Analysis of HIV-1 Vpr determinants responsible for cell growth arrest in Saccharomyces cerevisiae

Affiliation: Département de microbiologie et immunologie, Faculté de médecine, Université de Montréal

Contrôle de la réponse immunitaire par l’indoleamine 2,3-dioxygénase : étude de la régulation d’une molécule immuno-suppressive dans les cellules cancéreuses et les lymphocytes B chez l’humain

Le système immunitaire se doit d’être étroitement régulé afin d’éviter que des réponses immunologiques inappropriées ou de trop forte intensité ne surviennent. Ainsi, différents mécanismes permettent de maintenir une tolérance périphérique, mais aussi d’atténuer la réponse lorsque celle-ci n’est plus nécessaire. De tels mécanismes sont cependant aussi exploités par les tumeurs, qui peuvent ainsi échapper à une attaque par le système immunitaire et donc poursuivre leur progression. Ces mécanismes immunosuppresseurs nuisent non seulement à la réponse naturelle contre les cellules tumorales, mais font aussi obstacle aux tentatives de manipulation clinique de l’immunité visant à générer une réponse anti-tumorale par l’immunothérapie. L’un des mécanismes par lesquels les tumeurs s’évadent du système immunitaire est l’expression d’enzymes responsables du métabolisme des acides aminés dont l’une des principales est l’indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO). Cette dernière dégrade le tryptophane et diminue ainsi sa disponibilité dans le microenvironnement tumoral, ce qui engendre des effets négatifs sur la prolifération, les fonctions et la survie des lymphocytes T qui y sont présents. Bien que la régulation de l’expression de cette enzyme ait été largement étudiée chez certaines cellules présentatrices d’antigènes, dont les macrophages et les cellules dendritiques, peu est encore connu sur sa régulation dans les cellules tumorales humaines. Nous avons posé l’hypothèse que différents facteurs produits par les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs (TIIC) régulent l’expression de l’IDO dans les cellules tumorales. Nous avons effectivement démontré qu’une expression de l’IDO est induite chez les cellules tumorales humaines, suite à une interaction avec des TIIC. Cette induction indépendante du contact cellulaire résulte principalement de l’interféron-gamma (IFN-g) produit par les lymphocytes T activés, mais est régulée à la baisse par l’interleukine (IL)-13. De plus, la fludarabine utilisée comme agent chimiothérapeutique inhibe l’induction de l’IDO chez les cellules tumorales en réponse aux lymphocytes T activés. Cette observation pourrait avoir des conséquences importantes en clinique sachant qu’une forte proportion d’échantillons cliniques provenant de tumeurs humaines exprime l’IDO. Enfin, les lymphocytes B, qui sont retrouvés également dans certaines tumeurs et qui interagissent étroitement avec les lymphocytes T, sont aussi susceptibles à une induction transcriptionnelle et traductionnelle de l’IDO. Cette enzyme est cependant produite sous une forme inactive dans les lymphocytes B, ce qui rend peu probable l’utilisation de l’IDO par les lymphocytes B comme mécanisme pour freiner la réponse immunitaire. Nos travaux apportent des informations importantes quant à la régulation de l’expression de la molécule immunosuppressive IDO dans les cellules cancéreuses. Ils démontrent que l’expression de l’IDO est influencée par la nature des cytokines présentes dans le microenvironnement tumoral. De plus son expression est inhibée par la fludarabine, un agent utilisé pour le traitement de certains cancers. Ces données devraient être prises en considération dans la planification de futurs essais immunothérapeutiques, et pourraient avoir un impact sur les réponses cliniques anti-tumorales.

Étude du mécanisme de régulation de la sénescence et de p53 par la protéine SOCS1

Les mécanismes cellulaires anti-prolifératifs, lesquels comprennent l’apoptose, aussi appelée la mort cellulaire programmée, l’arrêt transitoire du cycle cellulaire et la sénescence, permettent à la cellule de prévenir, en réponse à différents stress, l’accumulation de mutations pouvant conduire à une prolifération incontrôlée et, éventuellement, au développement d’une tumeur. La régulation de ces différents mécanismes requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et l’activation conduit à une hausse de l’expression de gènes directement impliqués dans l’arrêt de la prolifération. Au cours des dernières années, l’ensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en évidence la complexité de sa fonction, de même que la multitude de voies de signalisation et de protéines avec lesquelles il coopère pour maintenir l’intégrité du génome. De ce fait, l’étude des mécanismes d’activation de p53 est de mise pour la compréhension de sa régulation et, éventuellement, pour la prévention et l’élaboration de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer. L’objet de cette thèse est la mise en évidence d’un mécanisme d’activation de p53 et de la sénescence par la protéine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mécanisme implique une interaction directe entre les deux protéines, plus précisément entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit également, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage à l’ADN de façon à faciliter la phosphorylation de p53 en sérine 15. Ainsi, en interagissant à la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue à la stabilisation et à l’activation de p53. En accord avec ce modèle, l’inhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend à diminuer le nombre de cellules sénescentes suite à l’expression de l’oncogène ca-STAT5A et à réduire l’accumulation nucléaire de p53 dans ces cellules. De la même façon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifnγ-/- sont moins susceptibles d’entrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifnγ+/+, suite à une exposition à des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de l’expression des gènes cibles de p53, ce qui démontre que SOCS1 est impliquée dans l’activation de p53 in vivo. Cette thèse a également pour but de mettre en évidence l’implication de SOCS1 dans l’activation d’autres facteurs de transcription et, par le fait même, de démontrer qu’elle peut agir comme un régulateur plus général de la transcription. Une étude approfondie de l’interaction entre SOCS1 et p53 a permis de démontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides aminés 36-67) est suffisant pour l’interaction. Plus précisément, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phénylalanine 54 (F54) sont les principaux résidus impliqués. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit à l’identification d’un motif conservé dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus d’un domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces résultats, SOCS1 est en mesure d’interagir avec chacune des deux protéines. Ainsi, la capacité de SOCS1 d’interagir et de réguler l’activité de p53 peut s’étendre à d’autres facteurs de transcription. En terminant, le mécanisme présenté dans cette thèse contribue à la compréhension de la régulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en évidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle était jusqu’alors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rôle pour SOCS1 permet d’expliquer de quelle manière une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut déclencher la sénescence ou l’apoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse réguler différents facteurs de transcription permet de la qualifier de régulateur général des facteurs de transcription composés d’un domaine de transactivation acide.

Détection, caractérisation et visualisation des structures transitoires de protéines par sondage au tryptophane

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Méthodologie pour la synthèse combinatoire d’azapeptides: application à la synthèse d’analogues aza-GHRP-6 en tant que ligands du récepteur CD36

Les azapeptides sont des mimes peptidiques où le carbone alpha d’un ou de plusieurs acides aminés est remplacé par un atome d’azote. Cette modification tend à stabiliser une conformation en repliement beta en raison de la répulsion électronique entre les paires d’électrons libres des atomes d’azote adjacents et de la géométrie plane de l’urée. De plus, le résidu semicarbazide a une meilleure résistance face aux protéases en plus d’être chimiquement plus stable qu’une liaison amide. Bien que les propriétés des azapeptides en fassent des mimes peptidiques intéressants, leurs méthodes de synthèses font appel à la synthèse laborieuse d’hydrazines substituées en solution. Le peptide sécréteur d’hormone de croissance 6 (GHRP-6, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2) est un hexapeptide synthétique qui possède une affinité pour deux récepteurs distincts: les récepteurs GHS-R1a et CD36. Les travaux effectués au cours de mon doctorat qui seront détaillés dans cet ouvrage visent à atteindre deux objectifs: (1) le développement d’analogues du peptide GHRP-6 sélectif à un seul récepteur et (2) la mise au point d’une nouvelle méthodologie pour la synthèse combinatoire d’azapeptides. En réponse au premier objectif, la synthèse parallèle de 49 analogues aza-GHRP-6 a été effectuée et certains candidats sélectifs au récepteur CD36 ont été identifiés. L’étude de leurs propriétés anti-angiogéniques, effectuée par nos collaborateurs, a également permis d’identifier des candidats intéressants pour le traitement potentiel de la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Une nouvelle approche pour la synthèse combinatoire d’azapeptides, faisant appel à l’alkylation et la déprotection chimiosélective d’une sous-unité semicarbazone ancrée sur support solide, a ensuite été développée. La portée de cette méthodologie a été augmentée par la découverte de conditions permettant l’arylation régiosélective de cette sous-unité semicarbazone, donnant accès à treize nouveaux dérivés aza-GHRP-6 possédant des résidus aza-arylglycines aux positions D-Trp2 et Trp4. L’élaboration de conditions propices à l’alkylation et la déprotection chimiosélective de la semicarbazone a donné accès à une variété de chaînes latérales sur l’acide aminé « aza » préalablement inaccessibles. Nous avons, entre autres, démontré qu’une chaîne latérale propargyl pouvait être incorporée sur l’acide aminé « aza ». Tenant compte de la réactivité des alcynes, nous avons ensuite élaboré des conditions réactionnelles permettant la formation in situ d’azotures aromatiques, suivie d’une réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire sur support solide, dans le but d’obtenir des mimes de tryptophane. Sept analogues du GHRP-6 ont été synthétisés et testés pour affinité au récepteur CD36 par nos collaborateurs. De plus, nous avons effectué une réaction de couplage en solution entre un dipeptide possédant un résidu aza-propargylglycine, du paraformaldehyde et une variété d’amines secondaires (couplage A3) afin d’accéder à des mimes rigides d’aza-lysine. Ces sous-unités ont ensuite été incorporées sur support solide afin de générer sept nouveaux azapeptides avec des dérivés aza-lysine à la position Trp4 du GHRP-6. Enfin, une réaction de cyclisation 5-exo-dig a été développée pour la synthèse de N-amino imidazolin-2-ones en tant que nouveaux mimes peptidiques. Leur fonctionnalisation par une série de groupements benzyliques à la position 4 de l’hétérocycle a été rendue possible grâce à un couplage Sonogashira précédant la réaction de cyclisation. Les propriétés conformationnelles de cette nouvelle famille de composés ont été étudiées par cristallographie aux rayons X et spectroscopie RMN d’un tétrapeptide modèle. L’activité biologique de deux mimes peptidiques, possédant un résidu N-amino-4-méthyl- et 4-benzyl-imidazolin-2-one à la position Trp4 du GHRP-6, a aussi été examinée. L’ensemble de ces travaux devrait contribuer à l’avancement des connaissances au niveau des facteurs structurels et conformationnels requis pour le développement d’azapeptides en tant que ligands du récepteur CD36. De plus, les résultats obtenus devraient encourager davantage l’utilisation d’azapeptides comme peptidomimétiques grâce à leur nouvelle facilité de synthèse et la diversité grandissante au niveau de la chaîne latérale des acides aminés « aza ».

Dépression majeure et douleur : deux problématique liées, mais à quel point?

La dépression majeure et les douleurs chroniques sont deux problématiques distinctes, mais liées par une comorbidité élevée et un effet néfaste sur la qualité de vie des individus atteints. Ce mémoire est consacré aux liens qui les unissent et présente deux études. L’étude 1 évalue l’impact de la déplétion aiguë du tryptophane sur les mécanismes endogènes de freinage de la douleur chez des participants sains. L’étude 2 évalue l’intégrité des mécanismes endogènes de freinage de la douleur chez des patients souffrant de dépression majeure (DM) avant et après un traitement aux antidépresseurs à double action (Duloxétine ou Desvenlafaxine). Les données des patients de l’étude 2 sont aussi comparées à celles d’un groupe de sujets sains pour mieux comprendre l’effet de la DM sur les mécanismes endogènes de freinage de la douleur. L’étude 1 montre que la déplétion aiguë du tryptophane bloque les mécanismes endogènes de freinage de la douleur. L’étude 2 montre que les patients souffrant de DM ont une capacité de freinage de la douleur intacte, qui est réduite par l’administration de médicaments. En conclusion, les mécanismes de freinage de la douleur semblent affectés par la déplétion aiguë du tryptophane. Les participants en DM ont une capacité d’inhibition de la douleur préservée par rapport aux sujets sains et affectée suite à la prise du médicament. Ces résultats permettent d’envisager un écart théorique entre la DM et les douleurs chroniques.

Les azasulfurylpeptides : synthèse, analyse conformationnelle et applications biologiques

Les azasulfurylpeptides sont des mimes peptidiques auxquels le carbone en position alpha et le carbonyle d’un acide aminé sont respectivement remplacés par un atome d’azote et un groupement sulfonyle (SO2). Le but premier de ce projet a été de développer une nouvelle méthode de synthèse de ces motifs, également appelés N-aminosulfamides. À cette fin, l’utilisation de sulfamidates de 4-nitrophénol s’est avérée importante dans la synthèse des azasulfuryltripeptides, permettant le couplage d’hydrazides avec l’aide d’irradiation aux micro-ondes (Chapitre 2). Par la suite, en quantité stoechiométrique d’une base et d’un halogénure d’alkyle, les azasulfurylglycines (AsG) formés peuvent être chimiosélectivement alkylés afin d’y insérer diverses chaînes latérales. Les propriétés conformationnelles des N-aminosulfamides à l’état solide ont été élucidées grâce à des études cristallographiques par rayons X : elles possèdent une structure tétraédrique autour de l’atome de soufre, des traits caractéristiques des azapeptides et des sulfonamides, ainsi que du potentiel à favoriser la formation de tours gamma (Chapitre 3). Après le développement d’une méthode de synthèse des N-aminosulfamides en solution, une approche combinatoire sur support solide a également été élaborée sur la résine amide de Rink afin de faciliter la génération d’une librairie d’azasulfurylpeptides. Cette étude a été réalisée en employant le growth hormone releasing peptide 6 (GHRP-6, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2). Ce dernier est un hexapeptide possédant une affinité pour deux récepteurs, le growth hormone secretagogue receptor 1a (GHS-R1a) et le récepteur cluster of differenciation 36 (CD36). Une affinité sélective envers le récepteur CD36 confère des propriétés thérapeutiques dans le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Six analogues d’azasulfurylpeptides de GHRP-6 utilisés comme ligands du CD36 ont été synthétisés sur support solide, mettant en évidence le remplacement du tryptophane à la position 4 de GHRP-6 (Chapitre 4). Les analogues de GHRP-6 ont été ensuite analysés pour leur capacité à moduler les effets de la fonction et de la cascade de signalisation des ligands spécifiques au Toll-like receptor 2 (TLR2), en collaboration avec le Professeur Huy Ong du département de Pharmacologie à la Faculté de Pharmacie de l’Université de Montréal. Le complexe TLR2-TLR6 est reconnu pour être co-exprimé et modulé par CD36. En se liant au CD36, certains ligands de GHRP-6 ont eu un effet sur la signalisation du TLR2. Par exemple, les azasulfurylpeptides [AsF(4-F)4]- et [AsF(4-MeO)4]-GHRP-6 ont démontré une capacité à empêcher la surproduction du monoxyde d’azote (NO), un sous-produit réactif formé suite à l’induction d’un signal dans les macrophages par des ligands spécifiques liés au TLR2, tel le fibroblast-stimulating lipopeptide 1 (R-FSL-1) et l’acide lipotéichoïque (LTA). En addition, la sécrétion du tumor necrosis factor alpha (TNFa) et du monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), ainsi que l’activation du nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-kB), ont été réduites. Ces résultats démontrent le potentiel de ces azasulfurylpeptides à pouvoir réguler le rôle du TLR2 qui déclenche des réponses inflammatoires et immunitaires innées (Perspectives). Finalement, le potentiel des azasulfurylpeptides d’inhiber des métallo-bêta-lactamases, tels le New-Delhi Metallo-bêta-lactamase 1 (NDM-1), IMP-1 et le Verona Integron-encoded Metallo-bêta-lactamase 2 (VIM-2), a été étudié en collaboration avec le Professeur James Spencer de l’Université de Bristol (Royaumes-Unis). Certains analogues ont été des inhibiteurs micromolaires du IMP-1 (Perspectives). Ces nouvelles voies de synthèse des azasulfurylpeptides en solution et sur support solide devraient donc permettre leur utilisation dans des études de relations structure-activité avec différents peptides biologiquement actifs. En plus d'expandre l'application des azasulfurylpeptides comme inhibiteurs d'enzymes, cette thèse a révélé le potentiel de ces N-aminosulfamides à mimer les structures secondaires peptidiques, tels que les tours gamma. À cet égard, l’application des azasulfurylpeptides a été démontrée par la synthèse de ligands du CD36 présentant des effets modulateurs sur le TLR2. Compte tenu de leur synthèse efficace et de leur potentiel en tant qu’inhibiteurs, les azasulfurylpeptides devraient trouver une large utilisation dans les sciences de peptides pour des applications dans la médecine et de la chimie biologique.

Étude du mécanisme de repliement de l'ubiquitine de levure par l'introduction de contraintes conformationnelles dans son état dénaturé

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Traitement de la maladie du greffon contre l’hôte chronique par la photophérèse extra corporelle au TH9402 : m écanisme de régulation de la maladie du greffon contre l’hôte chronique par les cellules T régulatrices

La maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) est la principale cause de mortalité et de morbidité suite aux greffes de cellules souches hématopoïétiques. Plusieurs patients demeurent réfractaires aux traitements actuels ce qui rend nécessaire le développement de nouvelles stratégies afin de combattre cette maladie. Dans l’étude qui suit, nous avons utilisé un nouvel agent thérapeutique, le TH9402, une molécule photosensible et démontré qu’elle permet, lorsqu’exposée à la lumière visible (514 nm), d’éliminer sélectivement les cellules T activées in vivo tout en préservant les cellules T au repos et les cellules T régulatrices (Tregs). Les Tregs ainsi préservés peuvent abroger la réponse alloréactive par la sécrétion d’IL-10 ou par contact cellule-cellule via un mécanisme impliquant le CTLA-4. Nous avons découvert que la signalisation du CTLA-4 était associée à une hausse de la population Treg in vitro. Cette hausse est due à la conversion de cellules T CD4+CD25- en Tregs et non à une prolifération sélective des Tregs. Dans la deuxième partie de cette étude, nous avons démontré que la signalisation de CTLA-4 était associée à une augmentation de l’expression de la protéine Indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO). Ces effets nécessitent la déplétion du tryptophane ainsi que de la protéine de phase aigue GCN2. Finalement, nous avons observé que l’infusion de cellules traitées au TH9402 chez des patients souffrant de GVHD chronique est associée à une augmentation de la population Treg chez ces patients sans causer de lymphopénie ni de diminution de la réponse immunitaire dirigée contre les antigènes viraux. Ces résultats suggèrent que le traitement au TH9402 pourrait représenter une approche particulièrement intéressante pour le traitement de la GVHD chronique réfractaire aux traitements actuels. De plus, l’augmentation de l’expression d’IDO pourrait être utilisée comme valeur prédictive de la réponse du patient au traitement. Ceci pourrait permettre d’améliorer la qualité de soins ainsi que de la qualité de vie des patients souffrant de GVHD chronique.