Influence of fetal tissue transplant on the morphology of the neuromuscular junctions of tibialis anterior and medial gastrocnemius following spinal transection in the rat

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le rôle des cellules gliales de Müller dans la mort des cellules ganglionnaires de la rétine par des mécanismes cellulaires non-autonomes

Les cellules gliales sont essentielles au fonctionnement du système nerveux. Dans la rétine, les cellules gliales de Müller assurent à la fois l’homéostasie du tissu et la protection des neurones, notamment celle des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs). L’hypothèse principale de la thèse est que les cellules de Müller joueraient un rôle primordial dans la survie neuronale tant au plan de la signalisation des neurotrophines/proneurotrophines par suite d’une blessure que lors des mécanismes d’excitotoxicité. Contrairement au brain-derived neurotrophic factor (BDNF), le nerve growth factor (NGF) n’est pas en mesure d’induire la survie des CGRs après une section du nerf optique. Le premier objectif de la thèse a donc été de localiser les récepteurs p75NTR et TrkA du NGF dans la rétine adulte et d’établir leur fonction respective en utilisant des ligands peptidomimétiques agonistes ou antagonistes spécifiques pour chacun des récepteurs. Nos résultats ont démontré que TrkA est surexprimé par les CGRs après l’axotomie, tandis que p75NTR est spécifiquement exprimé par les cellules de Müller. Alors que NGF n’est pas en mesure d’induire la survie des CGRs, l’activation spécifique de TrkA par des ligands peptidomimétique est nettement neuroprotectrice. De façon surprenante, le blocage sélectif de p75NTR ou l’absence de celui-ci protège les CGRs de la mort induite par l’axotomie. De plus, la combinaison de NGF avec l’antagoniste de p75NTR agit de façon synergique sur la survie des CGRS. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel le récepteur p75NTR exprimé par les cellules gliales de Müller peut grandement influencer la survie neuronale. Ensuite, nous avons voulu déterminer l’effet des proneurotrophines dans la rétine adulte. Nous avons démontré que l’injection de proNGF induit la mort des CGRs chez le rat et la souris par un mécanisme dépendant de p75NTR. L’expression de p75NTR étant exclusive aux cellules de Müller, nous avons testé l’hypothèse que le proNGF active une signalisation cellulaire non-autonome qui aboutit à la mort des CGRs. En suivant cette idée, nous avons montré que le proNGF induit une forte expression du tumor necrosis factor α (TNFα) dans les cellules de Müller et que l’inhibition du TNF bloque la mort neuronale induite par le proNGF. L’utilisation de souris knock-out pour la protéine p75NTR, son co-récepteur sortiline, ou la protéine adaptatrice NRAGE a permis de montrer que la production de TNF par les cellules gliales était dépendante de ces protéines. Le proNGF semble activer une signalisation cellulaire non-autonome qui cause la mort des neurones de façon dépendante du TNF in vivo. L’hypothèse centrale de l’excitotoxicité est que la stimulation excessive des récepteurs du glutamate sensibles au N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) est dommageable pour les neurones et contribue à plusieurs maladies neurodégénératives. Les cellules gliales sont soupçonnées de contribuer à la mort neuronale par excitotoxicité, mais leur rôle précis est encore méconnu. Le dernier objectif de ma thèse était d’établir le rôle des cellules de Müller dans cette mort neuronale. Nos résultats ont démontré que l’injection de NMDA induit une activation du nuclear factor κB (NF-κB) dans les cellules de Müller, mais pas dans les CGRs, et que l’utilisation d’inhibiteurs du NF-κB empêche la mort des CGRs. De plus, nous avons montré que les cellules de Müller en réaction à l’activation du NF-κB produisent la protéine TNFα laquelle semble être directement impliquée dans la mort des CGRs par excitotoxicité. Cette mort cellulaire se produit principalement par l’augmentation à la surface des neurones des récepteurs AMPA perméables au Ca2+, un phénomène dépendant du TNFα. Ces donnés révèlent un nouveau mécanisme cellululaire non-autonome par lequel les cellules gliales peuvent exacerber la mort neuronale lors de la mise en jeu de mécanismes excitotoxiques.

Caractérisation d'un modèle animal de douleur articulaire associée à l'arthrose du genou chez le rat Sprague-Dawley

La douleur articulaire associée à l’arthrose est un problème clinique majeur, spécialement chez les personnes âgées. L’intensité de la douleur est souvent amplifiée lors de mouvement de l’articulation et principalement lors du soutien de la charge corporelle sur le membre lésé. Malheureusement, les traitements pharmacologiques proposés sont trop souvent associés à des effets secondaires néfastes et à une inefficacité pour le soulagement de la douleur à long terme. Divers modèles murins sont utilisés en laboratoire de recherche pour des études précliniques de molécules aux propriétés analgésiques. Une évaluation comparative de la réponse comportementale douloureuse des animaux d’un modèle d’instabilité articulaire induit par le sectionnement du ligament croisé antérieur accompagné d’une méniscectomie partielle (le modèle ACLT+pMMx) et d’un modèle de dégénérescence articulaire induite par le monoiodoacetate (le modèle MIA) a permis de sélectionner un modèle approprié pour la continuité du projet. Les deux modèles ont démontré des lésions tissulaires, mais le modèle MIA a démontré une réponse douloureuse plus prononcée que le modèle ACLT+pMMx. Par l’analyse de la démarche, le modèle MIA a démontré une boiterie claire dans le patron de la démarche des animaux qui est associée à une lésion unilatérale. Le modèle MIA a donc été choisi pour la suite du projet. La problématique principale dans la recherche sur la douleur associée à l’arthrose est une compréhension incomplète des mécanismes de douleur responsables de l’induction et du maintien de l’état de douleur. Il devient donc nécessaire d’améliorer nos connaissances de ces mécanismes en effectuant une caractérisation plus approfondie des modèles animaux employés pour l’évaluation de stratégies pharmacologiques analgésiantes. Afin de bien comprendre le modèle MIA, une caractérisation des événements moléculaires centraux lors de la progression du processus dégénératif des structures articulaires de ce modèle s’est effectuée aux jours 3, 7, 14, 21 et 28 post injection. Des mécanismes hétérogènes qui modulent l’information nociceptive en fonction de la progression temporelle de la pathologie ont été observés. Les changements du contenu i spinal des neuropeptides sélectionnés (substance P, CGRP, dynorphine A et Big dynorphine) ont débuté sept jours suivant l’injection de MIA. L’observation histologique a démontré que les dommages structuraux les plus importants surviennent entre les jours 14 et 21. C’est entre les jours 7 et 21 que les lésions démontrent le plus de similarités à la pathologie humaine. Cela suggère que lors d’une évaluation préclinique d’un traitement pharmacologique pour pallier la douleur articulaire utilisant le modèle MIA, l’étude doit tenir compte de ces événements afin de maximiser l’évaluation de son efficacité. Puisque les traitements pharmacologiques conventionnels proposés pour le soulagement de la douleur ne font pas l’unanimité en terme d’efficacité, d’effets non désirés et de coûts monétaires parfois onéreux, les molécules de dérivés de plante deviennent une alternative intéressante. L’eugénol, le principal constituant de l’huile de clou de girofle, a été administré oralement pour une période de 28 jours chez des rats ayant reçu l’injection intra-articulaire de MIA afin d’évaluer son efficacité pour le traitement de la douleur articulaire. L’eugénol à une dose de 40 mg/kg s’est révélé efficace pour l’amélioration du patron de la démarche des animaux ainsi que pour la diminution de l’allodynie mécanique secondaire. De plus, les concentrations spinales de neuropeptides pronocicepteurs ont diminué chez les animaux traités. Par une évaluation histopathologique, l’eugénol n’a démontré aucune évidence d’effets toxiques suite à une administration per os quotidienne pour une période prolongée. Ces résultats suggèrent le potentiel thérapeutique complémentaire de la molécule d’eugénol pour le traitement de la douleur articulaire.

Therapeutic potential of endothelin receptor type A and bradykinin receptor B1 dual antagonism in osteoarthritis treatment

Nous avons préalablement démontré que l'endothéline-1 (ET-1), un peptide vasoconstricteur de 21 acides aminés, joue un rôle central dans le métabolisme des tissus articulaires et a des fonctions cataboliques sur le cartilage articulaire dans l'ostéoarthrose, en liant son récepteur de type A (ETA). Suite à la relâche du nonapeptide vasodilatateur bradykinine (BK), et l'augmentation d'expression du récepteur B1 des kinines (BKB1), ces médiateurs engendrent un cycle d'inflammation, une destruction du cartilage, et une douleur articulaire. Lors de cette étude, l'efficacité thérapeutique des antagonistes spécifiques du ETA et/ou BKB1 dans un modèle animal d'ostéoarthrose a été testée. Notre hypothèse est que l'antagonisme va diminuer la progression de la pathologie et de la douleur articulaire. L'ostéoarthrose a été induite chez des rats par rupture chirurgicale du ligament croisé antérieur. Les animaux ont été traités par injections intra articulaire hebdomadaires des antagonistes peptidiques spécifiques du ETA et/ou BKB1. La douleur articulaire a été évaluée par le test d'incapacitance statique durant les deux mois postopératoires ; la morphologie articulaire a été examinée post mortem par radiologie et histologie. On constate que le traitement a diminué la douleur et a préservé la morphologie articulaire ; la double inhibition a été plus efficace que la simple inhibition. En conclusion, l'antagonisme double d'ETA et BKB1 améliore la douleur chronique et prévient la dégradation articulaire dans l'ostéoarthrose, ce qui suggère que ces récepteurs peuvent être des cibles thérapeutiques potentiels pour le traitement de cette pathologie.

Effet d’une supplémentation en vitamine E alimentaire sur l’inflammation et la douleur chez le chien avec arthrose

La vitamine E (VE) est parfois préconisée pour le traitement de l’arthrose chez le chien, par contre aucune étude n’a documenté cette efficacité. L’objectif de cette étude était de déterminer l’effet d’une forte dose de VE alimentaire sur l’inflammation et la douleur arthrosique chez le chien. Deux groupes de chiens avec arthrose provoquée par section du ligament croisé crânial du membre postérieur droit ; un groupe contrôle (n=8) et un groupe supplémenté avec la VE (n=7), ont été suivis selon un design parallèle, randomisé et en aveugle. La supplémentation a été commencée 1 jour après la chirurgie avec une dose de 400 UI/animal/jour par voie orale pendant 56 jours. Les évaluations objectives (activité électrodermique, EDA) et subjectives (VAS, NRS) de la douleur ont été faites avant la chirurgie J0, à J28 et à J55 après chirurgie. La détermination de la concentration synoviale des marqueurs de l’inflammation (IL-1β, PGE2 et NOx) et l’étude lésionnelle ont été faites après l’euthanasie à J56. Une comparaison unilatérale avec un seuil alpha de 10% a été réalisée. Les concentrations synoviales de PGE2 et de NOx étaient faibles chez le groupe supplémenté en VE par rapport au contrôle (P=0,03 et P<0,0001 respectivement). Les valeurs de VAS, NRS et EDA ont montré une tendance constante à l’amélioration de la douleur dans le groupe traité, avec des résultats significatifs obtenus pour VAS à J55 et pour EDA à J28 (P ajusté = 0,07 dans les deux cas). L’analyse histologique du cartilage articulaire a montré une réduction significative des scores lésionnels dans le groupe traité. C’est la première fois qu’une étude menée chez le chien avec arthrose, a montré qu’une forte dose en VE alimentaire permet de réduire les marqueurs de l’inflammation articulaire, les lésions histologiques cartilagineuses et permet aussi d’améliorer les signes de la douleur associe à l’arthrose.

Cyanocobalamin is a Superoxide Scavenger and Neuroprotectant in Neuronal Cells

Les dommages au nerf optique (neuropathie optique) peuvent entraîner la perte permanente de la vision ou la cécité causée par la mort des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). Nous avons identifié qu’une surproduction de l'anion superoxyde constitue un événement moléculaire critique précédant la mort cellulaire induite par des lésions. Récemment, Suarez-Moreira et al (JACS 131:15078, 2009) ont démontré que la vitamine B12 peut capter l’anion superoxyde aussi efficacement que l’enzyme superoxyde dismutase. La carence en vitamine B12 peut conduire à une neuropathie optique causée par des mécanismes inconnus. Nous avons étudié la relation entre la captation de superoxyde par la cyanocobalamine (forme de vitamine B12 la plus abondante) et ses propriétés neuroprotectrices dans les cellules neuronales. La cyanocobalamine aux concentrations de 10 μM et 100 μM a réduit le taux de production de superoxyde respectivement par 34% et 79% dans les essais sans-cellule. Dans les cellules RGC-5 traités avec la ménadione, les concentrations de cyanocobalamine supérieures à 10 nM ont diminué l’anion superoxyde à des valeurs similaires à celles traitées par PEG-SOD. La cyanocobalamine aux concentrations de 100 μM et 1 μM a réduit la mort des cellules RGC-5 exposées à la ménadione par 20% et 32%, respectivement. Chez les rats avec section du nerf optique unilatérale, une dose intravitréenne de 667 μM de cyanocobalamine a réduit le nombre de CGRs exposées au superoxyde. Cette dose a également augmenté le taux de survie des CGRs comparativement aux rats injectés avec la solution témoin. Ces données suggèrent que la vitamine B12 peut être un neuroprotecteur important, et sa carence nutritionnelle pourrait causer la mort de CGRs. La vitamine B12 pourrait aussi potentiellement être utilisée comme une thérapie pour ralentir la progression de la mort CGR chez les patients avec les neuropathies optiques caractérisés par une surproduction de superoxyde.

La force de réaction au sol verticale maximale comme témoin d'effets fonctionnels et structuraux chez des modèles canins d'arthrose : potentiel envers le développement thérapeutique

Les modèles animaux d’arthrose permettent d’évaluer le potentiel d’agents thérapeutiques en phase préclinique de développement. Le présent ouvrage tient compte du chien comme modèle d’arthrose naturelle (chez l’animal de compagnie) ou expérimentale (par sectionnement chirurgical du ligament croisé crânial). Au sein des expérimentations, la force de réaction au sol verticale maximale, mesurée lors de l’analyse cinétique de la locomotion, est proposée comme témoin d’effets fonctionnels et structuraux sur ces modèles d’arthrose. Sur un modèle canin d’arthrose naturelle, le seuil de changement minimal détectable a été déterminé. Les changements au dysfonctionnement locomoteur peuvent désormais être cernés en s’affranchissant de la marge d’erreur inhérente à la mesure de la force verticale maximale. Il en découle l’identification de répondants lors d’essais cliniques entrepris chez le chien arthrosique. Une analyse rétrospective a, par la suite, déterminé un taux de répondants de 62.8% et d’une taille d’effet de 0.7 pour des approches thérapeutiques actuellement proposées aux chiens arthrosiques. Cette analyse détermina également que la démonstration d’une réponse thérapeutique était favorisée en présence d’un fort dysfonctionnement locomoteur. Sur un modèle canin d’arthrose par sectionnement chirurgical du ligament croisé crânial, la force verticale maximale a démontré une relation inverse avec certains types de lésions arthrosiques évaluées à l’aide d’imagerie par résonance magnétique. Également, la sensibilité de la force verticale maximale a été mise en évidence envers la détection d’effets structuraux, au niveau de l’os sous-chondral, par un agent anti-résorptif (le tiludronate) sur ce même modèle. Les expérimentations en contexte d’arthrose naturelle canine permettent de valider davantage les résultats d’essais cliniques contrôlés utilisant la force verticale maximale comme critère d’efficacité fonctionnelle. Des évidences cliniques probantes nécessaires à la pratique d’une médecine basée sur des faits sont ainsi escomptées. En contexte d’arthrose expérimentale, la pertinence d’enregistrer le dysfonctionnement locomoteur est soulignée, puisque ce dernier est en lien avec l’état des structures. En effectuant l’analyse de la démarche, de pair avec l’évaluation des structures, il est escompté de pouvoir établir la répercussion de bénéfices structurels sur l’inconfort articulaire. Cet ouvrage suggère qu’une plateforme d’investigations précliniques, qui combine le modèle canin d’arthrose par sectionnement chirurgical du ligament croisé crânial à un essai clinique chez le chien arthrosique, soit un moyen de cerner des bénéfices structuraux ayant des impacts fonctionnels. Le potentiel inférentiel de ces modèles canins d’arthrose vers l’Homme serait ainsi favorisé en utilisant la force verticale maximale.

Régulation de l'expression de PPARγ dans l'arthrose

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative très répondue touchant les articulations. Elle est caractérisée par la destruction progressive du cartilage articulaire, l’inflammation de la membrane synoviale et le remodelage de l’os sous chondral. L’étiologie de cette maladie n’est pas encore bien définie. Plusieurs études ont été menées pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l’OA. Les effets protecteurs du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes gamma (PPARγ) dans l'OA sont bien documentés. Il a été démontré que PPARγ possède des propriétés anti-inflammatoires et anti-cataboliques. Aussi, plusieurs stimuli ont été impliqués dans la régulation de l’expression de PPARγ dans différents types cellulaires. Cependant, les mécanismes exacts responsables de cette régulation ainsi que le profil de l’expression de ce récepteur au cours de la progression de l’OA ne sont pas bien connus. Dans la première partie de nos travaux, nous avons essayé d’élucider les mécanismes impliqués dans l’altération de l’expression de PPARγ dans cette maladie. Nos résultats ont confirmé l’implication de l’interleukine-1β (IL-1β), une cytokine pro-inflammatoire, dans la réduction de l’expression de PPARγ au niveau des chondrocytes du cartilage articulaire. Cet effet coïncide avec l'induction de l’expression du facteur de transcription à réponse précoce de type 1 (Egr-1). En plus, la diminution de l'expression de PPARγ a été associée au recrutement d'Egr-1 et la réduction concomitante de la liaison de Sp1 au niveau du promoteur de PPARγ. Dans la deuxième partie de nos travaux, nous avons évalué le profil d’expression de ce récepteur dans le cartilage au cours de la progression de cette maladie. Le cochon d’inde avec OA spontanée et le chien avec OA induite par rupture du ligament croisé antérieur (ACLT) deux modèles animaux d’OA ont été utilisés pour suivre l’expression des trois isoformes de PPARs : PPAR alpha (α), PPAR béta (β) et PPAR gamma (γ) ainsi que la prostaglandine D synthase hématopoïétique (H-PGDS) et la prostaglandine D synthase de type lipocaline (L-PGDS) deux enzymes impliquées dans la production de l’agoniste naturel de PPARγ, la 15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandine J(2) (15d-PGJ2). Nos résultats ont démontré des changements dans l’expression de PPARγ et la L-PGDS. En revanche, l’expression de PPARα, PPARβ et H-PGDS est restée stable au fil du temps. La diminution de l’expression de PPARγ dans le cartilage articulaire semble contribuer au développement de l’OA dans les deux modèles animaux. En effet, le traitement des chondrocytes par de siRNA dirigé contre PPARγ a favorisé la production des médiateurs arthrosiques tels que l'oxyde nitrique (NO) et la métalloprotéase matricielle de type 13 (MMP-13), confirmant ainsi le rôle anti-arthrosique de ce récepteur. Contrairement à ce dernier, le niveau d'expression de la L-PGDS a augmenté au cours de la progression de cette maladie. La surexpression de la L-PGDS au niveau des chondrocytes humains a été associée à la diminution de la production de ces médiateurs arthrosiques, suggérant son implication dans un processus de tentative de réparation. En conclusion, l’ensemble de nos résultats suggèrent que la modulation du niveau d’expression de PPARγ, de la L-PGDS et d’Egr-1 au niveau du cartilage articulaire pourrait constituer une voie thérapeutique potentielle dans le traitement de l’OA et probablement d’autres formes d'arthrite.

L'effet d'une variation du niveau d'activité physique sur les propriétés électrophysiologiques des motoneurones du nerf tibial chez le rat

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.