La PCSK9 humaine, une molécule aux multiples facettes métaboliques et une cible thérapeutique prometteuse : études de régulation in vitro et in vivo

La proprotéine convertase subtilisine/kexine-9 (PCSK9) a été identifiée comme le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie autosome dominante (ADH). Les deux autres gènes impliqués dans l’ADH encodent le récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLR) et l’apolipoprotéine B. La PCSK9 est une convertase qui favorise la dégradation du LDLR dans les hépatocytes et augmente le niveau plasmatique de cholestérol des LDL (LDL-C). Les mutations « gain de fonction » de la PCSK9 sont associées à un phénotype d’hypercholestérolémie familiale, tandis que les variantes « perte de fonction » sont associées à un LDL-C réduit et à un risque coronarien plus faible. Pour élucider le rôle physiologique de la PCSK9, nous avons étudié sa régulation génique. En utilisant le RT-PCR quantitatif dans des hépatocytes humains, nous avons analysé la régulation de PCSK9 sous différentes conditions modulant l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol. Nous avons démontré que l’expression de la PCSK9 était induite par les statines de manière dose-dépendante et que cette induction était abolie par le mévalonate. De plus, le promoteur de PCSK9 contenait deux motifs conservés pour la régulation par le cholestérol : le sterol regulatory element (SRE) et un site Sp1. La PCSK9 circule dans le plasma sous des formes mature et clivée par la furine. Grâce à notre anticorps polyclonal, nous avons mis au point un test ELISA mesurant la PCSK9 plasmatique totale. Une étude transversale a évalué les concentrations plasmatiques de PCSK9 chez des sujets sains et hypercholestérolémiques, traités ou non par des statines ou une combinaison statine/ezetimibe. Chez 254 sujets sains, la valeur moyenne de PCSK9 (écart-type) était de 89,5 (31,9) µg/L. La concentration plasmatique de la PCSK9 corrélait avec celle de cholestérol total, du LDL-C, des triglycérides (TG), de la glycémie à jeun, l’âge et l’indice de masse corporelle. Le séquençage de PCSK9 chez des sujets aux extrêmes de la distribution des concentrations de PCSK9 de notre cohorte a révélé la présence d’une nouvelle variation « perte de fonction » : R434W. Chez 200 patients hypercholestérolémiques, la concentration de PCSK9 était plus élevée que chez les sujets sains (P<0,04). Elle a augmenté avec une dose croissante de statine (P<0,001), et a augmenté encore plus suite à l’ajout d’ezetimibe (P<0,001). Chez les patients traités, ceux présentant une hypercholestérolémie familiale (HF; due à une mutation du LDLR) avaient des concentrations plus élevées de PCSK9 que les non-HF (P<0,005), et la réduction de LDL-C corrélait positivement avec la concentration de PCSK9 atteinte de la même manière dans les deux sous-catégories (P<0,02 et P<0,005, respectivement). Par ailleurs, une incubation des cellules HepG2 (hépatocytes) et Caco-2 (entérocytes) avec de l’ezetimibe a provoqué une augmentation de l’ARNm de PCSK9 et de NPC1L1 de 1,5 à 2 fois (P<0,05), mais aucune variation significative de PCSK9 sécrétée n’a été observée, suggérant que ces lignées cellulaires ne sont pas un modèle idéal. Nous avons également mesuré le niveau de PCSK9 chez 1 739 Canadiens-français âgés de 9, 13 et 16 ans. La valeur moyenne (écart-type) de PCSK9 dans cette cohorte était de 84,7 (24,7) µg/L, légèrement plus basse que dans la cohorte d’adultes (89,5 (31,9) µg/L). Chez les garçons, la PCSK9 circulante diminuait avec l’âge, tandis que c’était l’inverse chez les filles. Il y avait des associations positives et significatives entre la PCSK9 et la glycémie à jeun, l’insulinémie, le HOMA-IR, et les paramètres lipidiques (TC, LDL-C, TG, HDL-C, apoAI et apoB). Dans l’analyse multivariée, une hausse de 10% de l’insulinémie à jeun était associée à une augmentation de 1 à 2% de PCSK9. La régulation de PCSK9 est typique de celle d’un gène impliqué dans le métabolisme des lipoprotéines et est probablement la cible du facteur de transcription «sterol regulatory element-binding protein » (SREBP-2). La concentration plasmatique de la PCSK9 est associée avec l’âge, le sexe, et de multiples marqueurs métaboliques chez les enfants et les adultes. La détection de la PCSK9 circulante chez les sujets HF et non-HF signifie que ce test ELISA spécifique à PCSK9 pourrait servir à suivre la réponse à la thérapie chez un grand éventail de sujets. PCSK9 semble être une cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de l’hypercholestérolémie et de la maladie cardiovasculaire.

Prédiction de boucles de régulation associant microARN et gènes régulés par le récepteur de l'acide rétinoïque dans le cancer du sein

Le récepteur de l'acide rétinoïque RAR est une protéine de la superfamille des récepteurs nucléaires liant le ligand acide rétinoïque (AR). En présence de son ligand, RAR induit la transcription de ses gènes cibles alors qu'en son absence la transcription est inhibée. Le mécanisme de régulation de RAR est altéré dans les lignées cellulaires humaines de carcinome mammaire dû à une baisse de capacité de synthèse de l'AR. Aussi, l'expression des microARN (miR) est perturbée dans le cancer du sein et un grand nombre de gènes ont été identifiés, après une analyse in-silico, comme des cibles prédites des miRs. Ces derniers peuvent être régulés pas des facteurs de transcription et ils sont capables d'inhiber la prolifération cellulaire et d'induire l'apoptose via la régulation de leurs cibles. Ainsi, les miRs peuvent jouer un rôle dans le mécanisme de régulation de RAR et être impliqués dans des boucles de régulation avec ce récepteur. Dans le cadre de ce travail, nous décrivons une approche développée pour prédire et caractériser des circuits de régulation au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel dans le cancer du sein. Nous nous sommes intéressés aux boucles de régulation de type feed-forward où RAR régule un miR et en commun ils régulent un ensemble de gènes codants pour des protéines dans les cellules tumorales mammaires MCF7 et SKBR3. Ces circuits ont été construits en combinant des données de ChIP-chip de RAR et des données de micro-puces d'ADN tout en utilisant des outils in-silico de prédiction des gènes cibles de miRs. Afin de proposer le modèle approprié de régulation, une analyse in-silico des éléments de réponse de l'AR (RARE) dans les promoteurs des miRs est réalisée. Cette étape permet de prédire si la régulation par RAR est directe ou indirecte. Les boucles ainsi prédites sont filtrées en se basant sur des données d'expression de miR existantes dans des bases de données et dans différentes lignées cellulaires, en vue d'éliminer les faux positifs. De plus, seuls les circuits pertinents sur le plan biologique et trouvés enrichis dans Gene Ontology sont retenus. Nous proposons également d'inférer l'activité des miRs afin d'orienter leur régulation par RAR. L'approche a réussi à identifier des boucles validées expérimentalement. Plusieurs circuits de régulation prédits semblent être impliqués dans divers aspects du développement de l'organisme, de la prolifération et de la différenciation cellulaire. De plus, nous avons pu valider que let-7a peut être induit par l'AR dans les MCF7.

Génomique fonctionnelle des cellules corticotropes hypophysaires : contrôle génétique de la gestion systémique des stress

L'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) permet de maintenir l'homéostasie de l'organisme face à divers stress. Qu'ils soient de nature psychologique, physique ou inflammatoire/infectieux, les stress provoquent la synthèse et la libération de CRH par l'hypothalamus. Les cellules corticotropes hypophysaires perçoivent ce signal et en réaction, produisent et sécrètent l'ACTH. Ceci induit la synthèse des glucocorticoïdes (Gc) par le cortex surrénalien; ces stéroïdes mettent le système métabolique en état d’alerte pour la réponse au stress et à l’agression. Les Gc ont le rôle essentiel de contrôler les défenses de l'organisme, en plus d'exercer une rétro-inhibition sur l'axe HPA. L'ACTH est une petite hormone peptidique produite par le clivage d'un précurseur: la pro-opiomélanocortine (POMC). À cause de sa position critique dans la normalisation de l'homéostasie, le contrôle transcriptionnel du gène Pomc a fait l'objet d'études approfondies au cours des dernières décennies. Nous savons maintenant que la région promotrice du gène Pomc permet une expression ciblée dans les cellules POMC hypophysaires. L'étude du locus Pomc par des technologies génomiques m'a permis de découvrir un nouvel élément de régulation qui est conservé à travers l'évolution des mammifères. La caractérisation de cet enhancer a démontré qu'il dirige une expression restreinte à l'hypophyse, et plus particulièrement dans les cellules corticotropes. De façon intéressante, l'activité de cet élément dépend d'un nouveau site de liaison recrutant un homodimère du facteur de transcription Tpit, dont l'expression est également limitée aux cellules POMC de l'hypophyse. La découverte de cet enhancer ajoute une toute nouvelle dimension à la régulation de l'expression de POMC. Les cytokines pro-inflammatoires IL6/LIF et les Gc sont connus pour leur antagonisme sur la réaction inflammatoire et sur le promoteur Pomc via l'action des facteurs de transcription Stat3 et GR respectivement. L'analyse génomique des sites liés ii par ces deux facteurs nous a révélé une interrelation complexe et a permis de définir un code transcriptionnel entre ces voies de signalisation. En plus de leur action par interaction directe avec l’ADN au niveau des séquences régulatrices, ces facteurs interagissent directement entre eux avec des résultats transcriptionnels différents. Ainsi, le recrutement de GR par contact protéine:protéine (tethering) sur Stat3 étant lié à l'ADN provoque un antagonisme transcriptionnel. Inversement, le tethering de Stat3 sur GR supporte une action synergique, tout comme leur co-recrutement à l'ADN sur des sites contigus ou composites. Lors d'une activation soutenue, ce synergisme entre les voies IL6/LIF et Gc induit une réponse innée de défense cellulaire. Ainsi lors d'un stress majeur, ce mécanisme de défense est mis en branle dans toutes les cellules et tissus. En somme, les travaux présentés dans cette thèse définissent les mécanismes transcriptionnels engagés dans le combat de l'organisme contre les stress. Plus particulièrement, ces mécanismes ont été décrits au niveau de la réponse globale des corticotropes et du gène Pomc. Il est essentiel pour l'organisme d'induire adéquatement ces mécanismes afin de faire face aux stress et d'éviter des dérèglements comme les maladies inflammatoires et métaboliques.

Role of the homeodomain transcription factor Hoxa13 in embryonic development and formation of extra-embryonic structures

La famille des gènes Hox code pour des facteurs de transcription connus pour leur contribution essentielle à l’élaboration de l’architecture du corps et ce, au sein de tout le règne animal. Au cours de l’évolution chez les vertébrés, les gènes Hox ont été redéfinis pour générer toute une variété de nouveaux tissus/organes. Souvent, cette diversification s’est effectuée via des changements quant au contrôle transcriptionnel des gènes Hox. Chez les mammifères, la fonction de Hoxa13 n’est pas restreinte qu’à l’embryon même, mais s’avère également essentielle pour le développement de la vascularisation fœtale au sein du labyrinthe placentaire, suggérant ainsi que sa fonction au sein de cette structure aurait accompagné l’émergence des espèces placentaires. Au chapitre 2, nous mettons en lumière le recrutement de deux autres gènes Hoxa, soient Hoxa10 et Hoxa11, au compartiment extra-embryonnaire. Nous démontrons que l’expression de Hoxa10, Hoxa11 et Hoxa13 est requise au sein de l’allantoïde, précurseur du cordon ombilical et du système vasculaire fœtal au sein du labyrinthe placentaire. De façon intéressante, nous avons découvert que l’expression des gènes Hoxa10-13 dans l’allantoïde n’est pas restreinte qu’aux mammifères placentaires, mais est également présente chez un vertébré non-placentaire, indiquant que le recrutement des ces gènes dans l’allantoïde précède fort probablement l’émergence des espèces placentaires. Nous avons généré des réarrangements génétiques et utilisé des essais transgéniques pour étudier les mécanismes régulant l’expression des gènes Hoxa dans l’allantoïde. Nous avons identifié un fragment intergénique de 50 kb capable d’induire l’expression d’un gène rapporteur dans l’allantoïde. Cependant, nous avons trouvé que le mécanisme de régulation contrôlant l’expression du gène Hoxa au sein du compartiment extra-embryonnaire est fort complexe et repose sur plus qu’un seul élément cis-régulateur. Au chapitre 3, nous avons utilisé la cartographie génétique du destin cellulaire pour évaluer la contribution globale des cellules exprimant Hoxa13 aux différentes structures embryonnaires. Plus particulièrement, nous avons examiné plus en détail l’analyse de la cartographie du destin cellulaire de Hoxa13 dans les pattes antérieures en développement. Nous avons pu déterminer que, dans le squelette du membre, tous les éléments squelettiques de l’autopode (main), à l’exception de quelques cellules dans les éléments carpiens les plus proximaux, proviennent des cellules exprimant Hoxa13. En contraste, nous avons découvert que, au sein du compartiment musculaire, les cellules exprimant Hoxa13 et leurs descendantes (Hoxa13lin+) s’étendent à des domaines plus proximaux du membre, où ils contribuent à générer la plupart des masses musculaires de l’avant-bras et, en partie, du triceps. De façon intéressante, nous avons découvert que les cellules exprimant Hoxa13 et leurs descendantes ne sont pas distribuées uniformément parmi les différents muscles. Au sein d’une même masse musculaire, les fibres avec une contribution Hoxa13lin+ différente peuvent être identifiées et les fibres avec une contribution semblable sont souvent regroupées ensemble. Ce résultat évoque la possibilité que Hoxa13 soit impliqué dans la mise en place de caractéristiques spécifiques des groupes musculaires, ou la mise en place de connections nerf-muscle. Prises dans leur ensemble, les données ici présentées permettent de mieux comprendre le rôle de Hoxa13 au sein des compartiments embryonnaires et extra-embryonnaires. Par ailleurs, nos résultats seront d’une importance primordiale pour soutenir les futures études visant à expliquer les mécanismes transcriptionnels soutenant la régulation des gènes Hoxa dans les tissus extra-embryonnaires.

Régulation de la lipoprotéine lipase macrophagique et de LOX-1 par des facteurs métaboliques. Implications dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans les pays occidentaux et constituent la principale complication associée au diabète. La lipoprotéine lipase (LPL) est une enzyme clé du métabolisme des lipides et est responsable de l'hydrolyse des lipoprotéines riches en triglycérides (TG). Plusieurs études ont démontré que la LPL sécrétée par les macrophages dans la paroi artérielle est pro-athérogénique. La dysfonction endothéliale caractérise les stades précoces du processus athérosclérotique. Il a été observé qu’un récepteur nouvellement identifié des lipoprotéines de basse densité oxydées (LDLox), le récepteur de type lectine des LDLox (LOX-1), est fortement exprimé dans les lésions athérosclérotiques humaines et dans l’aorte de rats diabétiques, suggérant un rôle clé de LOX-1 dans la pathogénèse de l’athérosclérose diabétique. Au vu du rôle potentiel de la LPL macrophagique et du LOX-1 dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2, nous avons évalué la régulation de ces deux molécules pro-athérogéniques par des facteurs métaboliques et inflammatoires augmentés dans le diabète, soit la leptine, l’acide linoléique (LA) et la protéine C-réactive (CRP). Nos résultats démontrent que : 1) Dans les cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs), LA augmente l’expression protéique de LOX-1 de façon temps- et dose-dépendante; 2) La pré-incubation de HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la NADPH oxydase, de la protéine kinase C (PKC) et du facteur nucléaire-kappa B (NF-kB), inhibe l’effet stimulant de LA sur l’expression protéique de LOX-1; 3) Dans les HAECs traitées avec LA, on observe une augmentation d’expression des isoformes classiques de la PKC; 4) LA augmente de manière significative l’expression génique de LOX-1 ainsi que la liaison des protéines nucléaires extraites des HAECs à la séquence régulatrice NF-kB présente dans le promoteur du gène de LOX-1; 5) LA augmente, via LOX-1, la captation des LDLox par les cellules endothéliales. Pris dans leur ensemble, ces résultats démontrent que LA augmente l’expression endothéliale de LOX-1 in vitro et appuient le rôle clé de LA dans la dysfonction endothéliale associée au diabète. Au vu de nos études antérieures démontrant qu’une expression accrue de LPL macrophagique chez les patients diabétiques de type 2 et que l’augmentation de facteurs métaboliques dans cette maladie, soit l’homocystéine (Hcys), les acides gras et les produits terminaux de glycation (AGE), accroissent l’expression de la LPL macrophagique, nous avons par la suite déterminé l’effet, in vitro, de deux autres facteurs métaboliques et inflammatoires surexprimés dans le diabète, soit la leptine et la CRP, sur l’expression de la LPL macrophagique. Les concentrations plasmatiques de leptine sont élevées chez les patients diabétiques et sont associées à un accroissement des risques cardiovasculaires. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la leptine augmente l’expression de la LPL, tant au niveau génique que protéique; 2) L’effet stimulant de la leptine sur la LPL est aboli par la pré-incubation avec un anticorps dirigé contre les récepteurs à la leptine (Ob-R), des inhibiteurs de la PKC et des antioxydants; 3) La leptine augmente l’expression membranaire des isoformes classiques de la PKC et la diminution de l’expression endogène de la PKC, abolit l’effet de la leptine sur l’expression de la LPL macrophagique; 4) Dans les macrophages murins, la leptine augmente le taux de synthèse de la LPL et augmente la liaison de protéines nucléaires à la séquence protéine activée-1 (AP-1) du promoteur du gène de la LPL. Ces observations supportent la possibilité que la leptine puisse représenter un facteur stimulant de la LPL macrophagique dans le diabète. Finalement, nous avons déterminé, in vitro, l’effet de la CRP sur l’expression de la LPL macrophagique. La CRP est une molécule inflammatoire et un puissant prédicteur d’événements cardiovasculaires. Des concentrations élevées de CRP sérique sont documentées chez les patients diabétiques de type 2. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la CRP augmente l’expression de la LPL au niveau génique et protéique et la liaison de la CRP aux récepteurs CD32 est nécessaire pour médier ses effets; 2) La pré-incubation de macrophages humains avec des antioxydants, des inhibiteurs de la PKC et de la protéine kinase mitogénique activée (MAPK), prévient l’induction de la LPL par la CRP; 3) La CRP augmente l’activité de la LPL, la génération intracellulaire d’espèces radicalaires oxygénées (ROS), l’expression d’isoformes classiques de la PKC et la phosphorylation des kinases extracellulaires régulées 1/2 (ERK 1/2); 4) Les macrophages murins traités avec la CRP démontrent une augmentation de la liaison des protéines nucléaires à la séquence AP-1 du promoteur du gène de la LPL. Ces données suggèrent que la LPL puisse représenter un nouveau facteur médiant les effets délétères de la CRP dans la vasculopathie diabétique. Dans l’ensemble nos études démontrent le rôle clé de facteurs métaboliques et inflammatoires dans la régulation vasculaire de la LPL et du LOX-1 dans le diabète. Nos données suggèrent que la LPL et le LOX-1 puissent représenter des contributeurs clé de l’athérogénèse accélérée associée au diabète chez l’humain. Mots-clés : athérosclérose, maladies cardiovasculaires, diabète de type 2, macrophage, LPL, cellules endothéliales, LOX-1, stress oxydatif, leptine, LA, CRP.

Régulation de la proprotéine convertase subtilisine / kexine type 9 (PCSK9) dans les cellules intestinales Caco-2/15

La proprotéine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) favorise la dégradation post-transcriptionnelle du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLr) dans les hépatocytes et augmente le LDL-cholestérol dans le plasma. Cependant, il n’est pas clair si la PCSK9 joue un rôle dans l’intestin. Dans cette étude, nous caractérisons les variations de la PCSK9 et du LDLr dans les cellules Caco-2/15 différentiées en fonction d’une variété d’effecteurs potentiels. Le cholestérol (100 µM) lié à l’albumine ou présenté en micelles a réduit de façon significative l’expression génique (30%, p<0,05) et l’expression protéique (50%, p<0,05) de la PCSK9. Étonnamment, une diminution similaire dans le LDLr protéique a été enregistrée (45%, p<0,05). Les cellules traitées avec le 25-hydroxycholestérol (50 µM) présentent également des réductions significatives dans l’ARNm (37%, p<0,01) et la protéine (75%, p<0,001) de la PCSK9. Une baisse des expressions génique (30%, p<0,05) et protéique (57%, p<0,01) a également été constatée dans le LDLr. Des diminutions ont aussi été observées pour la HMG CoA réductase et la protéine liant l’élément de réponse aux stérols SREBP-2. Il a été démontré que le SREBP-2 peut activer transcriptionnellement la PCSK9 par le biais de la liaison de SREBP-2 à son élément de réponse aux stérols situé dans la région proximale du promoteur de la PCSK9. Inversement, la déplétion du contenu cellulaire en cholestérol par l’hydroxypropyl-β-cyclodextrine a augmenté l’expression génique de la PCSK9 (20%, p<0,05) et son contenu protéique (540%, p<0,001), en parallèle avec les niveaux protéiques de SREBP-2. L’ajout des acides biliaires taurocholate et déoxycholate dans le milieu apical des cellules intestinales Caco-2/15 a provoqué une baisse d’expression génique (30%, p<0,01) et une hausse d’expression protéique (43%, p<0,01) de la PCSK9 respectivement, probablement via la modulation du FXR (farnesoid X receptor). Ces données combinées semblent donc indiquer que la PCSK9 fonctionne comme un senseur de stérols dans le petit intestin.

Identification des réseaux transcriptionnnels de résistance aux antifongiques chez Candida albicans

Plusieurs souches cliniques de Candida albicans résistantes aux médicaments antifongiques azolés surexpriment des gènes encodant des effecteurs de la résistance appartenant à deux classes fonctionnelles : i) des transporteurs expulsant les azoles, CDR1, CDR2 et MDR1 et ii) la cible des azoles 14-lanostérol déméthylase encodée par ERG11. La surexpression de ces gènes est due à la sélection de mutations activatrices dans des facteurs de transcription à doigts de zinc de la famille zinc cluster (Zn2Cys6) qui contrôlent leur expression : Tac1p (Transcriptional activator of CDR genes 1) contrôlant l’expression de CDR1 et CDR2, Mrr1p (Multidrug resistance regulator 1), régulant celle de MDR1 et Upc2p (Uptake control 2), contrôlant celle d’ERG11. Un autre effecteur de la résistance clinique aux azoles est PDR16, encodant une transférase de phospholipides, dont la surexpression accompagne souvent celle de CDR1 et CDR2, suggérant que les trois gènes appartiennent au même régulon, potentiellement celui de Tac1p. De plus, la régulation transcriptionnelle du gène MDR1 ne dépend pas seulement de Mrr1p, mais aussi du facteur de transcription de la famille basic-leucine zipper Cap1p (Candida activator protein 1), un régulateur majeur de la réponse au stress oxydatif chez C. albicans qui, lorsque muté, induit une surexpression constitutive de MDR1 conférant la résistance aux azoles. Ces observations suggèrent qu’un réseau de régulation transcriptionnelle complexe contrôle le processus de résistance aux antifongiques azolés chez C. albicans. L’objectif de mon projet au doctorat était d’identifier les cibles transcriptionnelles directes des facteurs de transcription Tac1p, Upc2p et Cap1p, en me servant d’approches génétiques et de génomique fonctionnelle, afin de i) caractériser leur réseau transcriptionnel et les modules transcriptionnels qui sont sous leur contrôle direct, et ii) d’inférer leurs fonctions biologiques et ainsi mieux comprendre leur rôle dans la résistance aux azoles. Dans un premier volet, j’ai démontré, par des expériences de génétique, que Tac1p contrôle non seulement la surexpression de CDR1 et CDR2 mais aussi celle de PDR16. Mes résultats ont identifié une nouvelle mutation activatrice de Tac1p (N972D) et ont révélé la participation d’un autre régulateur dans le contrôle transcriptionnel de CDR1 et PDR16 dont l’identité est encore inconnue. Une combinaison d’expériences de transcriptomique et d’immunoprécipitation de la chromatine couplée à l’hybridation sur des biopuces à ADN (ChIP-chip) m’a permis d’identifier plusieurs gènes dont l’expression est contrôlée in vivo et directement par Tac1p (PDR16, CDR1, CDR2, ERG2, autres), Upc2p (ERG11, ERG2, MDR1, CDR1, autres) et Cap1p (MDR1, GCY1, GLR1, autres). Ces expériences ont révélé qu’Upc2p ne contrôle pas seulement l’expression d’ERG11, mais aussi celle de MDR1 et CDR1. Plusieurs nouvelles propriétés fonctionnelles de ces régulateurs ont été caractérisées, notamment la liaison in vivo de Tac1p aux promoteurs de ses cibles de façon constitutive et indépendamment de son état d’activation, et la liaison de Cap1p non seulement à la région du promoteur de ses cibles, mais aussi celle couvrant le cadre de lecture ouvert et le terminateur transcriptionnel putatif, suggérant une interaction physique avec la machinerie de la transcription. La caractérisation du réseau transcriptionnel a révélé une interaction fonctionnnelle entre ces différents facteurs, notamment Cap1p et Mrr1p, et a permis d’inférer des fonctions biologiques potentielles pour Tac1p (trafic et la mobilisation des lipides, réponse au stress oxydatif et osmotique) et confirmer ou proposer d’autres fonctions pour Upc2p (métabolisme des stérols) et Cap1p (réponse au stress oxydatif, métabolisme des sources d’azote, transport des phospholipides). Mes études suggèrent que la résistance aux antifongiques azolés chez C. albicans est intimement liée au métabolisme des lipides membranaires et à la réponse au stress oxydatif.

The BTB/POZ Transcription Factor Miz-1 Is Required To Regulate The Commitment, Survival And Differentiation Of Early B And T Cell Lineages

Les lymphocytes B et T sont issus de cellules progénitrices lymphoïdes de la moelle osseuse qui se différencient grâce à l’action de facteurs de transcription, cytokines et voies de signalisation, dont l’interleukine-7 (IL-7)/IL-7 récepteur (IL-7R). Le facteur de transcription c-Myc est exprimé par les cellules lymphoïdes et contrôle leur croissance et leur différenciation. Cette régulation transcriptionnelle peut être coordonnée par le complexe c-Myc/Myc-Interacting Zinc finger protein-1 (Miz-1). Le but de ce projet était de comprendre les mécanismes qui impliquent Miz-1 et le complexe c-Myc/Miz-1 dans le développement des lymphocytes B et T. Pour réaliser ce projet, des souris déficientes pour le domaine de transactivation de Miz-1 (Miz-1POZ) et des souris à allèles mutantes pour c-MycV394D, mutation qui empêche l’interaction avec Miz-1, ont été générées. La caractérisation des souris Miz 1POZ a démontré que l’inactivation de Miz-1 perturbe le développement des lymphocytes B et T aux stades précoces de leur différenciation qui dépend de l’IL-7. L’analyse de la cascade de signalisation IL-7/IL-7R a montré que ces cellules surexpriment la protéine inhibitrice SOCS1 qui empêche la phosphorylation de STAT5 et perturbe la régulation à la hausse de la protéine de survie Bcl-2. De plus, Miz-1 se lie directement au promoteur de SOCS1 et contrôle son activité. En plus de contrôler l’axe IL-7/IL-7R/STAT5/Bcl-2 spécifiquement aux stades précoces du développement afin d’assurer la survie des progéniteurs B et T, Miz-1 régule l’axe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B afin de coordonner les signaux nécessaires pour la différenciation des cellules immatures. La caractérisation des souris c-MycV394D a montré, quant à elle, que les fonctions de Miz-1 dans les cellules B et T semblent indépendantes de c-Myc. Les cellules T des souris Miz-1POZ ont un défaut de différenciation additionnel au niveau de la -sélection, étape où les signaux initiés par le TCR remplacent ceux induits par IL-7 pour assurer la prolifération et la différenciation des thymocytes en stades plus matures. À cette étape du développement, une forme fonctionnelle de Miz-1 semble être requise pour contrôler le niveau d’activation de la voie p53, induite lors du processus de réarrangement V(D)J du TCR. L’expression de gènes pro-apoptotiques PUMA, NOXA, Bax et du régulateur de cycle cellulaire p21CIP1 est régulée à la hausse dans les cellules des souris Miz-1POZ. Ceci provoque un débalancement pro-apoptotique qui empêche la progression du cycle cellulaire des cellules TCR-positives. La survie des cellules peut être rétablie à ce stade de différenciation en assurant une coordination adéquate entre les signaux initiés par l’introduction d’un TCR transgénique et d’un transgène codant pour la protéine Bcl-2. En conclusion, ces études ont montré que Miz-1 intervient à deux niveaux du développement lymphoïde: l’un précoce en contrôlant la signalisation induite par l’IL-7 dans les cellules B et T, en plus de l’axe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B; et l’autre tardif, en coordonnant les signaux de survie issus par le TCR et p53 dans les cellules T. Étant donné que les thymocytes et lymphocytes B immatures sont sujets à plusieurs rondes de prolifération, ces études serviront à mieux comprendre l’implication des régulateurs du cycle cellulaire comme c-Myc et Miz-1 dans la génération des signaux nécessaires à la différenciation non aberrante et à la survie des ces cellules. Enfin, les modèles expérimentaux, souris déficientes ou à allèles mutantes, utilisés pour ce travail permettront de mieux définir les bases moléculaires de la transformation maligne des lymphocytes B et T et de révéler les mécanismes conduisant au lymphome.

Activité des cellules souches : identification de nouveaux effecteurs dans le système hématopoïétique

Les cellules souches somatiques présentent habituellement un comportement très différent des cellules souches pluripotentes. Les bases moléculaires de l’auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires ont été récemment déchiffrées grâce à la facilité avec laquelle nous pouvons maintenant les purifier et les maintenir en culture durant de longues périodes de temps. Par contre, il en va tout autrement pour les cellules souches hématopoïétiques. Dans le but d’en apprendre davantage sur le fonctionnement moléculaire de l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques, j’ai d’abord conçu une nouvelle méthode de criblage gain-de-fonction qui répond aux caprices particuliers de ces cellules. Partant d’une liste de plus de 700 facteurs nucléaires et facteurs de division asymétrique candidats, j’ai identifié 24 nouveaux facteurs qui augmentent l’activité des cellules souches hématopoïétiques lorsqu’ils sont surexprimés. J’ai par la suite démontré que neuf de ces facteurs agissent de manière extrinsèque aux cellules souches hématopoïétiques, c’est-à-dire que l’effet provient des cellules nourricières modifiées en co-culture. J’ai également mis à jour un nouveau réseau de régulation de transcription qui implique cinq des facteurs identifiés, c’est-à-dire PRDM16, SPI1, KLF10, FOS et TFEC. Ce réseau ressemble étrangement à celui soutenant l’ostéoclastogénèse. Ces résultats soulèvent l’hypothèse selon laquelle les ostéoclastes pourraient aussi faire partie de la niche fonctionnelle des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse. De plus, j’ai identifié un second réseau de régulation impliquant SOX4, SMARCC1 et plusieurs facteurs identifiés précédemment dans le laboratoire, c’est-à-dire BMI1, MSI2 et KDM5B. D’autre part, plusieurs indices accumulés tendent à démontrer qu’il existe des différences fondamentales entre le fonctionnement des cellules souches hématopoïétiques murines et humaines.

Bioassay-guided fractionation of Larix laricina du Roi, and antidiabetic potentials of ethanol and hot water extracts of seventeen medicinal plants from the traditional pharmacopeia of the James Bay Cree

Nous avons utilisé une approche ethnobotanique pour identifier des espèces de plantes utilisées par les Cris afin de traiter les symptômes du diabète de type 2. Larix laricina du Roi (L. laricina) a récemment été identifiée comme une des meilleures plantes qui a stimulé le transport de glucose dans les cellules C2C12 et fortement potentialisé la différenciation des 3T3-L1 en indiquant une sensibilité potentiellement accrue à l’insuline. Ensuite, ces études de criblage ont été effectuées sur des extraits éthanolique (EE) en utilisant une série de bioessais in vitro. Cependant, les préparations traditionnelles des plantes sont souvent faites avec l’eau chaude. Le but de cette thèse de doctorat était d’isoler les principes actifs de L. laricina par un fractionnement guidé par l’adipogenèse; d’évaluer et de comparer l’activité et les mécanismes antidiabétiques des EE et des extraits aqueux (HWE) de ces 17 plantes. Pour le fractionnement de L. laricina, on a isolé plusieurs composés connus et identifié un nouveau composé actif cycloartane triterpene, qui a amélioré fortement l’adipogenèse et a été responsable en partie de l’activité adipogénique (potentiellement similaire à l’effet sensibilisateur à l’insuline des glitazone) de l’extrait éthanolique issu de l’écorce de L. laricina. Pour le métabolisme lipidique, nos résultats ont confirmé que 10 parmi les 17 EE ont augmenté la différenciation des adipocytes alors que 2 extraits seulement l’ont inhibée. Les HWE ont montré une faible activité adipogénique ou antiadipogénique. Les EE de R. groenlandicum et K. angustifolia ont le PPAR γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ), le SREBP-1 (sterol regulatory element binding protein-1) et le C/EBP (CCAAT-enhancer binding proteins) α, alors que ceux de P. balsamifera et A. incana les ont inhibés. L’effet inhibiteur de P. balsamifera a également été prouvé d’avoir impliqué l’activation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK). Les EE et HWE de R. groenlandicum ont stimulé les mêmes facteurs de transcription alors que les extraits aqueux d’autres plantes sélectionnées ont perdu ces effets en comparaison avec leurs extraits éthanoliques respectifs. L’analyse phytochimique a également identifié le groupe des espèces actives et inactives, notamment lorsque les espèces ont été séparées par famille de plante. Finalement concernant l’homéostasie de glucose, nos résultats ont confirmé que plusieurs EE ont stimulé le transport de glucose musculaire et inhibé l’activité de la glucose-6-phosphatase (G6Pase) hépatique. Certains des HWE ont partiellement ou complètement perdu ces activités antidiabétiques par rapport aux EE, tandis qu’une seule plante (R.groenlandicum) a juste conservé un potentiel similaire entre les EE et HWE dans les deux essais. Dans les cellules musculaires, les EE de R.groenlandicum, A. incana et S. purpurea ont stimulé le transport de glucose en activant la voie de signalisation de l’AMPK et en augmentant le niveau d’expression des GLUT4. En comparaison avec les EE, les HWE de R.groenlandicum ont montré des activités similaires; les HWE de A. incana ont complètement perdu leur effet sur tous les paramètres étudiés; les HWE de S. purpurea ont activé la voie de l’insuline au lieu de celle de l’AMPK pour augmenter le transport de glucose. Dans les cellules H4IIE, les EE et HWE des 5 plantes ont activé la voie de l’AMPK, et en plus les EE et HWE de 2 plantes ont activé la voie de l’insuline. La quercétine-3-O-galactoside et la quercétine 3-O-α-L-arabinopyranoside ont été identifiées comme des composés ayant un fort potentiel antidiabétique et donc responsables de l'activité biologique des plantes HWE actifs avec le transport du glucose. En conclusion, on a isolé plusieurs composés connus et identifié un nouveau triterpène actif à partir du fractionnement de L. laricina. Nous avons fourni également une preuve directe pour l'évaluation et la comparaison d'une action analogue à l'insuline ou insulino-sensibilisateur des EE et HWE de plantes médicinales Cris au niveau de muscle, de foie et de tissus adipeux. Une partie de leur action peut être liée à la stimulation des voies de signalisation intracellulaire insulino-dépendante et non-insulino-dépendante, ainsi que l’activation de PPARγ. Nos résultats indiquent que les espèces de plantes, les tissus ou les cellules cibles, ainsi que les méthodes d'extraction sont tous des déterminants significatifs de l'activité biologique de plantes médicinales Cris sur le métabolisme glucidique et lipidique.

Carence en œstrogènes et bases moléculaires du métabolisme des triglycérides et du cholestérol dans le foie et l'intestin : effet de l'exercice physique

La stéatose hépatique et la détérioration du profil lipidique plasmatique sont des pathologies métaboliques favorisées par la carence œstrogénique post-ménopausique. Cependant les mécanismes à la base de ces pathologies n’ont été que très peu étudiés. Le but de cette thèse a été d’investiguer les mécanismes moléculaires possibles à l’origine de l’hypercholestérolémie et de l’accumulation des lipides (triglycérides : TG et cholestérol) dans le foie en utilisant un modèle animal de la ménopause, la rate Sprague Dawley ovariectomisée (Ovx). Nous avons également examiné si le changement des habitudes de vie comme la pratique de l’exercice physique pouvait prévenir ou corriger les modifications induites par l’Ovx. Enfin, rosuvastatine (statine) a été utilisée comme thérapie pharmacologique de l’hypercholestérolémie dans le but de comprendre son effet au niveau moléculaire chez la rate Ovx. L’objectif de la première étude était de déterminer comment l’Ovx peut affecter les niveaux de TG et de cholestérol dans le foie des rates nourries avec une diète riche en lipides (HF : 42% gras). Les rates ont été soumises à la diète HF ou normale pendant 6 semaines avant d’être Ovx ou Sham (ovariectomie simulée), puis maintenues aux mêmes conditions diététiques pour 6 autres semaines. L’Ovx a provoqué une accumulation de TG dans le foie, mais pas la diète HF seule. Cependant, lorsque l’Ovx était combinée à la diète HF, l’accumulation des TG était beaucoup plus importante comparé à ce qui était observé chez les rates Ovx soumises à la diète normale. L’expression génique (ARNm) de CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1), PGC1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1) et PPARα (Peroxysome proliferetor activated receptor alpha) intervenant dans l’oxydation des acides gras dans le foie était augmentée par la diète HF (p ˂ 0.001; p ˂ 0.01; p ˂ 0.05 respectivement) ; mais atténuée (p ˂ 0.05; p ˂ 0.05; p ˂ 0.07 respectivement) lorsque les rates ont été Ovx, favorisant ainsi l’accumulation des TG dans le foie. La combinaison de la diète HF à l’Ovx a également provoqué une hypercholestérolémie et une accumulation de cholestérol dans le foie malgré la diminution de l’expression de la HMGCoA-r (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase), enzyme clé de la synthèse du cholestérol. Ceci était associé à l’inhibition de l’expression génique de CYP7a1 (Cytochrome P450, family 7, subfamily a, polypeptide 1), suggérant une diminution de la synthèse des acides biliaires. Ayant constaté dans la première étude que l’Ovx élevait les niveaux de cholestérol hépatique et plasmatique, nous nous sommes fixés comme objectif dans la deuxième étude d’évaluer les effets de l’Ovx sur l’expression génique des transporteurs et enzymes responsables du métabolisme du cholestérol et des acides biliaires dans le foie et l’intestin, et de vérifier si l’exercice sur tapis roulant pouvait prévenir ou corriger les changements causés par l’Ovx. L’hypercholestérolémie constatée chez les rates Ovx comparativement aux Sham était accompagnée de la diminution de l’expression génique des récepteurs des LDL (R-LDL), des résidus de lipoprotéines (LRP1), de SREBP-2 (Sterol regulatory element binding protein 2) et de PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) dans le foie, suggérant une défaillance dans la clairance des lipoprotéines plasmatiques. L’Ovx a aussi inhibé l’expression génique de la MTP (Microsomal triglyceride transfer protein) et stimulé celle de SR-B1 (Scavenger receptor class B, member 1); mais aucun changement n’a été observé avec CYP7a1. Ces changements moléculaires pourraient par conséquent favoriser l’accumulation de cholestérol dans le foie. L’exercice physique n’a pas corrigé les modifications causées par l’Ovx sur l’expression génique de ces molécules au niveau hépatique à l’exception de SREBP-2. Par contre, au niveau intestinal (iléum), l’exercice sur tapis roulant a inhibé l’expression génique des marqueurs moléculaires intervenant dans l’absorption des acides biliaires (OSTα/β, FXR, RXRα, Fgf15) et du cholestérol (LXRα, NCP1L1) au niveau de l’iléum chez les rates Sham entraînées. Ces adaptations pourraient prévenir le développement de l’hypercholestérolémie protégeant en partie contre la survenue de l’athérosclérose. Au vue des effets délétères (hypercholestérolémie et diminution de l’expression du R-LDL, PCSK9, LRP1, SREBP-2 et HMGCOA-r dans le foie) causés par l’Ovx sur le métabolisme du cholestérol constatés dans l’étude 2, la 3ième étude a été conçue pour évaluer l’efficacité de rosuvastatine (Ros) sur l’expression génique de ces marqueurs moléculaires chez les rates Ovx sédentaires ou soumises à l’entraînement volontaire. Ros a été administrée aux rates Ovx pendant 21 jours par voie sous-cutanée à la dose de 5mg/kg/j à partir de la 9ième semaine après l’Ovx. Ros n’a pas diminué la concentration plasmatique de LDL-C et de TC chez les rates Ovx. Par contre, Ros a stimulé (P ˂ 0.05) l’expression génique de PCSK9, SREBP-2, LRP1, HMGCoA-r et ACAT2 (Acyl-CoA cholesterol acyltransferase) mais pas significativement (P = 0.3) celle du R-LDL dans le foie des rates Ovx sédentaires et entraînées. Ros n’a pas réduit la concentration plasmatique de LDL-C probablement à cause de l’induction plus importante de PCSK9 par rapport au R-LDL. Cependant, la stimulation de LRP1 par Ros protège partiellement contre la survenue des maladies cardiovasculaires. En conclusion, les études de cette thèse indiquent que la baisse du niveau des œstrogènes entraîne des changements radicaux du métabolisme hépatique des TG et du cholestérol provoqués par des altérations de l’expression des gènes clés des voies métaboliques associées.

Étude fonctionnelle du couplage chimiokine-estrogène dans les tissus reproducteurs

Les estrogènes sont impliqués dans plusieurs aspects de la physiologie humaine en particulier, le développement, la croissance, la différenciation des tissus reproducteurs, la reproduction, et la grossesse. Les effets cellulaires des estrogènes sont transmis via l'interaction avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. L’activation de ERα et ERβ contrôle directement la transcription des gènes cibles nécessaires pour médier les effets physiologiques des estrogènes. L’effet des estrogènes peut aussi être mitogénique et devient la cause de plusieurs pathologies surtout dans les tissus qui présentent une sensibilité accrue à l’hormone tel que les tissus mammaires, les ovaires et l’utérus. De ce fait, une surexposition de ces tissus à l’estrogène augmente le risque de développer le cancer. Dans une lignée cellulaire qui coexprime les deux récepteurs, nous avons identifié la chimiokine SDF-1 qui interagit avec le récepteur CXCR4 et qui décrit une boucle de régulation autocrine/paracrine entre la voie des chimiokines et celle des estrogènes. Cette régulation induit une augmentation de l’expression des gènes cibles prolifératifs du cancer du sein. Cependant, les mécanismes exacts de cette régulation restent inconnus. Afin d'identifier les cibles exactes de cette régulation au niveau génomique, nous avons développé un modèle cellulaire pour discriminer le rôle respectif de ERα et ERβ au niveau du contrôle transcriptionnel de cette boucle de régulation des chimiokines. En partant d’une lignée cellulaire ER-, nous avons généré un système cellulaire qui exprime l’un ou l’autre des isoformes en plus du mutant ERβ-S87A. Nous avons construit le promoteur CXCR4bLuc qu’on a testé dans les lignées cellulaires générées. En utilisant la construction du promoteur CXCR4bLuc, nous avons démontré une voie de régulation des récepteurs des chimiokines par les récepteurs des estrogènes. L’activation membranaire de CXCR4 par SDF-1 implique l’activation directe du récepteur de l’estrogène ERβ par phosphorylation de la sérine 87. Cette phosphorylation active ERβ et favorise l’expression du gène de CXCR4. La transcription de CXCR4 passe par la liaison de ERβ au niveau d’un élément de liaison ERE que nous avons identifié dans ce travail par la technique de ChIP. Ainsi, nous avons identifié une cible exacte de la régulation des récepteurs des chimiokines CXCR4 par le récepteur des estrogènes ERβ qui peut constituer une approche prometteuse pour contrer les pathologies associées au cancer du sein et ses métastases.

The regulatory roles of APE1 and Prdx1 interaction

L’apurinic/apyrimidic endonuclease 1 (APE1) est une protéine multifonctionnelle qui joue un rôle important dans la voie de réparation de l’ADN par excision de base. Elle sert également de coactivateur de transcription et est aussi impliquée dans le métabolisme de l’ARN et la régulation redox. APE1 peut cliver les sites AP ainsi que retirer des groupements, sur des extrémités 3’ créées suite à des bris simple brin, qui bloquent les autres enzymes de réparation, permettant de poursuivre la réparation de l’ADN, puisqu’elle possède plusieurs activités de réparation de l’ADN comme une activité phosphodiestérase 3’ et une activité exonucléase 3’→5’. Les cellules de mammifères ayant subi un knockdown d’APE1 présentent une grande sensibilité face à de nombreux agents génotoxiques. APE1 ne possède qu’une seule cystéine située au 65e acide aminé. Celle-ci est nécessaire pour maintenir l’état de réduction de nombreux activateurs de transcription tels que p53, NF-κB, AP-1, c-Jun at c-Fos. Ainsi, elle se retrouve impliquée dans la régulation de l’expression génique. APE1 passe également à travers au moins 4 types de modifications post-traductionnelles : l’acétylation, la désacétylation, la phosphorylation et l’ubiquitylation. La façon dont APE1 est recrutée pour accomplir ses différentes fonctions biologiques demeure un mystère, bien que cela puisse être relié à sa capacité d’interaction avec de multiples partenaires différents. Sous des conditions de croissance normales, il a été démontré qu’APE1 interagit avec de nombreux partenaires impliqués dans de multiples fonctions. Nous émettons l’hypothèse que l’état d’oxydation d’APE1 est ce qui contrôle les partenaires avec lesquels la protéine interagira, lui permettant d’accomplir des fonctions précises. Dans cette étude nous démontrons que le peroxyde d’hydrogène altère le réseau d’interactions d’APE1. Un nouveau partenaire d’interaction d’APE1, Prdx1, un membre de la famille des peroxirédoxines responsable de récupérer le peroxyde d’hydrogène, est caractérisé. Nous démontrons qu’un knockdown de Prdx1 n’affecte pas l’activité de réparation de l’ADN d’APE1, mais altère sa détection et sa distribution cellulaire à l’intérieur des cellules HepG2 conduisant à une induction accrue de l’interleukine 8 (IL-8). L’IL8 est une chimiokine impliquée dans le stress cellulaire en conditions physiologiques et en cas de stress oxydatif. Il a été démontré que l’induction de l’IL-8 est dépendante d’APE1 indiquant que Prdx1 pourrait réguler l’activité transcriptionnelle d’APE1. Il a été découvert que Prdx1 est impliquée dans la régulation redox suite à une réponse initiée par le peroxyde d’hydrogène. Ce dernier possède un rôle important comme molécule de signalisation dans de nombreux processus biologiques. Nous montrons que Prdx1 est nécessaire pour réduire APE1 dans le cytoplasme en réponse à la présence de H2O2. En présence de Prdx1, la fraction d’APE1 présent dans le cytoplasme est réduite suite à une exposition au peroxyde d’hydrogène, et Prdx1 est hyperoxydé suite à l’interaction entre les deux molécules. Cela suggère que le signal, que produit le peroxyde d’hydrogène, sur APE1 passe par Prdx1. Un knockdown d’APE1 diminue la conversion de la forme dimérique de Prdx1 vers la forme monomérique. Cette observation implique qu’APE1 pourrait être impliquée dans la régulation de l’activité catalytique de Prdx1 en accélérant son hyperoxydation.

Contribution différentielle de Neuroligine‐1 et d’EphA4 à la régulation du sommeil

Le sommeil est un besoin vital et le bon fonctionnement de l’organisme dépend de la quantité et de la qualité du sommeil. Le sommeil est régulé par deux processus : un processus circadien qui dépend de l’activité des noyaux suprachiasmatiques de l’hypothalamus et qui régule le moment durant lequel nous allons dormir, et un processus homéostatique qui dépend de l’activité neuronale et se reflète dans l’intensité du sommeil. En effet, le sommeil dépend de l’éveil qui le précède et plus l’éveil dure longtemps, plus le sommeil est profond tel que mesuré par des marqueurs électroencéphalographiques (EEG). Des études ont montré que le bon fonctionnement de ces deux processus régulateurs du sommeil dépend de la plasticité synaptique. Ainsi, les éléments synaptiques régulant la communication et la force synaptique sont d’importants candidats pour agir sur la physiologie de la régulation du sommeil. Les molécules d’adhésion cellulaire sont des acteurs clés dans les mécanismes de plasticité synaptique. Elles régulent l’activité et la maturation des synapses. Des études ont montré que leur absence engendre des conséquences similaires au manque de sommeil. Le but de ce projet de thèse est d’explorer l’effet de l’absence de deux familles de molécule d’adhésion cellulaire, les neuroligines et la famille des récepteur Eph et leur ligand les éphrines dans les processus régulateurs du sommeil. Notre hypothèse est que l’absence d’un des membres de ces deux familles de molécule affecte les mécanismes impliqués dans le processus homéostatique de régulation du sommeil. Afin de répondre à notre hypothèse, nous avons étudié d’une part l’activité EEG chez des souris mutantes n’exprimant pas Neuroligine‐1 (Nlgn1) ou le récepteur EphA4 en condition normale et après une privation de sommeil. D’autre part, nous avons mesuré les changements moléculaires ayant lieu dans ces deux modèles après privation de sommeil. Au niveau de l’activité EEG, nos résultats montrent que l’absence de Nlgn1 augmente la densité des ondes lentes en condition normale et augment l’amplitude et la pente des ondes lentes après privation de sommeil. Nlgn1 est nécessaire au fonctionnement normal de la synchronie corticale, notamment après une privation de sommeil, lui attribuant ainsi un rôle clé dans l’homéostasie du sommeil. Concernant le récepteur EphA4, son absence affecte la durée du sommeil paradoxal ainsi que l’activité sigma qui dépendent du processus circadien. Nos résultats suggèrent donc que ce récepteur est un élément important dans la régulation circadienne du sommeil. Les changements transcriptionnels en réponse à la privation de sommeil des souris n’exprimant pas Nlgn1 et EphA4 ne sont pas différents des souris sauvages. Toutefois, nous avons montré que la privation de sommeil affectait la distribution des marques épigénétiques sur le génome, tels que la méthylation et l’hydroxyméthylation, et que l’expression des molécules régulant ces changements est modifiée chez les souris mutantes pour le récepteur EphA4. Nos observations mettent en évidence que les molécules d’adhésion cellulaire, Nlgn1 et le récepteur EphA4, possèdent un rôle important dans les processus homéostatique et circadien du sommeil et contribuent de manière différente à la régulation du sommeil.

The regulatory role of eNOS-derived nitric oxide on transcription in endothelial cells: Impact of S-nitrosylation on β-catenin signaling

Les cellules endothéliales forment une couche semi-perméable entre le sang et les organes. La prolifération, la migration et la polarisation des cellules endothéliales sont essentielles à la formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants, soit l’angiogenèse. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) peut activer la synthase endothéliale du monoxyde d’azote (eNOS) et induire la production de monoxyde d’azote (NO) nécessaire pour la régulation de la perméabilité vasculaire et l’angiogenèse. β- caténine est une composante essentielle du complexe des jonctions d’ancrage ainsi qu’un régulateur majeur de la voie de signalisation de Wnt/β-caténine dans laquelle elle se joint au facteur de transcription TCF/LEF et module l’expression de nombreux gènes, dont certains sont impliqués dans l’angiogenèse. La S-nitrosylation (SNO) est un mécanisme de régulation posttraductionnel des protéines par l’ajout d’un groupement nitroso au niveau de résidus cystéines. Le NO produit par eNOS peut induire la S-nitrosylation de la β−caténine au niveau des jonctions intercellulaires et moduler la perméabilité de l’endothélium. Il a d’ailleurs été montré que le NO peut contrôler l’expression génique par la transcription. Le but de cette thèse est d’établir le rôle du NO au sein de la transcription des cellules endothéliales, spécifiquement au niveau de l’activité de β-caténine. Le premier objectif était de déterminer si la SNO de la β-caténine affecte son activité transcriptionnelle. Nous avons montré que le NO inhibe l’activité transcriptionnelle de β- caténine ainsi que la prolifération des cellules endothéliales induites par l’activation de la voie Wnt/β-caténine. Il est intéressant de constater que le VEGF, qui induit la production de NO via eNOS, réprime l’expression de AXIN2 qui est un gène cible de Wnt s’exprimant suite à la i i stimulation par Wnt3a et ce, dépendamment de eNOS. Nous avons identifié que la cystéine 466 de la β-caténine est un résidu essentiel à la modulation répressive de son activité transcriptionnelle par le NO. Lorsqu’il est nitrosylé, ce résidu est responsable de la perturbation du complexe de transcription formé de β-caténine et TCF-4 ce qui inhibe la prolifération des cellules endothéliales induite par la stimulation par Wnt3a. Puisque le NO affecte la transcription, nous avons réalisé l’analyse du transcriptome afin d’obtenir une vue d’ensemble du rôle du NO dans l’activité transcriptionnelle des cellules endothéliales. L’analyse différentielle de l’expression des gènes de cellules endothéliales montre que la répression de eNOS par siRNA augmente l’expression de gènes impliqués au niveau de la polarisation tels que : PARD3A, PARD3B, PKCZ, CRB1 et TJ3. Cette analyse suggère que le NO peut réguler la polarisation des cellules et a permis d’identifier des gènes responsables de l’intégrité des cellules endothéliales et de la réponse immunitaire. De plus, l’analyse de voies de signalisation par KEGG montre que certains gènes modulés par l’ablation de eNOS sont enrichis dans de nombreuses voies de signalisation, notamment Ras et Notch qui sont importantes lors de la migration cellulaire et la différenciation des cellules de têtes et de tronc (tip/stalk). Le regroupement des gènes exprimés chez les cellules traitées au VEGF (déplétées de eNOS ou non) révèle que le NO peut affecter l’expression de gènes contribuant au processus angiogénique, dont l’attraction chimiotactique. Notre étude montre que le NO module la transcription des cellules endothéliales et régule l’expression des gènes impliqués dans l’angiogenèse et la fonction endothéliale.