Regulation of excitotoxicity in thiamine deficiency : role of glutamate transporters.

L’excitotoxicité est un mécanisme physiopathologique majeur impliqué dans la pathogenèse de la déficience en thiamine (DT). Dans les régions cérébrales vulnérables à la DT, on observe une mort cellulaire induite par excitotoxicité dont l’origine semble être la conséquence d’une perturbation du métabolisme énergétique mitochondrial, d’une dépolarisation membranaire soutenue et d’une diminution de l’absorption du glutamate par les astrocytes suite à la diminution de l’expression des transporteurs EAAT1 et EAAT2. Il est clairement établi que le glutamate joue un rôle central dans l’excitotoxicité lors de la DT. Ainsi, la mise en évidence des mécanismes impliqués dans la diminution de l’expression des transporteurs du glutamate est essentielle à la compréhension de la physiopathologie de la DT. L’objectif de cette thèse consiste en l’étude de la régulation des transporteurs astrocytaires du glutamate et la mise au point de stratégies thérapeutiques ciblant la pathogenèse de l’excitotoxicité lors de l’encéphalopathie consécutive à la DT. Les principaux résultats de cette thèse démontrent des perturbations des transporteurs du glutamate à la fois dans des modèles animaux de DT et dans des astrocytes en culture soumis à une DT. La DT se caractérise par la perte du variant d’épissage GLT-1b codant pour un transporteur du glutamate dans le thalamus et le colliculus inférieur, les régions cérébrales affectées lors d’une DT, en l’absence de modification des niveaux d’ARNm. Ces résultats suggèrent une régulation post-transcriptionnelle de l’expression des transporteurs du glutamate en condition de DT. Les études basées sur l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des facteurs de transcription NFkB et de l’enzyme nucléaire poly(ADP)ribose polymérase-1 (PARP-1) démontrent que la régulation de l’expression du transporteur GLT-1 est sous le contrôle de voies de signalisation NFkB dépendantes de PARP-1. Cette étude démontre une augmentation de l’activation de PARP-1 et de NFkB dans les régions vulnérables chez le rat soumis à une DT et en culture d’astrocytes DT. L’inhibition pharmacologique du facteur de transcription NFkB par le PDTC induit une augmentation des niveaux d’expression de GLT-1, tandis que l’inhibition de PARP-1 par le DPQ conduit à l’inhibition de l’hyperactivation de NFkB observée lors de DT. L’ensemble de ces résultats met en évidence un nouveau mécanisme de régulation des transporteurs du glutamate par l’activation de PARP-1. L’accumulation de lactate est une caractéristique de la DT. Un traitement avec le milieu de culture d’astrocytes en condition de DT sur des cultures d’astrocytes naïfs induit une diminution de l’expression de GLT-1 ainsi qu’une inhibition de la capacité d’absorption du glutamate par les astrocytes naïfs. En revanche, l’administration de lactate exogène ne modifie pas le niveau d’expression protéique de GLT-1. Ainsi, des facteurs solubles autres que le lactate sont sécrétés par des astrocytes en condition de perturbation métabolique et peuvent potentiellement réguler l’activité des transporteurs du glutamate et contribuer à la pathogenèse du syncytium astroglial. En outre, la ceftriaxone, un antibiotique de la famille des β-lactamines, augmente de façon différentielle l’expression du variant-d’épissage GLT-1 dans le colliculus inférieur chez le rat DT et en culture d’astrocytes DT. Ces résultats suggèrent que la ceftriaxone peut constituer une avenue thérapeutique dans la régulation de l’activité des transporteurs du glutamate lors de DT. Pour conclure, la mort cellulaire d’origine excitotoxique lors de DT survient en conséquence d’une dysfonction mitochondriale associée à une perturbation du métabolisme énergétique cérébral. La modification de l’expression des transporteurs du gluatamate est sous le contrôle des voies de signalisation NFkB dépendantes du facteur PARP-1. De plus, l’inhibition métabolique et l’augmentation des sécrétions de lactate observées lors de DT peuvent également constituer un autre mécanisme physiopathologique expliquant la diminution d’expression des transporteurs de glutamate. Enfin, la ceftriaxone pourrait représenter une stratégie thérapeutique potentielle dans le traitement de la régulation de l’expression des transporteurs du glutamate et de la perte neuronale associés à l’excitotoxicité observée lors de DT.

The nuclear pore complex and its transporters : from virus-host interactors to subverting the innate antiviral immunity

Les virus ont besoin d’interagir avec des facteurs cellulaires pour se répliquer et se propager dans les cellules d’hôtes. Une étude de l'interactome des protéines du virus d'hépatite C (VHC) par Germain et al. (2014) a permis d'élucider de nouvelles interactions virus-hôte. L'étude a également démontré que la majorité des facteurs de l'hôte n'avaient pas d'effet sur la réplication du virus. Ces travaux suggèrent que la majorité des protéines ont un rôle dans d'autres processus cellulaires tel que la réponse innée antivirale et ciblées pas le virus dans des mécanismes d'évasion immune. Pour tester cette hypothèse, 132 interactant virus-hôtes ont été sélectionnés et évalués par silençage génique dans un criblage d'ARNi sur la production interferon-beta (IFNB1). Nous avons ainsi observé que les réductions de l'expression de 53 interactants virus-hôte modulent la réponse antivirale innée. Une étude dans les termes de gène d'ontologie (GO) démontre un enrichissement de ces protéines au transport nucléocytoplasmique et au complexe du pore nucléaire. De plus, les gènes associés avec ces termes (CSE1L, KPNB1, RAN, TNPO1 et XPO1) ont été caractérisé comme des interactant de la protéine NS3/4A par Germain et al. (2014), et comme des régulateurs positives de la réponse innée antivirale. Comme le VHC se réplique dans le cytoplasme, nous proposons que ces interactions à des protéines associées avec le noyau confèrent un avantage de réplication et bénéficient au virus en interférant avec des processus cellulaire tel que la réponse innée. Cette réponse innée antivirale requiert la translocation nucléaire des facteurs transcriptionnelles IRF3 et NF-κB p65 pour la production des IFNs de type I. Un essai de microscopie a été développé afin d'évaluer l’effet du silençage de 60 gènes exprimant des protéines associés au complexe du pore nucléaire et au transport nucléocytoplasmique sur la translocation d’IRF3 et NF-κB p65 par un criblage ARNi lors d’une cinétique d'infection virale. En conclusion, l’étude démontre qu’il y a plusieurs protéines qui sont impliqués dans le transport de ces facteurs transcriptionnelles pendant une infection virale et peut affecter la production IFNB1 à différents niveaux de la réponse d'immunité antivirale. L'étude aussi suggère que l'effet de ces facteurs de transport sur la réponse innée est peut être un mécanisme d'évasion par des virus comme VHC.

Les mécanismes excitotoxiques et le rôle de transporteurs de glutamate dans la physiopathologie des traumatismes crâniens = Excitotoxic mechanisms and the role of glutamate transporters in the pathophysiology of traumatic brain injury

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La limitation de responsabilité dans le transport multimodal

"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de L.L.M. en droit des affaires"

Statut des transporteurs du cholestérol au niveau de l'intestin et du foie dans le diabète de type 2

La résistance à l’insuline et le diabète de type 2 (DT2) sont caractérisés par une hyperlipidémie. Le but de cette étude est de déterminer si le DT2 contribue au dérèglement du métabolisme du cholestérol au niveau du petit intestin et du foie du Psammomys obesus, un modèle animal nutritionnel d’induction de la résistance à l’insuline et du DT2. L’absorption intestinale du cholestérol est diminuée chez les animaux diabétiques. Cette diminution est associée à une baisse (i) de l’expression génique et protéique de NPC1-L1 qui joue un rôle primordial dans l’absorption du cholestérol au niveau des entérocytes; et (ii) de l’ARNm de l’ABCA1 responsable de l’efflux de cholestérol des cellules intestinales à l’apolipoprotéine A-I et aux HDLs. En ce qui a trait aux transporteurs SR-B1 et Annexin II, aucune différence n’a été observée au niveau intestinal. Toutefois, une diminution significative de l’expression génique de l’ABCG5, un intervenant majeur dans la sécrétion du cholestérol des entérocytes vers la lumière intestinale, est mesurée chez les animaux diabétiques. De plus, l’expression protéique est diminuée pour le PCSK9 et augmentée pour le LDLr au niveau du jéjunum, tandis que la quantité de protéine de l’enzyme HMG-CoA réductase est régulée à la baisse chez les Psammomys obesus diabétiques. Finalement, de tous les facteurs de transcription testés seule une augmentation de LXR et une diminution de PPAR/δ sont détectées au niveau de l’intestin. Au niveau hépatique, il y a (i) une augmentation de la masse protéique de NPC1-L1, SR-BI et Annexin II; (ii) une élévation l’ARNm de SR-BI; (iii) une diminution du contenu protéique de ABCG8 et de l’expression génique de l’ABCG5 et de l’ABCA1; et (iv) une élévation de l’ARNm de LXR et de PPAR/δ, tout comme une baisse de l’expression protéique de SREBP-2. Somme toute, nos résultats montrent que le développement du diabète de type 2 chez le Psammomys obesus entraîne un changement dans la machinerie intra-entérocytaire et hépatocytaire, qui mène à un dérèglement de l’homéostasie du cholestérol.

Caractérisation du co-transporteur Na+/myo-inositol SMIT2 dans les membranes en bordure en brosse de rein de lapin et d’intestin de rat

Le myo-inositol (MI) est un soluté organique impliqué dans diverses fonctions physiologiques de la cellule dont la signalisation cellulaire. Il est également un osmolyte compatible reconnu. Trois co-transporteurs de type actif secondaire responsables de son absorption ont été identifiés. Deux d’entre eux sont couplés au transport du sodium (SMIT1 et SMIT2) et le troisième est couplé au transport de protons (HMIT). L’objectif de cette étude a été la caractérisation du transport du MI par SMIT2 dans des membranes en bordure en brosse (BBMv) issues du rein de lapin et de l’intestin de rat ainsi qu’après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis. La quantification de l’ARNm de SMIT1 et de SMIT2 dans le rein nous a appris que SMIT1 est majoritairement présent dans la médullaire alors que SMIT2 est principalement localisé dans le cortex. Ces résultats ont été confirmés par immunobuvardage en utilisant un anticorps dirigé contre SMIT2. Grâce à l’inhibition sélective de SMIT1 par le L-Fucose et de SMIT2 par le D-chiro-inositol (DCI), nous avons démontré que SMIT2 semble le seul responsable du transport luminal de MI dans le tubule contourné proximal avec un Km de 57 ± 14 µM. Pour ce qui est de l’intestin, des études de transport de MI radioactif ont démontré une absence de transport de MI chez le lapin alors que l’intestin de rat présente un transport de MI très actif. Une quantification par qRT-PCR nous a permis de constater que l’intestin de lapin ne semble pas posséder les transporteurs de MI nécessaires. Comme pour le rein, SMIT2 semble le seul transporteur de MI présent au niveau du pôle apical des entérocytes intestinaux chez le rat. Il est chargé du prélèvement du MI de l'alimentation avec un Km de 150 ± 40 µM. Les analyses fonctionnelles exécutées sur SMIT2 de rat en électrophysiologie après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis donnent sensiblement les mêmes résultats que pour les BBMv de rein de lapin et d’intestin de rat. Dans les ovocytes, SMIT2 présente une grande affinité pour le MI (270 ± 19 µM) et le DCI (310 ± 60 µM) et aucune affinité pour le L-fucose. Il est ii également très sensible à la phlorizine (16 ± 7 µM). Une seule exception persiste : la constante d’affinité pour le glucose dans les BBMv d’intestin de rat est 40 fois plus petite que celle observée sur les ovocytes de Xenopus laevis. Nous avons également testé la capacité de certains transporteurs de sucre présents à la surface des membranes apicales des entérocytes à prélever le MI. Vu que l'inhibition de ces transporteurs (SGLT1 et GLUT5) ne changeait rien au taux de MI radioactif transporté, nous en avons conclu qu'ils ne sont pas impliqués dans son transport. Finalement, l’efflux de MI à partir du pôle basolatéral des entérocytes n’est pas effectué par GLUT2 puisque ce dernier lorsqu'il est exprimé dans des ovocytes, est incapable de transporter le MI.

Les transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI, SR-BII, CD36 et ABCA1 contribuent au maintien de l’homéostasie du cholestérol intratesticulaire

Le testicule assure la production des spermatozoïdes et la sécrétion de la testostérone. Chaque fonction est assumée par un compartiment cellulaire distinct: l’épithélium séminifère et le tissu interstitiel. Le cholestérol, présent dans les deux compartiments, est un composé indispensable aux membranes cellulaires et un précurseur essentiel de la testostérone. Dans le compartiment interstitiel, environ 40 % du cholestérol utilisé pour la production hormonale est importé du sang à partir des lipoprotéines HDL et/ou LDL. Dans l’épithélium séminifère, la cellule de Sertoli assure le contrôle et le maintien de la spermatogenèse. Elle a la capacité de synthétiser du cholestérol à partir de l’acétate in vitro, néanmoins, il n’y a pas d’évidence qu’elle le fait in vivo. De plus il existe, au niveau des tubules séminifères, une barrière hémato-testiculaire qui empêche le libre passage de plusieurs composés sanguins, y compris le cholestérol. Nous avons testé l’hypothèse qu’il existe des moyens d’importation du cholestérol sanguin, mais aussi l’exportation du cholestérol intra-tissulaire, qui contourneraient cette barrière et qui contribueraient au maintien du taux intratubulaire du cholestérol compatible avec le bon déroulement de la spermatogenèse. Nous avons comparé les taux de variation de l’expression de l’ARNm et de la protéine des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI, SR-BII, CD36 et ABCA1 aux taux de variation du cholestérol libre et estérifié au cours de la spermatogenèse chez les souris normales durant le développement postnatal. Afin de mieux apprécier le niveau d’implication de chacun de ces récepteurs, nous avons examiné comment la suppression du gène d’une enzyme comme la lypase hormono-sensible (HSL) ou de celui d’un transporteur de cholestérol comme SR-BI, CD36 ou NPC1 était compensée et comment cette suppression affectait le taux de cholestérol libre et estérifié dans chacun des deux compartiments cellulaires du testicule. Nous avons dans un premier temps mis au point une nouvelle technique d’isolation des testicules en fraction enrichie en tissu interstitiel (ITf) et en tubules séminifères (STf) qui a l’avantage de mieux préserver l’intégrité des formes phosphorylées et glycosylées des protéines comparée aux techniques préexistantes. Les résultats de nos analyses ont montré que l’expression de SR-BI et CD36 étaient maximales dans les ITf au moment où les souris ont complété leur maturité sexuelle et où le niveau de synthèse de la testostérone était maximal. Dans les tubules séminifères, l’expression maximale de SR-BI et le taux le plus élevé de cholestérol estérifié étaient mesurés de façon concomitante à 35 jours après la naissance, au moment où la première vague de l’activité spermatogénétique était complétée. L’expression de l’ABCA1 était maximale au moment où le taux de cholestérol était élevé et minimale au moment où le taux de cholestérol était le plus bas, alors que le niveau d’expression de CD36 était maximal chez l’adulte au moment où le taux de spermiation était le plus élevé. L’expression de SR-BII variait peu dans les deux compartiments cellulaires durant le développement. La suppression génétique de la HSL et de NPC1, qui cause une infertilité chez les souris mâles, était accompagnée d’une accumulation de cholestérol libre et estérifié dans les tubules séminifères. Par contre, la suppression génétique de SR-BI et CD36, qui ne causent pas d’infertilité chez les souris mâles était sans impact significatif sur le taux de cholestérol intratubulaire. Nous avons montré que l’invalidation génétique d’un transporteur sélectif ou d’une enzyme du métabolisme du cholestérol était accompagnée d’un ensemble de mécanismes de compensation visant à maintenir le taux de cholestérol libre aux niveaux semblables à ceux mesurés dans les fractions tissulaires de souris normales. Ensemble, nos résultats ont montré que l’expression des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI, SR-BII, CD36 et ABCA1 variait en fonction de la spermatogenèse et du taux intratesticulaire du cholestérol suggérant leur contribution au maintien de l’homéostasie du cholestérol intratesticulaire.

Modulation de l’expression du transporteur vésiculaire du glutamate : implication dans la plasticité des neurones dopaminergiques

De nombreuses études ont établi que la majorité des neurones libèrent plus qu’une substance chimique. Il est bien connu que les neurones peuvent co-exprimer et co-libérer des neuropeptides en plus de leur neurotransmetteur, mais des évidences de la co-libération de deux petits neurotransmetteurs à action rapide se sont accumulées récemment. Des enregistrements électrophysiologiques ont aussi montré que des neurones sérotoninergiques et dopaminergiques isolés peuvent libérer du glutamate quand ils sont placés en culture. De plus, la présence de glutamate et de glutaminase a été détectée dans des neurones sérotoninergiques, dopaminergiques et noradrénergiques par immunomarquage sur des tranches de cerveau. Malheureusement, en considérant le rôle métabolique du glutamate, sa détection immunologique n’est pas suffisante pour assurer le phénotype glutamatergique d’un neurone. Récemment, la découverte de trois transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUT1-3) a grandement facilité l’identification des neurones glutamatergiques. Ces transporteurs sont nécessaires pour la libération de glutamate et constituent les premiers marqueurs morphologiques du phénotype glutamatergique. Il a été démontré que des neurones noradrénergiques expriment VGLUT2 et que des neurones sérotoninergiques expriment VGLUT3. Mais aucune évidence d’expression d’un des sous-types de VGLUT n’a été reportée pour les neurones dopaminergiques. Le but de notre travail était d’identifier quel sous-type de VGLUT est exprimé par les neurones dopaminergiques mésencéphaliques, et de déterminer si le phénotype glutamatergique de ces neurones peut être modulé dans des conditions particulières. Premièrement, nous avons utilisé des microcultures pour isoler les neurones dopaminergiques et des doubles marquages immunocytochimiques pour observer l’expression de VGLUT dans les neurones positifs pour la tyrosine hydroxylase (TH). Nous avons montré que la majorité (80%) des neurones TH+ isolés exprime spécifiquement VGLUT2. Cette expression est précoce au cours du développement in vitro et limitée aux projections axonales des neurones dopaminergiques. Toutefois, cette forte expression in vitro contraste avec la non-détection de ce transporteur dans les rats adultes in vivo. Nous avons décidé ensuite de regarder si l’expression de VGLUT2 pouvait être régulée pendant le développement cérébral de jeunes rats et sous des conditions traumatiques, par double hybridation in situ. Entre 14 et 16 jours embryonnaires, les marquages de VGLUT2 et de TH montraient une superposition significative qui n’était pas retrouvée à des stades ultérieurs. Dans le mésencéphale de jeunes rats postnataux, nous avons détecté l’ARNm de VGLUT2 dans environs 1-2% des neurones exprimant l’ARNm de TH dans la substance noire et l’aire tegmentaire ventrale (ATV). Pour explorer la régulation de l’expression de VGLUT2 dans des conditions traumatiques, nous avons utilisé la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) pour léser les neurones dopaminergiques dans les jeunes rats. Dix jours après la chirurgie, nous avons trouvé que 27% des neurones dopaminergiques survivants dans l’ATV exprimaient l’ARNm de VGLUT2 dans les rats 6-OHDA. Finalement, nous avons observé la colocalisation de la protéine VGLUT2 dans les terminaisons TH positives par microscopie électronique. Dans les rats normaux, la protéine VGLUT2 est retrouvée dans 28% des terminaisons axonales TH dans le noyau accumbens. Dans les rats lésés à la 6-OHDA, nous avons observé une diminution considérable des terminaisons TH positives, et une augmentation dans la proportion (37%) des terminaisons dopaminergiques présentant du VGLUT2. Nos résultats suggèrent que le phénotype glutamatergique des neurones dopaminergiques est régulé au cours du développement, peut être réactivé dans des états pathologiques, et que ces neurones peuvent libérer du glutamate dans conditions spécifiques.

Régulation de l'activité transcriptionnelle de PPARgamma via l'activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a : potentiel anti-athérosclérotique

Les sécrétines peptidiques de l’hormone de croissance (GHRPs) constituent une classe de peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance (GH). Cette activité est médiée par leur liaison à un récepteur couplé aux protéines G : le récepteur des sécrétines de l’hormone de croissance (GHS-R1a), identifié subséquemment comme le récepteur de la ghréline. La ghréline est un peptide de 28 acides aminés sécrété principalement par les cellules de la muqueuse de l’estomac, qui exerce de nombreux effets périphériques indépendamment de la sécrétion de l’hormone de croissance. Les effets indépendants de la sécrétion de GH incluent, entre autres, des actions sur le contrôle de la prise de nourriture, le métabolisme énergétique, la fonction cardiaque, le système immunitaire et la prolifération cellulaire. L’étude de la distribution périphérique des sites de liaison des GHRPs nous a permis d’identifier un second site, le CD36, un récepteur scavenger exprimé dans plusieurs tissus dont le myocarde, l’endothélium de la microvasculature et les monocytes/macrophages. Le CD36 exprimé à la surface du macrophage joue un rôle clé dans l’initiation du développement de l’athérosclérose par la liaison et l’internalisation des lipoprotéines de faible densité oxydées (LDLox) dans l’espace sous-endothélial de l’artère. L’hexaréline, un analogue GHRP, a été développé comme agent thérapeutique pour stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance par l’hypophyse. Sa propriété de liaison aux récepteurs GHS-R1a et CD36 situés en périphérie et particulièrement sa capacité d’interférer avec la liaison des LDLox par le CD36 nous ont incité à évaluer la capacité de l’hexaréline à moduler le métabolisme lipidique du macrophage. L’objectif principal de ce projet a été de déterminer les effets de l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a, par l’hexaréline et la ghréline, le ligand endogène du GHS-R1a, sur la physiologie du macrophage et de déterminer son potentiel anti-athérosclérotique. Les résultats montrent premièrement que l’hexaréline et la ghréline augmentent l’expression des transporteurs ABCA1 et ABCG1, impliqués dans le transport inverse du cholestérol, via un mécanisme contrôlé par le récepteur nucléaire PPARγ. La régulation de l’activité transcriptionnelle de PPARγ par l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a se fait indépendamment de la présence du domaine de liaison du ligand (LBD) de PPARγ et est conséquente de changements dans l’état de phosphorylation de PPARγ. Une étude plus approfondie de la signalisation résultant de la liaison de la ghréline sur le GHS-R1a révèle que PPARγ est activé par un mécanisme de concertation entre les voies de signalisation Gαq/PI3-K/Akt et Fyn/Dok-1/ERK au niveau du macrophage. Le rôle de PPARγ dans la régulation du métabolisme lipidique par l’hexaréline a été démontré par l’utilisation de macrophages de souris hétérozygotes pour le gène de Ppar gamma, qui présentent une forte diminution de l’activation des gènes de la cascade métabolique PPARγ-LXRα-transporteurs ABC en réponse à l’hexaréline. L’injection quotidienne d’hexaréline à un modèle de souris prédisposées au développement de l’athérosclérose, les souris déficientes en apoE sous une diète riche en cholestérol et en lipides, se traduit également en une diminution significative de la présence de lésions athérosclérotiques correspondant à une augmentation de l’expression des gènes cibles de PPARγ et LXRα dans les macrophages péritonéaux provenant des animaux traités à l’hexaréline. L’ensemble des résultats obtenus dans cette thèse identifie certains nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de PPARγ et du métabolisme du cholestérol dans le macrophage via les récepteurs CD36 et GHS-R1a. Ils pourraient servir de cibles thérapeutiques dans une perspective de traitement des maladies cardiovasculaires.

Regulation of HMG-CoA reductase, HSL and ACAT expression and activity in testicular cholesterol metabolism in mink and in mouse following experimental genetic deletion

Introduction: L'homéostasie du cholestérol est indispensable à la synthèse de la testostérone dans le tissu interstitiel et la production de gamètes mâles fertiles dans les tubules séminifères. Les facteurs enzymatiques contribuent au maintien de cet équilibre intracellulaire du cholestérol. L'absence d'un ou de plusieurs enzymes telles que la HMG-CoA réductase, la HSL et l'ACAT-1 a été associée à l'infertilité masculine. Toutefois, les facteurs enzymatiques qui contribuent au maintien de l'équilibre intra-tissulaire du cholestérol n'ont pas été étudiés. Cette étude a pour but de tester l'hypothèse que le maintien des taux de cholestérol compatibles avec la spermatogenèse nécessite une coordination de la fonction intracellulaire des enzymes HMG-CoA réductase, ACAT1 et ACAT2 et la HSL. Méthodes: Nous avons analysé l'expression de l’ARNm et de la protéine de ces enzymes dans les fractions enrichies en tubules séminifères (STf) de vison durant le développement postnatal et le cycle reproductif annuel et dans les fractions enrichies en tissu interstitiel (ITf) et de STf durant le développement postnatal chez la souris. Nous avons développé deux nouvelles techniques pour la mesure de l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de celle de l'ACAT1 et ACAT2. En outre, l'immunohistochimie a été utilisée pour localiser les enzymes dans le testicule. Enfin, les souris génétiquement déficientes en HSL, en SR-BI et en CD36 ont été utilisées pour élucider la contribution de la HMG-CoA réductase, l'ACAT1 et l'ACAT2 et la HSL à l'homéostasie du cholestérol. Résultats: 1) HMG-CoA réductase: (Vison) La variation du taux d’expression de l’ARNm de la HMG-CoA réductase était corrélée à celle de l'isoforme de 90 kDa de la protéine HMG-CoA réductase durant le développement postnatal et chez l'adulte durant le cycle reproductif saisonnier. L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase augmentait de façon concomitante avec le taux protéinique pour atteindre son niveau le plus élevé à 240 jours (3.6411e-7 mol/min/μg de protéines) au cours du développement et en Février (1.2132e-6 mol/min/μg de protéines) durant le cycle reproductif chez l’adulte. (Souris), Les niveaux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase étaient maximales à 42 jours. A l'opposé, le taux protéinique diminuait au cours du développement. 2) HSL: (Vison), l'expression de la protéine de 90 kDa de la HSL était élevée à 180- et 240 jours après la naissance, ainsi qu'en Janvier durant le cycle saisonnier chez l'adulte. L'activité enzymatique de la HSL augmentait durant le développement pour atteindre un pic à 270 jours (36,45 nM/min/μg). Chez l'adulte, l'activité enzymatique de la HSL était maximale en Février. (Souris) Le niveau d’expression de l'ARNm de la HSL augmentait significativement à 21-, 28- et 35 jours après la naissance concomitamment avec le taux d'expression protéinique. L'activité enzymatique de la HSL était maximale à 42 jours suivie d'une baisse significative chez l'adulte. 3) ACAT-1 et ACAT-2: Le présent rapport est le premier à identifier l’expression de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 dans les STf de visons et de souris. (Vison) L'activité enzymatique de l'ACAT-2 était maximale à la complétion du développement à 270 jour (1190.00 CPMB/200 μg de protéines) et en janvier (2643 CPMB/200 μg de protéines) chez l'adulte. En revanche, l'activité enzymatique de l'ACAT-1 piquait à 90 jours et en août respectivement durant le développement et chez l'adulte. (Souris) Les niveaux d'expression de l'ARNm et la protéine de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement. Le taux de l'ARNm de l'ACAT-2, à l’opposé du taux protéinique, augmentait au cours du développement. L'activité enzymatique de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement tandis que celle de l'ACAT-2 augmentait pour atteindre son niveau maximal à 42 jours. 4) Souris HSL-/ -: Le taux d’expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase diminuaient significativement dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+. Par contre, les taux de l'ARNm et les niveaux des activités enzymatiques de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 étaient significativement plus élevés dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+ 5) Souris SR-BI-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-1 étaient plus basses dans les STf de souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. A l'opposé, le taux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HSL étaient augmentées chez les souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. 6) Souris CD36-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-2 étaient significativement plus faibles tandis que celles de la HSL et de l'ACAT-1 étaient inchangées dans les STf de souris CD36-/- comparées aux souris CD36+/+. Conclusion: Nos résultats suggèrent que: 1) L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de la HSL sont associées à l'activité spermatogénétique et que ces activités ne seraient pas régulées au niveau transcriptionnel. 2) L'ACAT-1 et de l'ACAT-2 sont exprimées dans des cellules différentes au sein des tubules séminifères, suggérant des fonctions distinctes pour ces deux isoformes: l'estérification du cholestérol libre dans les cellules germinales pour l'ACAT-1 et l'efflux du cholestérol en excès dans les cellules de Sertoli au cours de la spermatogenèse pour l'ACAT-2. 3) La suppression génétique de la HSL diminuait la HMG-CoA réductase et augmentait les deux isoformes de l'ACAT, suggérant que ces enzymes jouent un rôle critique dans le métabolisme du cholestérol intratubulaire. 4) La suppression génétique des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI et CD36 affecte l'expression (ARNm et protéine) et l'activité des enzymes HMG-CoA réductase, HSL, ACAT-1 et ACAT-2, suggérant l'existence d’un effet compensatoire entre facteurs enzymatiques et non-enzymatiques du métabolisme du cholestérol dans les fractions tubulaires. Ensemble, les résultats de notre étude suggèrent que les enzymes impliquées dans la régulation du cholestérol intratubulaire agissent de concert avec les transporteurs sélectifs de cholestérol dans le but de maintenir l'homéostasie du cholestérol intra-tissulaire du testicule.

Identification des réseaux transcriptionnnels de résistance aux antifongiques chez Candida albicans

Plusieurs souches cliniques de Candida albicans résistantes aux médicaments antifongiques azolés surexpriment des gènes encodant des effecteurs de la résistance appartenant à deux classes fonctionnelles : i) des transporteurs expulsant les azoles, CDR1, CDR2 et MDR1 et ii) la cible des azoles 14-lanostérol déméthylase encodée par ERG11. La surexpression de ces gènes est due à la sélection de mutations activatrices dans des facteurs de transcription à doigts de zinc de la famille zinc cluster (Zn2Cys6) qui contrôlent leur expression : Tac1p (Transcriptional activator of CDR genes 1) contrôlant l’expression de CDR1 et CDR2, Mrr1p (Multidrug resistance regulator 1), régulant celle de MDR1 et Upc2p (Uptake control 2), contrôlant celle d’ERG11. Un autre effecteur de la résistance clinique aux azoles est PDR16, encodant une transférase de phospholipides, dont la surexpression accompagne souvent celle de CDR1 et CDR2, suggérant que les trois gènes appartiennent au même régulon, potentiellement celui de Tac1p. De plus, la régulation transcriptionnelle du gène MDR1 ne dépend pas seulement de Mrr1p, mais aussi du facteur de transcription de la famille basic-leucine zipper Cap1p (Candida activator protein 1), un régulateur majeur de la réponse au stress oxydatif chez C. albicans qui, lorsque muté, induit une surexpression constitutive de MDR1 conférant la résistance aux azoles. Ces observations suggèrent qu’un réseau de régulation transcriptionnelle complexe contrôle le processus de résistance aux antifongiques azolés chez C. albicans. L’objectif de mon projet au doctorat était d’identifier les cibles transcriptionnelles directes des facteurs de transcription Tac1p, Upc2p et Cap1p, en me servant d’approches génétiques et de génomique fonctionnelle, afin de i) caractériser leur réseau transcriptionnel et les modules transcriptionnels qui sont sous leur contrôle direct, et ii) d’inférer leurs fonctions biologiques et ainsi mieux comprendre leur rôle dans la résistance aux azoles. Dans un premier volet, j’ai démontré, par des expériences de génétique, que Tac1p contrôle non seulement la surexpression de CDR1 et CDR2 mais aussi celle de PDR16. Mes résultats ont identifié une nouvelle mutation activatrice de Tac1p (N972D) et ont révélé la participation d’un autre régulateur dans le contrôle transcriptionnel de CDR1 et PDR16 dont l’identité est encore inconnue. Une combinaison d’expériences de transcriptomique et d’immunoprécipitation de la chromatine couplée à l’hybridation sur des biopuces à ADN (ChIP-chip) m’a permis d’identifier plusieurs gènes dont l’expression est contrôlée in vivo et directement par Tac1p (PDR16, CDR1, CDR2, ERG2, autres), Upc2p (ERG11, ERG2, MDR1, CDR1, autres) et Cap1p (MDR1, GCY1, GLR1, autres). Ces expériences ont révélé qu’Upc2p ne contrôle pas seulement l’expression d’ERG11, mais aussi celle de MDR1 et CDR1. Plusieurs nouvelles propriétés fonctionnelles de ces régulateurs ont été caractérisées, notamment la liaison in vivo de Tac1p aux promoteurs de ses cibles de façon constitutive et indépendamment de son état d’activation, et la liaison de Cap1p non seulement à la région du promoteur de ses cibles, mais aussi celle couvrant le cadre de lecture ouvert et le terminateur transcriptionnel putatif, suggérant une interaction physique avec la machinerie de la transcription. La caractérisation du réseau transcriptionnel a révélé une interaction fonctionnnelle entre ces différents facteurs, notamment Cap1p et Mrr1p, et a permis d’inférer des fonctions biologiques potentielles pour Tac1p (trafic et la mobilisation des lipides, réponse au stress oxydatif et osmotique) et confirmer ou proposer d’autres fonctions pour Upc2p (métabolisme des stérols) et Cap1p (réponse au stress oxydatif, métabolisme des sources d’azote, transport des phospholipides). Mes études suggèrent que la résistance aux antifongiques azolés chez C. albicans est intimement liée au métabolisme des lipides membranaires et à la réponse au stress oxydatif.

La régulation de l’hepcidine à travers les récepteurs Toll-like dans les macrophages

L'interaction entre le système immunitaire et le métabolisme du fer est bien illustrée par l'anémie des maladies chroniques (ACD), qui est fréquemment rencontrée dans les infections chroniques, l'inflammation et le cancer. La majorité des modifications dans les paramètres du fer observées dans l’ACD tient compte des modifications de l’homéostasie du fer, avec la délocalisation du métal de la circulation et les sites de l'érythropoïèse au compartiment de stockage dans les macrophages. Les mécanismes de la réponse hyposidérémique impliquent des cytokines, notamment TNF-alpha et IL-6, qui régulent les niveaux de plusieurs gènes du métabolisme du fer, y compris les transporteurs de fer et de l'hepcidine, un régulateur négatif de l’absorption du fer, ce qui entraîne l'inhibition de l'exportation du fer à travers la ferroportine 1 (FPN1) au niveau de l'intestin et les macrophages. Des études antérieures ont montré que l'IL-6 induit l’expression d’hepcidine dans les hépatocytes, mais il y a très peu de données concernant la façon par laquelle l'hepcidine et la FPN1 sont régulées dans les macrophages. Récemment, nous avons constaté que l'induction de l'hepcidine dans le foie par le lipopolysaccharide (LPS) dépend de la voie de signalisation médiée par le récepteur Toll-like 4 (TLR4). Le but de ce travail est d’identifier les ligands des TLRs capables d'induire l'hepcidine dans les macrophages et de déterminer l’exigence des TLRs dans l’induction de l’hepcidine et le développement d’hyposidérémie. En plus, nous voulons étudier l’effet de l’inflammation causée par les ligands des TLRs sur le taux de fer sérique, la production des cytokines et l'expression de l’hepcidine et de la ferroportine. D’autre part nous voulons étudier l’effet du taux du fer sur la production d’IL-6 macrophagique en réponse à la stimulation par le TLR4. D'abord, pour identifier les ligands des TLRs capables d'induire l'hepcidine dans les macrophages, nous avons traité les macrophages RAW 264.7 et les macrophages péritonéaux de souris (MPMs) avec différents ligands TLRs et on a mesuré l’expression de l'hepcidine par qRT-PCR. Nous avons observé que Pam3CSK4 (Pam), un ligand de TLR2/1; LPS, un ligand de TLR-4 et FSL1 un ligand de TLR2/6 induisent l’expression de l'hepcidine dans les cellules RAW 264.7 et les MPMs, contrairement au polyinosinic: polycytidylic acid (Poly I: C), un ligand de TLR3. De plus, LPS était capable de réprimer l’expression de la ferroportine dans les cellules RAW 264.7. Afin de mieux définir la nécessité des TLRs pour assurer cette expression, nous avons utilisé les souris TLR-2 knock-out et on a établi que l'expression de l'hepcidine dans les macrophages par LPS, Pam ou FSL1 est dépendante du TLR2. En accord avec les expériences in vitro, les études effectuées in vivo ont montré que LPS réprime l’expression de la ferroportine, ainsi que PolyI:C n’est pas capable de stimuler l'expression d'hepcidine hépatique, par contre il était efficace pour déclencher une hyposidérémie. Ensuite, on voulait déterminer la voie de signalisation utilisée dans l’induction de l’hepcidine dans les macrophages. Comme il y deux voies majeures connues pour la signalisation des TLRs : une dépendante et l’autre indépendante de la protéine MyD88, on a étudié l’expression de l’hepcidine dans les MPMs isolés des souris MyD88-/- et nous avons constaté que l'absence de signalisation MyD88 abolit l'induction de l'hepcidine déclenchée par Pam, LPS et FSL1. D’autre part, la stimulation avec du LPS induisait in vivo la production d’IL-6 et de TNF-alpha, et la stimulation d’IL-6 était renforcée in vitro par la présence du fer. Ces observations indiquent que l’expression de HAMP (Hepcidin Antimicrobial Peptide) dans les macrophages peut être régulée par différents TLRs, ce qui suggère que la production d'hepcidine macrophagique fait partie d'une réponse immunitaire activées par les TLRs.

Pathogenèse moléculaire de la neuropathie sensitive et motrice héréditaire avec agénésie du corps calleux

La neuropathie sensitive et motrice héréditaire avec agénésie du corps calleux (NSMH/ACC) se traduit par une atteinte neurodégénérative sévère associée à des anomalies développementales dans le système nerveux central et du retard mental. Bien que rare dans le monde, ce désordre autosomique récessif est particulièrement fréquent dans la population Québécoise du Canada Français du fait d’un effet fondateur. L’unique étude réalisée sur la mutation québécoise du gène qui code pour le co-transporteur de potassiumchlore 3 (KCC3) a montré qu’il y a une perte de fonction de la protéine. Cependant, la maladie est également retrouvée hors du Québec et il reste encore à élucider les pathomécanismes mis en jeu. Nous avons donc séquencé les 26 exons du gène KCC3 chez des individus recrutés dans le monde entier et suspectés d’être atteints de la maladie. Nous avons ainsi identifié trois nouvelles mutations. L’étude fonctionnelle de ces mutations nous a confirmé la perte de fonction systématique des co-transporteurs mutés. Puisque l’inactivation de KCC3 se produit majoritairement via l’élimination de segments peptidiques en C-terminus, nous avons concentré notre attention sur l’identification des interactions qui s’y produisent. À l’aide d’approches double hybride, pull-down et immunomarquage, nous avons déterminé que KCC3 interagit avec la créatine kinase CK-B et que cette interaction est perturbée par les mutations tronquantes. De plus, l’utilisation d’un inhibiteur de créatine kinase inactive KCC3, ce qui démontre qu’il existe bien un lien fonctionnel et pathologique entre KCC3 et ses partenaires C-terminaux. Nous avons aussi identifié des anomalies majeures de localisation membranaire des KCC3 mutés. Que KCC3 soit tronqué ou pleine longueur, sa distribution subcellulaire est affectée dans des cellules en culture, dans les ovocytes de Xenopes et dans des échantillons de cerveau de patients. La perte d’interaction entre KCC3 et CK-B et/ou les défauts de transit intracellulaire de KCC3 sont donc les mécanismes pathologiques majeurs de la NSMH/ACC.

Effets de plantes réputées antidiabétiques sur un modèle cellulaire hépatique de résistance à l’insuline induite par le palmitate

La pharmacopée Cris est riche en plantes médicinales et plusieurs d’entre elles sont étudiées par notre laboratoire pour leur potentiel antidiabétique. Certaines espèces ont démontré leur capacité à stimuler la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme qui favorise la translocation de transporteurs de glucose à la membrane (effet hypoglycémiant). L’AMPK stimule également d’autres fonctions, telle l’oxydation des graisses, dans le but de rétablir l’énergie cellulaire. Ce projet a comme objectifs d’évaluer, premièrement, le stress métabolique induit par huit des extraits dans des cellules musculaires et des hépatocytes, effet qui serait responsable de l’activation de l’AMPK. Ce stress peut être déterminé en mesurant l’acidification du milieu extracellulaire ainsi que la déplétion du contenu en ATP des cellules suite aux traitements. Le deuxième objectif est de mesurer l’efficacité des extraits à réduire le contenu en gras (oxydation des graisses) et à ainsi normaliser la résistance à l’insuline dans des hépatocytes rendus insulino-résistants. Les hépatocytes sont rendus résistants à l’insuline (condition fortement lié à l’obésité) via traitement avec un acide gras saturé, le palmitate. Les résultats montrent que la majorité des extraits semble induire un stress métabolique de courte durée dans les cellules. Parmi les extraits, seul un a réussi à faire diminuer significativement le taux de triglycérides intracellulaire suite au traitement au palmitate sans toutefois améliorer la sensibilité à l’insuline. En conclusion, le potentiel hypoglycémiant des extraits serait du à leur capacité à affecter la respiration mitochondriale (stress métabolique). Toutefois, leur capacité à améliorer la sensibilité à l’insuline n’a pu être établie.

Investigating the role of potential genetic markers that can predict risk for steroid refractory inflammatory bowel disease

Contexte - La variation interindividuelle de la réponse aux corticostéroïdes (CS) est un problème important chez les patients atteints de maladies inflammatoires d’intestin. Ce problème est bien plus accentué chez les enfants avec la prévalence de la corticodépendance extrêmement (~40 %) élevée. La maladie réfractaire au CS a des répercussions sur le développement et le bien-être physique et psychologique des patients et impose des coûts médicaux élevés, particulièrement avec la maladie active comparativement à la maladie en rémission, le coût étant 2-3 fois plus élevé en ambulatoire et 20 fois plus élevé en hôpital. Il est ainsi primordial de déterminer les marqueurs prédictifs de la réponse aux CS. Les efforts précédents de découvrir les marqueurs cliniques et démographiques ont été équivoques, ce qui souligne davantage le besoin de marqueurs moléculaires. L'action des CS se base sur des processus complexes déterminés génétiquement. Deux gènes, le ABCB1, appartenant à la famille des transporteurs transmembraneaux, et le NR3C1, encodant le récepteur glucocorticoïde, sont des éléments importants des voies métaboliques. Nous avons postulé que les variations dans ces gènes ont un rôle dans la variabilité observée de la réponse aux CS et pourraient servir en tant que les marqueurs prédictifs. Objectifs - Nous avons visé à: (1) examiner le fardeau de la maladie réfractaire aux CS chez les enfants avec la maladie de Crohn (MC) et le rôle des caractéristiques cliniques et démographiques potentiellement liés à la réponse; (2) étudier l'association entre les variantes d'ADN de gène ABCB1 et la réponse aux CS; (3) étudier les associations entre les variantes d'ADN de gène NR3C1 et la réponse aux CS. Méthodes - Afin d’atteindre ces objectifs, nous avons mené une étude de cohorte des patients recrutés dans deux cliniques pédiatriques tertiaires de gastroentérologie à l’Ottawa (CHEO) et à Montréal (HSJ). Les patients avec la MC ont été diagnostiqués avant l'âge de 18 ans selon les critères standard radiologiques, endoscopiques et histopathologiques. La corticorésistance et la corticodépendance ont été définies en adaptant les critères reconnus. L’ADN, acquise soit du sang ou de la salive, était génotypée pour des variations à travers de gènes ABCB1 et NR3C1 sélectionnées à l’aide de la méthodologie de tag-SNP. La fréquence de la corticorésistance et la corticodépendance a été estimée assumant une distribution binomiale. Les associations entre les variables cliniques/démographiques et la réponse aux CS ont été examinées en utilisant la régression logistique en ajustant pour des variables potentielles de confusion. Les associations entre variantes génétiques de ABCB1 et NR3C1 et la réponse aux CS ont été examinées en utilisant la régression logistique assumant différents modèles de la transmission. Les associations multimarqueurs ont été examinées en utilisant l'analyse de haplotypes. Les variantes nongénotypées ont été imputées en utilisant les données de HAPMAP et les associations avec SNPs imputés ont été examinées en utilisant des méthodes standard. Résultats - Parmi 645 patients avec la MC, 364 (56.2%) ont reçu CS. La majorité de patients étaient des hommes (54.9 %); présentaient la maladie de l’iléocôlon (51.7%) ou la maladie inflammatoire (84.6%) au diagnostic et étaient les Caucasiens (95.6 %). Huit pourcents de patients étaient corticorésistants et 40.9% - corticodépendants. Le plus bas âge au diagnostic (OR=1.34, 95% CI: 1.03-3.01, p=0.040), la maladie cœxistante de la région digestive supérieure (OR=1.35, 95% CI: 95% CI: 1.06-3.07, p=0.031) et l’usage simultané des immunomodulateurs (OR=0.35, 95% CI: 0.16-0.75, p=0.007) ont été associés avec la corticodépendance. Un total de 27 marqueurs génotypés à travers de ABCB1 (n=14) et NR3C1 (n=13) ont été en l'Équilibre de Hardy-Weinberg, à l’exception d’un dans le gène NR3C1 (rs258751, exclu). Dans ABCB1, l'allèle rare de rs2032583 (OR=0.56, 95% CI: 0.34-0.95, p=0.029) et génotype hétérozygote (OR=0.52, 95% CI: 0.28-0.95 p=0.035) ont été négativement associes avec la dépendance de CS. Un haplotype à 3 marqueurs, comprenant le SNP fonctionnel rs1045642 a été associé avec la dépendance de CS (p empirique=0.004). 24 SNPs imputés introniques et six haplotypes ont été significativement associés avec la dépendance de CS. Aucune de ces associations n'a cependant maintenu la signification après des corrections pour des comparaisons multiples. Dans NR3C1, trois SNPs: rs10482682 (OR=1.43, 95% CI: 0.99-2.08, p=0.047), rs6196 (OR=0.55, 95% CI: 0.31-0.95, p=0.024), et rs2963155 (OR=0.64, 95% CI: 0.42-0.98, p=0.039), ont été associés sous un modèle additif, tandis que rs4912911 (OR=0.37, 95% CI: 0.13-1.00, p=0.03) et rs2963156 (OR=0.32, 95% CI: 0.07-1.12, p=0.047) - sous un modèle récessif. Deux haplotypes incluant ces 5 SNPs (AAACA et GGGCG) ont été significativement (p=0.006 et 0.01 empiriques) associés avec la corticodépendance. 19 SNPs imputés ont été associés avec la dépendance de CS. Deux haplotypes multimarqueurs (p=0.001), incluant les SNPs génotypés et imputés, ont été associés avec la dépendance de CS. Conclusion - Nos études suggèrent que le fardeau de la corticodépendance est élevé parmi les enfants avec le CD. Les enfants plus jeunes au diagnostic et ceux avec la maladie coexistante de la région supérieure ainsi que ceux avec des variations dans les gènes ABCB1 et NR3C1 étaient plus susceptibles de devenir corticodépendants.