Studies on the exaggerated inflammatory response caused by streptococcus suis at systemic and central nervous system levels

Streptococcus suis de type 2 est un microorganisme pathogène d’importance chez le porc. Il est la cause de différentes pathologies ayant comme caractéristique commune la méningite. C’est également un agent émergeant de zoonose : des cas cliniques humains ont récemment été rapportés en Asie. Cependant, la pathogénèse de S. suis n’est pas encore complètement élucidée. Jusqu’à présent, la réponse pro-inflammatoire initiée par S. suis n’a été étudiée qu’in vitro. L’étude du choc septique et de la méningite requiert toujours des modèles expérimentaux appropriés. Au cours de cette étude, nous avons développé un modèle in vivo d’infection chez la souris qui utilise la voie d’inoculation intra-péritonéale. Ce modèle a servi à l’étude de la réponse pro-inflammatoire associée à ce pathogène, tant au niveau systémique qu’au niveau du système nerveux central (SNC). Il nous a également permis de déterminer si la sensibilité aux infections à S. suis pouvait être influencée par des prédispositions génétiques de l’hôte. Le modèle d’infection par S. suis a été mis au point sur des souris de lignée CD1. Les résultats ont démontré une bactériémie élevée pendant les trois jours suivant l’infection. Celle-ci était accompagnée d’une libération rapide et importante de différentes cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-12p40/p70, IFN-ɣ) et de chémokines (KC, MCP-1 and RANTES), qui ont entraîné un choc septique et la mort de 20 % des animaux. Ensuite, pour confirmer le rôle de l’inflammation sur la mortalité et pour déterminer si les caractéristiques génétiques de l’hôte pouvaient influencer la réponse inflammatoire et l’issue de la maladie, le modèle d’infection a été étendu à deux lignées murines consanguines différentes considérées comme résistante : la lignée C57BL/6 (B6), et sensible : la lignée A/J. Les résultats ont démontré une importante différence de sensibilité entre les souris A/J et les souris B6, avec un taux de mortalité atteignant 100 % à 20 h post-infection (p.i.) pour la première lignée et de seulement 16 % à 36 h p.i. pour la seconde. La quantité de bactéries dans le sang et dans les organes internes était similaire pour les deux lignées. Donc, tout comme dans la lignée CD1, la bactériémie ne semblait pas être liée à la mort des souris. La différence entre les taux de mortalité a été attribuée à un choc septique non contrôlé chez les souris A/J infectées par S. suis. Les souris A/J présentaient des taux exceptionnellement élevés de TNF-α, IL-12p40/p70, IL-1β and IFN- γ, significativement supérieurs à ceux retrouvés dans la lignée B6. Par contre, les niveaux de chémokines étaient similaires entre les lignées, ce qui suggère que leur influence est limitée dans le développement du choc septique dû à S. suis. Les souris B6 avaient une production plus élevée d’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, ce qui suppose que la cascade cytokinaire pro-inflammatoire était mieux contrôlée, entraînant un meilleur taux de survie. Le rôle bénéfique potentiel de l’IL-10 chez les souris infectées par S. suis a été confirmé par deux approches : d’une part en bloquant chez les souris B6 le récepteur cellulaire à l’IL-10 (IL-10R) par un anticorps monoclonal anti-IL-10R de souris et d’autre part en complémentant les souris A/J avec de l’IL-10 de souris recombinante. Les souris B6 ayant reçu le anticorps monoclonal anti-IL-10R avant d’être infectées par S. suis ont développé des signes cliniques aigus similaires à ceux observés chez les souris A/J, avec une mortalité rapide et élevée et des taux de TNF-α plus élevés que les souris infectées non traitées. Chez les souris A/J infectées par S. suis, le traitement avec l’IL-10 de souris recombinante a significativement retardé l’apparition du choc septique. Ces résultats montrent que la survie au choc septique dû à S. suis implique un contrôle très précis des mécanismes pro- et anti-inflammatoires et que la réponse anti-inflammatoire doit être activée simultanément ou très rapidement après le début de la réponse pro-inflammatoire. Grâce à ces expériences, nous avons donc fait un premier pas dans l’identification de gènes associés à la résistance envers S. suis chez l’hôte. Une des réussites les plus importantes du modèle d’infection de la souris décrit dans ce projet est le fait que les souris CD1 ayant survécu à la septicémie présentaient dès 4 jours p.i. des signes cliniques neurologiques clairs et un syndrome vestibulaire relativement similaires à ceux observés lors de méningite à S. suis chez le porc et chez l’homme. L’analyse par hybridation in situ combinée à de l’immunohistochimie des cerveaux des souris CD1 infectées a montré que la réponse inflammatoire du SNC débutait avec une augmentation significative de la transcription du Toll-like receptor (TLR)2 et du CD14 dans les microvaisseaux cérébraux et dans les plexus choroïdes, ce qui suggère que S. suis pourrait se servir de ces structures comme portes d’entrée vers le cerveau. Aussi, le NF-κB (suivi par le système rapporteur de l’activation transcriptionnelle de IκBα), le TNF-α, l’IL-1β et le MCP-1 ont été activés, principalement dans des cellules identifiées comme de la microglie et dans une moindre mesure comme des astrocytes. Cette activation a également été observée dans différentes structures du cerveau, principalement le cortex cérébral, le corps calleux, l’hippocampe, les plexus choroïdes, le thalamus, l’hypothalamus et les méninges. Partout, cette réaction pro-inflammatoire était accompagnée de zones extensives d’inflammation et de nécrose, de démyélinisation sévère et de la présence d’antigènes de S. suis dans la microglie. Nous avons mené ensuite des études in vitro pour mieux comprendre l’interaction entre S. suis et la microglie. Pour cela, nous avons infecté des cellules microgliales de souris avec la souche sauvage virulente (WT) de S. suis, ainsi qu’avec deux mutants isogéniques, un pour la capsule (CPS) et un autre pour la production d’hémolysine (suilysine). Nos résultats ont montré que la capsule était un important mécanisme de résistance à la phagocytose pour S. suis et qu’elle modulait la réponse inflammatoire, en dissimulant les composants pro-inflammatoires de la paroi bactérienne. Par contre, l’absence d’hémolysine, qui est un facteur cytotoxique potentiel, n’a pas eu d’impact majeur sur l’interaction de S. suis avec la microglie. Ces études sur les cellules microgliales ont permis de confirmer les résultats obtenus précédemment in vivo. La souche WT a induit une régulation à la hausse du TLR2 ainsi que la production de plusieurs médiateurs pro-inflammatoires, dont le TNF-α et le MCP-1. S. suis a induit la translocation du NF-kB. Cet effet était plus rapide dans les cellules stimulées par le mutant déficient en CPS, ce qui suggère que les composants de la paroi cellulaire représentent de puissants inducteurs du NF-kB. De plus, la souche S. suis WT a stimulé l’expression de la phosphotyrosine, de la PKC et de différentes cascades liées à l’enzyme mitogen-activated protein kinase (MAPK). Cependant, les cellules microgliales infectées par le mutant déficient en CPS ont montré des profils de phosphorylation plus forts et plus soutenus que celles infectées par le WT. Finalement, la capsule a aussi modulé l’expression de l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) induite par S. suis et par la production subséquente d’oxyde nitrique par la microglie. Ceci pourrait être lié in vivo à la neurotoxicité et à la vasodilatation. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant l’induction de l’inflammation par S. suis, ce qui devrait permettre, d’établir éventuellement des stratégies plus efficaces de lutte contre la septicémie et la méningite. Enfin, nous pensons que ce modèle expérimental d’infection chez la souris pourra être utilisé dans l’étude de la pathogénèse d’autres bactéries ayant le SNC pour cible.

Biochemical mechanisms involved in pulmonary hypo-alveolarization induced by peroxides contaminating parenteral nutrition in newborn guinea pig

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP), caractérisée par un défaut de l’alvéolarisation, est une complication pathologique associée à un stress oxydant chez le nouveau-né prématuré. La DBP est présente chez près de 50 % des nouveau-nés de moins de 29 semaines de gestation. La nutrition parentérale (NP) que ces nouveau-nés reçoivent pour cause d’immaturité gastro-intestinale est une source importante de stress oxydant. En effet, leur NP est contaminée par des peroxydes, dont l’ascorbylperoxyde qui est une forme peroxydée du déshydroascorbate. La génération des peroxydes est catalysée par la lumière ambiante. La photoprotection de la NP, quoique difficile d’application en clinique, est associée à une diminution de l’incidence de la DBP chez les enfants prématurés. Chez l’animal nouveau-né, la photoprotection de la NP est associée à un meilleur développement alvéolaire. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que l’ascorbylperoxide infusé avec la NP cause la perte d’alvéoles suite à une apoptose exagérée induite par l’oxydation du potentiel redox du glutathion. Cette oxydation du potentiel redox serait occasionnée par l’inhibition de la transformation hépatique de la méthionine en cystéine, menant à une diminution de la synthèse de glutathion au foie et dans les tissus tels que les poumons. La confirmation de cette hypothèse suggérera qu’un ajout de glutathion dans la NP permettra une meilleure détoxification de l’ascorbylperoxide par l’action de la glutathion peroxydase, et préviendra l’oxydation du potentiel redox et ainsi, la perte d'alvéoles par apoptose. Objectifs : Le but de mon projet de recherche est de comprendre les mécanismes biochimiques liant la NP et le développement de la DBP chez le nouveau-né prématuré et de proposer une alternative nutritionnelle prévenant le développement de cette complication fréquemment observée dans cette population. Les objectifs spécifiques sont : 1) d’évaluer l’impact, au poumon, de l’infusion de l’ascorbylperoxyde sur l’axe métabolique potentiel redox du glutathion - apoptose - le développement alvéolaire; 2) d’étudier l’impact de l’ascorbylperoxyde et du potentiel redox sur l’activité hépatique de la méthionine adénosyltransférase (MAT), première enzyme de la cascade métabolique transformant la méthionine en cystéine; et 3) de tenter de prévenir l’impact négatif de la NP ou de l’infusion d’ascorbylperoxyde sur le poumon en améliorant le statut en glutathion. Méthodes: Par un cathéter fixé dans la jugulaire, des cochons d’Inde de trois jours de vie (n = 8 par groupe) ont reçu en continu durant 4 jours une NP ou une solution de base (dextrose + NaCl) enrichie des différentes molécules à l’essai. Le premier objectif a été atteint en enrichissant la solution de base en ascorbylperoxyde à 0, 20, 60 et 180 μM. Ces solutions contenaient ou non 350 μM H2O2 pour se rapprocher des conditions cliniques. Le second objectif a été atteint en investiguant les mécanismes d’inhibition de la MAT dans des animaux infusés ou non avec des solutions contenant la solution de base, des peroxydes, du glutathion et la NP (dextrose + acides aminés + multivitamines + lipides). Le troisième objectif a été atteint en ajoutant ou non à une solution d’ascorbylperoxide ou à la NP 10 μM de glutathion (GSSG), afin d’obtenir une concentration plasmatique normale de glutathion. Après 4 jours, les poumons étaient prélevés et traités pour la détermination de GSH et GSSG par électrophorèse capillaire, le potentiel redox était calculé selon l'équation de Nernst et le niveau de caspase-3 actif (marqueur d’apoptose) par Western blot et l’index d’alvéolarisation quantifié par le nombre d’interceptes entre des structures histologiques et une droite calibrée. Les données étaient comparées par ANOVA, les effets étaient considérés comme significatifs si le p était inférieur à 0,05. Résultats: L’infusion de l’ascorbylperoxyde, indépendamment du H2O2, a induit une hypoalvéolarisation, une activation de la caspase-3 et une oxydation du potentiel redox de manière dose-dépendante. Ces effets ont été empêchés par l’ajout de GSSG à la NP ou à la solution d’ascorbylperoxyde (180 M). L’ascorbylperoxyde et le H2O2 ont inhibé l’activité de MAT tandis qu’elle était linéairement modulée par la valeur du potentiel redox hépatique. Conclusion : Nos résultats suggèrent que l’ascorbylperoxyde est l’agent actif de la NP conduisant au développement de la DBP. Ainsi la correction des bas niveaux de glutathion induits par les peroxydes de la NP favorise la détoxification des peroxydes et la correction du potentiel redox pulmonaire ; ce qui a protégé les poumons des effets délétères de la NP en outrepassant l’inhibition de la MAT hépatique. Nos résultats sont d'une grande importance car ils donnent de l'espoir pour une prévention possible de la DBP.