Études d'ingénierie du ribozyme VS de Neurospora

Les ribozymes sont des ARN catalytiques fréquemment exploités pour le développement d’outils biochimiques et d’agents thérapeutiques. Ils sont particulièrement intéressants pour effectuer l’inactivation de gènes, en permettant la dégradation d’ARNm ou d’ARN viraux associés à des maladies. Les ribozymes les plus utilisés en ce moment pour le développement d’agents thérapeutiques sont les ribozymes hammerhead et hairpin, qui permettent la reconnaissance spécifique d’ARN simple brin par la formation de structures secondaires stables. In vivo, la majorité des ARN adoptent des structures secondaires et tertiaires complexes et les régions simples brins sont parfois difficiles d’accès. Il serait intéressant de pouvoir cibler des ARN repliés et un motif d’ARN intéressant à cibler est la tige-boucle d’ARN qui peut être importante dans le repliement global des ARN et pour accomplir des fonctions biologiques. Le ribozyme VS de Neurospora fait la reconnaissance de son substrat replié en tigeboucle de façon spécifique par une interaction kissing-loop, mais il n’a jamais été exploité pour faire la reconnaissance d’un ARN cible très différent de son substrat naturel. Le but des travaux présentés dans cette thèse est de déterminer si le ribozyme VS possède l’adaptabilité nécessaire pour l’ingénierie de ribozymes qui clivent des ARN cibles différents du substrat naturel. Dans le cadre de cette thèse, le ribozyme VS a été modifié pour l’adapter à différents substrats et des études de cinétiques ont été réalisées pour évaluer l’impact de ces modifications sur l’activité de clivage du ribozyme. Dans un premier temps, le ribozyme a été modifié pour faire la reconnaissance et le clivage de substrats possédant différentes longueurs de tiges Ib. Le ribozyme a été adapté avec succès à ces substrats de différentes longueurs de tige Ib, avec une activité qui est similaire à celle du ribozyme avec un substrat sans modification. Dans un deuxième temps, c’est l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme qui a été substituée de façon rationnelle, dans le but de savoir si un ribozyme VS mutant peut reconnaitre et cliver un substrat ayant une boucle différente de celle de son substrat naturel. L’interaction kissing-loop I/V a été substituée pour les interactions kissing-loop TAR/TAR* de l’ARN du VIH-1 et L22/L88 de l’ARN 23S de Deinococcus radiodurans. La réaction de iii clivage des ribozymes comportant ces nouvelles interactions kissing-loop est toujours observée, mais avec une activité diminuée. Finalement, la sélection in vitro (SELEX) de ribozymes a été effectuée pour permettre un clivage plus efficace d’un substrat mutant avec une nouvelle boucle. Le SELEX a permis la sélection d’un ribozyme qui clive un substrat avec une boucle terminale mutée pour celle de l’ARN TAR du VIH-1 et cela avec une activité de clivage très efficace. L’ensemble de ces études démontre que le ribozyme VS peut être modifié de diverses façons pour la reconnaissance spécifique de différents substrats, tout en conservant une bonne activité de clivage. Ces résultats montrent le grand potentiel d’ingénierie du ribozyme VS et sont prometteurs pour la poursuite d’études d’ingénierie du ribozyme VS, en vue du clivage d’ARN cibles repliés en tige-boucle complètement différents du substrat naturel du ribozyme VS.

Structural bioinformatics analysis of the family of human ubiquitin-specific proteases

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Tracing change in World Cultural Heritage : the recognition of intangible heritage

This thesis investigates the crossover from and intersection between tangible and intangible heritage in the context of World Heritage. Since the start of the twenty-first century, intangible heritage has become increasingly important in international cultural heritage conservation theory and practice. In heritage literature, intangible heritage has been theorized in relation to tangible or built heritage, thereby extending the definition of cultural heritage to consider a holistic perspective. New heritage conservation instruments have been created for the protection of intangible heritage, such as most prominently the 2003 UNESCO Convention for the Safeguarding of the Intangible Cultural Heritage. The changing conception of cultural heritage that goes beyond tangible heritage has also influenced existing instruments like the 1972 UNESCO Convention concerning the protection of the World Cultural and Natural Heritage. The thesis studies how intangible heritage has been recognized and interpreted in implementing the concept of cultural heritage as defined by the World Heritage Convention. It examines the historical development of the concept of World Cultural Heritage with the aim of tracing the construction of intangible heritage in this context. The thesis consists of six chapters. The introduction sets out the research problem and research question. In the literature review, international cultural heritage conservation is portrayed as the research context, the knowledge gap between World Heritage and intangible heritage is identified and an understanding of the research problem deepened, and methods from similar research in the subject area are presented. The methodology in the third chapter describes choices made concerning the research paradigm, research approach and strategy, the use of concepts and illustrative examples, as well as data collection and analysis methods. Knowledge is constructed using primarily a historical approach and related methods. Through the analysis of pertinent documents and heritage discourses, an understanding of the concept of intangible heritage is developed and the concept of World Cultural Heritage is investigated. In the fourth chapter, intangible heritage is studied by looking at specific cultural heritage discourses, that is, a scientific, a UNESCO, and an ICOMOS discourse. Intangible heritage is theorized in relation to the concepts of tangible heritage, heritage value, and cultural heritage. Knowledge gained in this chapter serves as a theoretical lens to trace the recognition of and tease out interpretations of intangible heritage in the context of implementing the concept of World Cultural Heritage. The results are presented in chapter five. A historical development is portrayed in five time periods and for the concepts of cultural heritage, Outstanding Universal Value, the criteria to assess World Heritage value, and authenticity. The conclusion summarizes the main outcomes, assesses the thesis’ contribution to scientific knowledge as well as its limitations, and outlines possible further research. The main results include the identification of the term intangible heritage as an indicator for a paradigm shift and a new approach to conceiving cultural heritage in international cultural heritage conservation. By focusing on processes and the living relationship between people and their environment or place, intangible heritage emphasizes the anthropological. In the context of this conception, intangible heritage takes on two meanings. First, value is attributed by people and hence, is inherently immaterial. Secondly, place is constituted of a tangible-intangible continuum in terms of attributes. A paradigm shift and increasing recognition of an anthropological approach to cultural heritage were identified for all discourses, that is, UNESCO, ICOMOS, the scientific field, and World Heritage. For World Heritage, intangible heritage was recognized indirectly in terms of historical associations during the 1970s and 1980s. The anthropological shift occurred in the early 1990s. The term intangible was introduced and the meaning of intangible heritage was extended to include cultural associations. The subsequent decade is characterized by a process of internalization and implementation of the new approach to cultural heritage. The 2003 Intangible Cultural Heritage Convention created momentum. By the early 2010s, while not explicitly recognizing the immaterial character of values, a holistic approach to cultural heritage was fully endorsed that considers the idea of intangible attributes as carriers of values. An understanding of the recognition of intangible heritage through the implementation of the World Heritage Convention and scientific research in general provide an important knowledge base for implementing the Convention in a more coherent, objective, and well-informed way.