Caractérisation fonctionnelle chez le poisson zèbre de l'isoforme protéique WNK1/HSN2 mutée dans la neuropathie héréditaire sensitive et autonome de type 2

La neuropathie humaine sensitive et autonome de type 2 (NHSA 2) est une pathologie héréditaire rare caractérisée par une apparition précoce des symptômes et une absence d’affectation motrice. Cette pathologie entraîne la perte de perception de la douleur, de la chaleur et du froid ainsi que de la pression (toucher) dans les membres supérieurs et inférieurs et est due à des mutations autosomales récessives confinées à l’exon HSN2 de la protéine kinase à sérine/thréonine WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1). Cet exon spécifique permettrait de conférer une spécificité au système nerveux à l’isoforme protéique WNK1/HSN2. La kinase WNK1 est étudiée en détails, en particulier au niveau du rein, mais son rôle au sein du système nerveux demeure inconnu. Considérant le début précoce de la neuropathie et le manque d’innervation sensorielle révélé par des biopsies chez les patients NHSA2, notre hypothèse de recherche est que les mutations tronquantes menant à la NHSA de type 2 causent une perte de fonction de l’isoforme WNK1/HSN2 spécifique au système nerveux entraînant un défaut dans le développement du système nerveux sensoriel périphérique. Chez l’embryon du poisson zèbre, WNK1/HSN2 est exprimé au niveau des neuromastes de la ligne latérale postérieure, un système mécanosensoriel périphérique. Nous avons obtenu des embryons knockdown pour WNK1/HSN2 par usage d’oligonucléotides morpholino antisens (AMO). Nos trois approches AMO ont révélé des embryons présentant des défauts d’établissement au niveau de la ligne latérale postérieure. Afin de déterminer la voie pathogène impliquant l’isoforme WNK1/HSN2, nous nous sommes intéressés à l’interaction rapportée entre la kinase WNK1 et le co-transporteur neuronal KCC2. Ce dernier est une cible de phosphorylation de WNK1 et son rôle dans la promotion de la neurogenèse est bien connu. Nous avons détecté l’expression de KCC2 au niveau de neuromastes de la ligne latérale postérieure et observé une expression accrue de KCC2 chez les embryons knockdown pour WNK1/HSN2 à l’aide de RT-PCR semi-quantitative. De plus, une sur-expression d’ARN humain de KCC2 chez des embryons a produit des défauts dans la ligne latérale postérieure, phénocopiant le knockdown de WNK1/HSN2. Ces résultats furent validés par un double knockdown, produisant des embryons n’exprimant ni KCC2, ni WNK1/HSN2, dont le phénotype fut atténué. Ces résultats nous mènent à suggérer une voie de signalisation où WNK1/HSN2 est en amont de KCC2, régulant son activation, et possiblement son expression. Nous proposons donc que la perte de fonction de l’isoforme spécifique cause un débalancement dans les niveaux de KCC2 activée, menant à une prolifération et une différenciation réduites des progéniteurs neuronaux du système nerveux périphérique. Les défauts associés à la NHSA de type 2 seraient donc de nature développementale et non neurodégénérative.

Development of a pH-responsive liposomal drug carrier using poly(phosphazenes)

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Novel non phospholipid liposomes with high sterol content : development and characterization

Les liposomes sont des nanovecteurs polyvalents et prometteurs quant à leur utilisation dans plusieurs domaines. Il y a une décennie, un nouveau type de liposome constitué d’amphiphiles monoalkylés et de stérols est né fortuitement dans notre groupe. Ils sont nommés Stérosomes puisqu’ils contiennent une grande proportion de stérols, entre 50 et 70 mol %. Les objectifs de cette thèse sont de développer de nouvelles formulations de Stérosomes ayant des caractéristiques spécifiques et d’acquérir une compréhension plus profonde des règles physicochimiques qui dictent leur comportement de phase. Nous avons spécifiquement examiné le rôle de motifs moléculaires des stérols, de la charge interfaciale et de la capacité à former des liaisons H dans les interactions intermoléculaires menant à l’autoassemblage. Le comportement de phase a été caractérisé par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), par spectroscopie infrarouge (IR) et par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire du deutérium (²H NMR). Premièrement, nous avons établi certaines corrélations entre la structure des stérols, leur tendance à former des bicouches fluides en présence d'amphiphile monoalkylé et la perméabilité des grandes vésicules unilamellaires (LUV) formées. La nature des stérols module les propriétés de mélange avec de l’acide palmitique (PA). Les stérols portant une chaîne volumineuse en position C17 sont moins aptes à induire des bicouches fluides que ceux qui ont une chaîne plus simple, comme celle du cholestérol. Un grand ordre de la chaîne alkyle de PA est un effet commun à tous les stérols investigués. Il a été démontré que la perméabilité des LUV peut être contrôlée en utilisant des stérols différents. Cependant, ces stérols n’ont aucun impact significatif sur la sensibilité des Stérosomes au pH. Afin de créer des liposomes qui sont sensibles au pH et qui ont une charge positive à la surface, des Stérosomes composés de stéarylamine et de cholestérol (Chol) ont été conçus et caractérisés. Il a été conclu que l’état de protonation de l’amine, dans ce travail, ou du groupe carboxylique, dans un travail précédent, confère une sensibilité au pH et détermine la charge à la surface du liposome. Les premiers Stérosomes complètement neutres ont été fabriqués en utilisant un réseau de fortes liaisons H intermoléculaires. Le groupe sulfoxyde est capable de former de fortes liaisons H avec le cholestérol et les molécules d’eau. Une bicouche fluide métastable a été obtenue, à la température de la pièce, à partir d'un mélange équimolaire d’octadécyl méthyl sulfoxyde (OMSO) et de Chol. Ce comportement distinct a permis d’extruder le mélange pour former des LUV à la température de la pièce. Après 30 h, le temps de vie de la phase métastable, des Stérosomes stables et imperméables existaient toujours sous une forme solide. Un diagramme de température-composition a été proposé afin de résumer le comportement de phase des mélanges d’OMSO/Chol. Finalement, nous avons élaboré des Stérosomes furtifs en incorporant du polyéthylène glycol (PEG) avec une ancre de cholestérol (PEG-Chol) à l’interface de Stérosomes de PA/Chol. Jusqu’à 20 mol % de PEG-Chol peut être introduit sans perturber la structure de la bicouche. La présence du PEG-Chol n’a aucun impact significatif sur la perméabilité de la LUV. L'encapsulation active de la doxorubicine, un médicament contre le cancer, a été réalisée malgré la faible perméabilité de ces LUV et la présence du PEG à l’interface. L’inclusion de PEG a modifié considérablement les propriétés de l’interface et a diminué la libération induite par la variation de pH observée avec des LUV nues de PA/Chol. Cette formulation inédite est potentiellement utile pour l’administration intraveineuse de médicaments.

Role of the cotransporter KCC2 in cortical excitatory synapse development and febrile seizure susceptibility

Le co-transporteur KCC2 spécifique au potassium et chlore a pour rôle principal de réduire la concentration intracellulaire de chlore, entraînant l’hyperpolarisation des courants GABAergic l’autorisant ainsi à devenir inhibiteur dans le cerveau mature. De plus, il est aussi impliqué dans le développement des synapses excitatrices, nommées aussi les épines dendritiques. Le but de notre projet est d’étudier l’effet des modifications concernant l'expression et la fonction de KCC2 dans le cortex du cerveau en développement dans un contexte de convulsions précoces. Les convulsions fébriles affectent environ 5% des enfants, et ce dès la première année de vie. Les enfants atteints de convulsions fébriles prolongées et atypiques sont plus susceptibles à développer l’épilepsie. De plus, la présence d’une malformation cérébrale prédispose au développement de convulsions fébriles atypiques, et d’épilepsie du lobe temporal. Ceci suggère que ces pathologies néonatales peuvent altérer le développement des circuits neuronaux irréversiblement. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces effets ne sont pas encore compris. Nous avons pour but de comprendre l'impact des altérations de KCC2 sur la survenue des convulsions et dans la formation des épines dendritiques. Nous avons étudié KCC2 dans un modèle animal de convulsions précédemment validé, qui combine une lésion corticale à P1 (premier jour de vie postnatale), suivie d'une convulsion induite par hyperthermie à P10 (nommés rats LHS). À la suite de ces insultes, 86% des rats mâles LHS développent l’épilepsie à l’âge adulte, au même titre que des troubles d’apprentissage. À P20, ces animaux presentent une augmentation de l'expression de KCC2 associée à une hyperpolarisation du potentiel de réversion de GABA. De plus, nous avons observé des réductions dans la taille des épines dendritiques et l'amplitude des courants post-synaptiques excitateurs miniatures, ainsi qu’un déficit de mémoire spatial, et ce avant le développement des convulsions spontanées. Dans le but de rétablir les déficits observés chez les rats LHS, nous avons alors réalisé un knock-down de KCC2 par shARN spécifique par électroporation in utero. Nos résultats ont montré une diminution de la susceptibilité aux convulsions due à la lésion corticale, ainsi qu'une restauration de la taille des épines. Ainsi, l’augmentation de KCC2 à la suite d'une convulsion précoce, augmente la susceptibilité aux convulsions modifiant la morphologie des épines dendritiques, probable facteur contribuant à l’atrophie de l’hippocampe et l’occurrence des déficits cognitifs. Le deuxième objectif a été d'inspecter l’effet de la surexpression précoce de KCC2 dans le développement des épines dendritiques de l’hippocampe. Nous avons ainsi surexprimé KCC2 aussi bien in vitro dans des cultures organotypiques d’hippocampe, qu' in vivo par électroporation in utero. À l'inverse des résultats publiés dans le cortex, nous avons observé une diminution de la densité d’épines dendritiques et une augmentation de la taille des épines. Afin de confirmer la spécificité du rôle de KCC2 face à la région néocorticale étudiée, nous avons surexprimé KCC2 dans le cortex par électroporation in utero. Cette manipulation a eu pour conséquences d’augmenter la densité et la longueur des épines synaptiques de l’arbre dendritique des cellules glutamatergiques. En conséquent, ces résultats ont démontré pour la première fois, que les modifications de l’expression de KCC2 sont spécifiques à la région affectée. Ceci souligne les obstacles auxquels nous faisons face dans le développement de thérapie adéquat pour l’épilepsie ayant pour but de moduler l’expression de KCC2 de façon spécifique.

Maternal history of early adversity and child emotional development : investigating intervening factors

L’objectif de cette thèse était de contribuer à l’avancement des connaissances quant aux circonstances permettant une transmission intergénérationnelle du risque émanant de l’adversité maternelle et aux mécanismes sous-tendant cette transmission, dans quatre articles empiriques. Le premier visait à explorer la relation entre un historique d’adversité maternelle, la sécurité d’attachement mère-enfant et le tempérament de l’enfant. Les mères ont complété une entrevue semi-structurée portant sur leurs représentations d’attachement avec leurs parents, à 6 mois, et ont évalué le tempérament de leur enfant à 2 ans. La sécurité d’attachement fut également évaluée à 2 ans. Les résultats ont démontré que les enfants dont les mères rapportaient des niveaux supérieurs d’adversité présentaient de moins bons niveaux d’activité comportementale, uniquement lorsqu’ils avaient un attachement sécurisant avec leur mère. Ces résultats suggèrent une transmission intergénérationnelle des effets d’un historique d’adversité maternelle sur le tempérament des enfants. Le deuxième article visait à investiguer si le transporteur de sérotonine (5-HTTLPR) module la transmission de risque intergénérationnelle de l’adversité maternelle sur le tempérament des enfants. L’historique d’adversité maternelle fut évalué en combinant deux mesures auto-rapportées. Les mères ont également évalué le tempérament de leur enfant à 18 et à 36 mois. Le génotype des enfants fut extrait à 36 mois. Les résultats ont révélé un effet d’interaction entre l’adversité maternelle et le génotype de l’enfant sur le tempérament, suggérant une transmission intergénérationnelle des effets de l’adversité maternelle sur le fonctionnement émotionnel des enfants. Le troisième article visait à explorer la relation entre les difficultés d’adaptation psychosociale des mères, la sensibilité maternelle et les symptômes intériorisés de leurs enfants. Les mères ont complété plusieurs questionnaires desquels un score composite de difficultés d’adaptation psychosociale fut extrait. La sensibilité maternelle fut observée à 12 mois. Les symptômes intériorisés des enfants furent évalués par les deux parents à 2 et à 3 ans. Les résultats ont démontré qu’une augmentation des difficultés maternelles d’adaptation psychosociale étaient associée à davantage de symptômes intériorisés chez les enfants, mais seulement chez ceux dont les mères étaient moins sensibles. Ces résultats ont été observés par les mères à 2 ans et par les deux parents à 3 ans. Ces résultats suggèrent que les enfants peuvent être différemment affectés par l’adaptation émotionnelle de leur mère tout en mettant l’emphase sur le rôle protecteur de la sensibilité maternelle. Le quatrième article visait à investiguer les rôles médiateurs de la dépression et de la sensibilité maternelle dans la relation entre un historique d’adversité maternelle et le tempérament de l’enfant. L’historique d’adversité maternelle fut évalué en combinant deux mesures auto-rapportées. Les mères ont également rapporté leurs symptômes dépressifs à 6 mois. La sensibilité maternelle fut évaluée de façon concomitante. Les mères ont évalué le tempérament de leur enfant à 36 mois. Les résultats ont révélé une transmission intergénérationnelle des effets d’un historique d’adversité maternelle à la génération suivante suivant une médiation séquentielle passant d’abord par la dépression maternelle et ensuite par la sensibilité maternelle. Finalement, les résultats des quatre articles ont été intégrés dans la conclusion générale.

Development of new scenario decomposition techniques for linear and nonlinear stochastic programming

Une approche classique pour traiter les problèmes d’optimisation avec incertitude à deux- et multi-étapes est d’utiliser l’analyse par scénario. Pour ce faire, l’incertitude de certaines données du problème est modélisée par vecteurs aléatoires avec des supports finis spécifiques aux étapes. Chacune de ces réalisations représente un scénario. En utilisant des scénarios, il est possible d’étudier des versions plus simples (sous-problèmes) du problème original. Comme technique de décomposition par scénario, l’algorithme de recouvrement progressif est une des méthodes les plus populaires pour résoudre les problèmes de programmation stochastique multi-étapes. Malgré la décomposition complète par scénario, l’efficacité de la méthode du recouvrement progressif est très sensible à certains aspects pratiques, tels que le choix du paramètre de pénalisation et la manipulation du terme quadratique dans la fonction objectif du lagrangien augmenté. Pour le choix du paramètre de pénalisation, nous examinons quelques-unes des méthodes populaires, et nous proposons une nouvelle stratégie adaptive qui vise à mieux suivre le processus de l’algorithme. Des expériences numériques sur des exemples de problèmes stochastiques linéaires multi-étapes suggèrent que la plupart des techniques existantes peuvent présenter une convergence prématurée à une solution sous-optimale ou converger vers la solution optimale, mais avec un taux très lent. En revanche, la nouvelle stratégie paraît robuste et efficace. Elle a convergé vers l’optimalité dans toutes nos expériences et a été la plus rapide dans la plupart des cas. Pour la question de la manipulation du terme quadratique, nous faisons une revue des techniques existantes et nous proposons l’idée de remplacer le terme quadratique par un terme linéaire. Bien que qu’il nous reste encore à tester notre méthode, nous avons l’intuition qu’elle réduira certaines difficultés numériques et théoriques de la méthode de recouvrement progressif.