Novel surface-tethered estrogen polymeric platforms in cardiovascular regenerative medicine

L’estradiol (E2) est une hormone femelle qui joue un rôle essentiel, à la fois dans la régulation et dans la détermination de certaines conditions physiologiques in vivo, telle que la différenciation et la prolifération cellulaire. Lorsque l’E2 est donné en supplément, par exemple dans le cas de thérapie hormonale, deux effets sont observés, un effet génomique et un effet non-génomique, de par son interaction avec les récepteurs à œstrogène du noyau ou de la membrane cellulaire, respectivement. L’effet non-génomique est plus difficile à étudier biologiquement parce que l’effet se produit sur une échelle de temps extrêmement courte et à cause de la nature hydrophobe de l’E2 qui réduit sa biodisponibilité et donc son accessibilité aux cellules cibles. C’est pourquoi il est nécessaire de développer des systèmes d’administration de l’E2 qui permettent de n’étudier que l’effet non-génomique de l’œstrogène. Une des stratégies employée consiste à greffer l’E2 à des macromolécules hydrophiles, comme de l’albumine de sérum bovin (BSA) ou des dendrimères de type poly(amido)amine, permettant de maintenir l’interaction de l’E2 avec les récepteurs d’œstrogène de la membrane cellulaire et d’éviter la pénétration de l’E2 dans le noyau des cellules. Toutefois, ces systèmes macromolécules-E2 sont critiquables car ils sont peu stables et l’E2 peut se retrouver sous forme libre, ce qui affecte sa localisation cellulaire. L’objectif de cette thèse est donc de développer de nouvelles plateformes fonctionnalisées avec de l’E2 en utilisant les approches de synthèses ascendantes et descendantes. Le but de ces plateformes est de permettre d’étudier le mécanisme de l’effet non-génomique de l’E2, ainsi que d’explorer des applications potentielles dans le domaine biomédical. L’approche ascendante est basée sur un ligand d’E2 activé, l’acide 17,α-éthinylestradiol-benzoïque, attaché de façon covalente à un polymère de chitosan avec des substitutions de phosphorylcholine (CH-PC-E2). L’estradiol est sous forme de pro-drogue attachée au polymère qui s’auto-assembler pour former un film. L’effet biologique de la composition chimique du film de chitosan-phosphorylcholine a été étudié sur des cellules endothéliales. Les films de compositions chimiques différentes ont préalablement été caractérisés de façon physicochimique. La topographie de la surface, la charge de surface, ainsi que la rhéologie des différents films contenant 15, 25, ou 40% molaires de phosphorylcholine, ont été étudiés par microscopie à force atomique (AFM), potentiel zêta, résonance plasmonique de surface et par microbalance à cristal de quartz avec dissipation (QCM-D). Les résultats de QCM-D ont montré que plus la part molaire en phosphorylcholine est grande moins il y a de fibrinogène qui s’adsorbe sur le film de CH-PC. Des cellules humaines de veine ombilicale (HUVECs) cultivées sur des films de CH-PC25 et de CH-PC40 forment des amas cellulaire appelés sphéroïdes au bout de 4 jours, alors que ce n’est pas le cas lorsque ces cellules sont cultivées sur des films de CH-PC15. L’attachement de l’estradiol au polymère a été caractérisé par plusieurs techniques, telles que la résonance magnétique nucléaire de proton (1H NMR), la spectroscopie infrarouge avec transformée de Fourier à réfraction totale atténuée (FTIR-ATR) et la spectroscopie UV-visible. La nature hydrogel des films (sa capacité à retenir l’eau) ainsi que l’interaction des films avec des récepteurs à E2, ont été étudiés par la QCM-D. Des études d’imagerie cellulaires utilisant du diacétate de diaminofluoresceine-FM ont révélé que les films hydrogels de CH-PC-E2 stimulent la production d’oxyde nitrique par les cellules endothéliales, qui joue un rôle protecteur pour le système cardiovasculaire. L’ensemble de ces études met en valeur les rôles différents et les applications potentielles qu’ont les films de type CH-PC-E2 et CH-PC dans le cadre de la médecine cardiovasculaire régénérative. L’approche descendante est basée sur l’attachement de façon covalente d’E2 sur des ilots d’or de 2 μm disposés en rangées et espacés par 12 μm sur un substrat en verre. Les ilots ont été préparés par photolithographie. La surface du verre a quant à elle été modifiée à l’aide d’un tripeptide cyclique, le cRGD, favorisant l’adhésion cellulaire. L’attachement d’E2 sur les surfaces d’or a été suivi et confirmé par les techniques de SPR et de QCM-D. Des études d’ELISA ont montré une augmentation significative du niveau de phosphorylation de la kinase ERK (marqueur important de l’effet non-génomique) après 1 heure d’exposition des cellules endothéliales aux motifs alternant l’E2 et le cRGD. Par contre lorsque des cellules cancéreuses sont déposées sur les surfaces présentant des motifs d’E2, ces cellules ne croissent pas, ce qui suggère que l’E2 n’exerce pas d’effet génomique. Les résultats de l’approche descendante montrent le potentiel des surfaces présentant des motifs d’E2 pour l’étude des effets non-génomiques de l’E2 dans un modèle in vitro.

Photophysical Investigations of Thiophene Azomethine Derivatives

Une série de dimères composés de thiophène-aniline encombrée stériquement a été synthétisée. Les différents processus de désactivation de l’état singulet excité ont été étudiés par UV-visible, fluorescence, phosphorescence, photolyse par impulsion laser et calculs théoriques. Les graphiques de Stern-Volmer obtenus à partir des expériences de désactivation des états singulet et triplet ont démontré l’efficacité de l’azométhine à désactiver les fluorophores. Les calculs semi-empiriques AM1 examinant l’effet des substituants encombrés ont démontrés que les groupements tert-butyls sur l’aniline ont moins d’influence sur la barrière de rotation N-aryl que les substitutions alkyles en ont sur la rotation de thiophène-C. Les calculs Rehm-Weller basés sur les potentiels d’oxydation et de réduction ont montré que l’autodésactivation de l’état excité des azométhines se fait par transfert d’électron photoinduit menant à une éradication complète de la fluorescence. Des complexes métalliques contenant des ligands azométhines ont aussi été préparés. Le ligand est composé d’une unité hydroxyquinoline lié à un cycle thiophène. Les données photophysiques de ces complexes indiquent un déplacement bathochromique aussi bien en absorbance qu’en fluorescence. Des dispositifs de détection d’ion métallique ont été préparés et un exemple à partir d’une solution de cuivre a montré un déplacement bathochromique.

Synthesis, properties and characterization of N-Alkyl substituted b-Diketiminato copper(I) Complexes

Le ligand nacnacxylH (xyl = C6Me2H3) et les ligands dikétimines N-alkyle substitués (nacnacCH(Me)PhH, nacnacBnH and nacnaciPrH) ont été préparés avec de bons rendements à l’exception du nacnaciPrH (23%) en utilisant un protocole en une étape et à l’aide d’un montage Dean-Stark. La réaction du S,S-nacnacCH(Me)PhH et du nacnacBnH avec le nBuLi dans le THF conduit au S,S-nacnacCH(Me)PhLi(THF) et au nacnacBnLi(THF). Les tentatives de bromation de ces composés par le N-bromosuccinimide conduisent plutôt aux ligands S,S-succnacnacCH(Me)PhH et succnacnacBnH (succ = succinimido) substitués par un groupement succinimido sur le carbone  La chloration par le N-chlorosuccinimide conduit au produit désiré, mais avec des impuretés. La réaction de ces ligands avec le CuOtBu (ou bien MesCu, où Mes = C6Me3H2, et une quantité catalytique de CuOtBu) en présence de bases de Lewis donne les (nacnacxylCu)2(-toluène), nacnacxylCuCNC6H3(Me)2, nacnacCH(Me)PhCuL (L = PPh3, PMe3, CNC6H3(Me)2, DMAP, lutidine, Py, MeCN), nacnacBnCuL (L = PPh3, CNC6H3(Me)2, styrène, trans-stilbene, phenylvinylether, acrylonitrile, diphenylacetylène), nacnaciPrCuL (L = PPh3, CNC6H3(Me)2, MeCN) et le succnacnacCH(Me)PhCuL (PPh3, CNC6H3(Me)2, pyridine). Tous ces complexes sont jaunes et sensibles à l’air et à l’humidité. En l’absence de fortes bases de Lewis, on n’observe pas de réaction entre les précurseurs de cuivre et les ligands N-alkyle substitués. Les études RMN des complexes dans le C6D6 ne présentent pas de complexe de toluène mais un mélange à l’équilibre du (nacnacxylCu)2(-C6D6) et nacnacxylCu(C6D6) dans une proportion de 2 pour 1. Alors que l’addition de plus de cinquante équivalents soit de THF, soit de toluène n’induit aucun changement des spectres RMN, l’addition de 2 équivalents de MeCN conduit instantanément au complexe nacnacxylCu(MeCN). De plus, le (nacnacxylylCu)2(-C6D6) ne se coordone ni ne réagit avec le N2O, même après avoir été chauffé à 60°C pendant treize jours. En présence de DPA (diphenylacétylène), la réaction du nacnacBnH avec le CuOtBu conduit au dimère ponté (nacnacBnCu)2(µ-DPA). L’addition d’un excès de DPA (10-12 équivalents) transforme le dimère ponté en complexe lié en position terminale nacnacBnCuDPA. Les nacnacRH (R = CH(Me)Ph et i-Pr) ne forment pas de complexe ni avec les oléfines ni avec le DPA. Une réactivité similaire a été observée avec les complexes de nacnacCH(Me)PhCu(NCMe) et nacnaci-PrCu(NCMe). Tandis que le complexe lié en position terminale par MeCN a été isolé et caractérisé, l’équilibre en solution nous laisse suspecter la formation d’un complexe d’acétonitrile ponté. Des études de réactivité comparatives ont été menées sur quelques complexes de cuivre. La Morpholine ne réagit pas avec le nacnacBnCu(acrylonitrile) contrairement à l’acrylonitrile libre. L’expérience de l’échange d’oléfine montre que l’acrylonitrile (une oléfine électro-attractrice) se lie plus fortement que les autres oléfines, mettant ainsi en évidence l’importance de la rétrodonation  face à la donation La rétrodonation est cependant faible comparée aux autres complexes de styrène structurellement caractérisés. Les complexes nacnacCH(Me)PhCuL (L = PPh3 et MeCN) ont été employés dans la cyclopropanation catalytique du styrène et dans l’addition conjuguée du ZnEt2 sur la 2-cyclohexénone, mais les résultats indiquent que le ligand dikétimine est éliminé avant son entrée dans le cycle catalytique. Par conséquent, il n’y a pas d’induction chirale. Les complexes tétra coordinées de cuivre avec les nacnacRCu(phen) (R = Bn, CH(Me)Ph et Phen = 1,10-phenanthroline, 2-Mes-1,10-phenanthroline, 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline (dmp) et 2,9-diphenyl-1,10-phenanthroline (dpp)) ont été synthétisés. Ces complexes sont d’une intense couleur bleue et des interactions d’empilement entre l’un des cycles phényle des ligands nacnac et la phénanthroline ont été observées dans les structures à l’état solide. Les mesures en absorption UV-visible ont été effectuées dans le toluène et les bandes MLCT sont déplacées vers le rouge par rapport à celles des complexes de cuivre et bisphénanthroline. Tous ces composés émettent à l’état solide mais les complexes 1,10-phenanthroline et 2-Mes-1,10-phenanthroline n’émettent pas en solution. Pour renforcer les interactions d’empilement , les nouveaux ligands nacnacRH (R = CH2C6H2(OMe)3, CH2C6F5) et leurs complexes de cuivre respectifs ont été préparés avec du dmp et dpp. Afin de permettre la comparaison, le nacnaciBuCu(dmp) a été synthétisé. Alors que les complexes dmp montrent une augmentation des interactions intramoléculaires - avec les substituants phényle du ligand dikétimine et de la phénanthroline, les complexes dpp ne révèlent pas de telles interactions. Les complexes perfluorés montrent, en absorption et en émission, un déplacement significatif vers le bleu, alors que les complexes substitués par un groupements isobutyle présentent des transitions déplacées vers le rouge. Alors que les intensités de luminescence et les durées de vie sont faibles, les déplacements réduits de Stokes et les pics étroits de luminescence comparables indiquent une réduction des distorsions de l’état excité.