dans les cellules bêta, mais régule aussi le brunissement des adipocytes blancs et améliore la fonction de la graisse brune par l'activation de PPARα et PPARγ. Ces résultats indiquent que ABHD6 est une cible prometteuse pour le développement de thérapies contre l'obésité, le diabète de type 2 et le syndrome métabolique.

New insights into small molecules inhibitors and protein-protein interactions of VirB8 : a critical conserved component of the type IV secretion system.

Les systèmes bactériens de sécrétion de type IV (T4SS) sont constitués d’un ensemble de 8 à 12 protéines conservées. Ces dernières sont utilisées lors de la translocation de protéines, la translocation de complexes ADN-protéines mais aussi pour le transport de ces derniers au travers de la membrane cellulaire. Les T4SS, en tant que facteurs de virulence pour beaucoup de pathogènes comme Brucella suis, sont donc d’excellents modèles cibles pour le développement de médicaments d’antivirulence. Ces médicaments, en privant le pathogène de son facteur essentiel de virulence : le T4SS, constituent une alternative ou encore une amélioration des traitements antibiotiques utilisés actuellement. VirB8, un facteur d’assemblage conservé dans le T4SS, forme des dimères qui sont importants pour la fonction des T4SS dans ces pathogènes. De par ses interactions multiples, VirB8 est un excellent modèle pour l’analyse des facteurs d’assemblage mais aussi en tant que cible de médicaments qui empêcheraient son interaction avec d’autres protéines et qui, in fine, désarmeraient les bactéries en les privant de leur fonctions essentielles de virulence. À ce jour, nous savons qu’il existe un équilibre monomère-dimère et un processus d’homodimerization de VirB8 dont l’importance est vitale pour la fonctionnement biologique des T4SSs. En se basant sur des essais quantitatifs d’interaction, nous avons identifié (i) des sites potentiels d’interaction avec d’autres protéines VirB du T4SS mais aussi (ii) isolé des petites molécules inhibitrices afin de tester la fonction protéique de VirB8. Afin de déterminer les acides aminés importants pour l’hétérodimérization de VirB8 avec VirB10, nous avons effectué des expériences de mutagenèse aléatoire, de phage display et d’arrimage moléculaire in silico. Ces expériences ont démontré l’importance de trois acides aminés localisés sur le feuillet β : R160, S162, T164 et I165. Ces derniers seraient importants pour l’association de VirB8 avec VirB10 étant donné que leur mutagenèse entraine une diminution de la formation du complexe VirB8-VirB10. L’objectif actuel de notre projet de recherche est de pouvoir mieux comprendre mais aussi d’évaluer le rôle de VirB8 dans l’assemblage du T4SS. Grace à un méthode de criblage adaptée à partir de la structure de VirB8, nous avons pu identifié une petite molécule inhibitrice BAR-068, qui aurait un rôle prometteur dans l’inhibition du T4SS. Nous avons utilisé la spectroscopie par fluorescence, l’essai à deux hybrides, le cross-linking et la cristallographie afin de déterminer le mécanisme d'interaction existant entre VirB8 et BAR-068. Ces travaux pourraient permettre de nombreuses avancées, notamment en termes de compréhension des mécanismes d’inhibition du T4SS. Notre objectif ultime est de pouvoir caractériser la séquence d’évènements essentiels à l’assemblage et au fonctionnement du T4SS. De manière globale, notre projet de recherche permettrait de révéler les grands principes d’assemblage des protéines membranaires, les processus de sécrétion de protéines chez les bactéries mais aussi de proposer une nouvelle stratégie lors du développement de drogues antimicrobiennes.

Effect of interferon-TAU protein secretion in bovine endometrial cells and its modulation by steroid hormones

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mécanismes par lesquels le VEGF induit la translocation de la P-sélectine et l'adhésion des neutrophiles aux cellules endothéliales

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.