New insights into small molecules inhibitors and protein-protein interactions of VirB8 : a critical conserved component of the type IV secretion system.

Les systèmes bactériens de sécrétion de type IV (T4SS) sont constitués d’un ensemble de 8 à 12 protéines conservées. Ces dernières sont utilisées lors de la translocation de protéines, la translocation de complexes ADN-protéines mais aussi pour le transport de ces derniers au travers de la membrane cellulaire. Les T4SS, en tant que facteurs de virulence pour beaucoup de pathogènes comme Brucella suis, sont donc d’excellents modèles cibles pour le développement de médicaments d’antivirulence. Ces médicaments, en privant le pathogène de son facteur essentiel de virulence : le T4SS, constituent une alternative ou encore une amélioration des traitements antibiotiques utilisés actuellement. VirB8, un facteur d’assemblage conservé dans le T4SS, forme des dimères qui sont importants pour la fonction des T4SS dans ces pathogènes. De par ses interactions multiples, VirB8 est un excellent modèle pour l’analyse des facteurs d’assemblage mais aussi en tant que cible de médicaments qui empêcheraient son interaction avec d’autres protéines et qui, in fine, désarmeraient les bactéries en les privant de leur fonctions essentielles de virulence. À ce jour, nous savons qu’il existe un équilibre monomère-dimère et un processus d’homodimerization de VirB8 dont l’importance est vitale pour la fonctionnement biologique des T4SSs. En se basant sur des essais quantitatifs d’interaction, nous avons identifié (i) des sites potentiels d’interaction avec d’autres protéines VirB du T4SS mais aussi (ii) isolé des petites molécules inhibitrices afin de tester la fonction protéique de VirB8. Afin de déterminer les acides aminés importants pour l’hétérodimérization de VirB8 avec VirB10, nous avons effectué des expériences de mutagenèse aléatoire, de phage display et d’arrimage moléculaire in silico. Ces expériences ont démontré l’importance de trois acides aminés localisés sur le feuillet β : R160, S162, T164 et I165. Ces derniers seraient importants pour l’association de VirB8 avec VirB10 étant donné que leur mutagenèse entraine une diminution de la formation du complexe VirB8-VirB10. L’objectif actuel de notre projet de recherche est de pouvoir mieux comprendre mais aussi d’évaluer le rôle de VirB8 dans l’assemblage du T4SS. Grace à un méthode de criblage adaptée à partir de la structure de VirB8, nous avons pu identifié une petite molécule inhibitrice BAR-068, qui aurait un rôle prometteur dans l’inhibition du T4SS. Nous avons utilisé la spectroscopie par fluorescence, l’essai à deux hybrides, le cross-linking et la cristallographie afin de déterminer le mécanisme d'interaction existant entre VirB8 et BAR-068. Ces travaux pourraient permettre de nombreuses avancées, notamment en termes de compréhension des mécanismes d’inhibition du T4SS. Notre objectif ultime est de pouvoir caractériser la séquence d’évènements essentiels à l’assemblage et au fonctionnement du T4SS. De manière globale, notre projet de recherche permettrait de révéler les grands principes d’assemblage des protéines membranaires, les processus de sécrétion de protéines chez les bactéries mais aussi de proposer une nouvelle stratégie lors du développement de drogues antimicrobiennes.

Signaling of angiotensin II-induced vascular protein synthesis in conduit and resistance arteries in vivo

Affiliation: Faculté de pharmacie, Université de Montréal & Institut de recherches cliniques de Montréal

Clustering algorithms and shape factor methods to discriminate among small GTPase phenotypes using DIC image analysis.

Naïvement perçu, le processus d’évolution est une succession d’événements de duplication et de mutations graduelles dans le génome qui mènent à des changements dans les fonctions et les interactions du protéome. La famille des hydrolases de guanosine triphosphate (GTPases) similaire à Ras constitue un bon modèle de travail afin de comprendre ce phénomène fondamental, car cette famille de protéines contient un nombre limité d’éléments qui diffèrent en fonctionnalité et en interactions. Globalement, nous désirons comprendre comment les mutations singulières au niveau des GTPases affectent la morphologie des cellules ainsi que leur degré d’impact sur les populations asynchrones. Mon travail de maîtrise vise à classifier de manière significative différents phénotypes de la levure Saccaromyces cerevisiae via l’analyse de plusieurs critères morphologiques de souches exprimant des GTPases mutées et natives. Notre approche à base de microscopie et d’analyses bioinformatique des images DIC (microscopie d’interférence différentielle de contraste) permet de distinguer les phénotypes propres aux cellules natives et aux mutants. L’emploi de cette méthode a permis une détection automatisée et une caractérisation des phénotypes mutants associés à la sur-expression de GTPases constitutivement actives. Les mutants de GTPases constitutivement actifs Cdc42 Q61L, Rho5 Q91H, Ras1 Q68L et Rsr1 G12V ont été analysés avec succès. En effet, l’implémentation de différents algorithmes de partitionnement, permet d’analyser des données qui combinent les mesures morphologiques de population native et mutantes. Nos résultats démontrent que l’algorithme Fuzzy C-Means performe un partitionnement efficace des cellules natives ou mutantes, où les différents types de cellules sont classifiés en fonction de plusieurs facteurs de formes cellulaires obtenus à partir des images DIC. Cette analyse démontre que les mutations Cdc42 Q61L, Rho5 Q91H, Ras1 Q68L et Rsr1 G12V induisent respectivement des phénotypes amorphe, allongé, rond et large qui sont représentés par des vecteurs de facteurs de forme distincts. Ces distinctions sont observées avec différentes proportions (morphologie mutante / morphologie native) dans les populations de mutants. Le développement de nouvelles méthodes automatisées d’analyse morphologique des cellules natives et mutantes s’avère extrêmement utile pour l’étude de la famille des GTPases ainsi que des résidus spécifiques qui dictent leurs fonctions et réseau d’interaction. Nous pouvons maintenant envisager de produire des mutants de GTPases qui inversent leur fonction en ciblant des résidus divergents. La substitution fonctionnelle est ensuite détectée au niveau morphologique grâce à notre nouvelle stratégie quantitative. Ce type d’analyse peut également être transposé à d’autres familles de protéines et contribuer de manière significative au domaine de la biologie évolutive.

Searching for novel gene functions in yeast : identification of thousands of novel molecular interactions by protein-fragment complementation assay followed by automated gene function prediction and high-throughput lipidomics

La compréhension de processus biologiques complexes requiert des approches expérimentales et informatiques sophistiquées. Les récents progrès dans le domaine des stratégies génomiques fonctionnelles mettent dorénavant à notre disposition de puissants outils de collecte de données sur l’interconnectivité des gènes, des protéines et des petites molécules, dans le but d’étudier les principes organisationnels de leurs réseaux cellulaires. L’intégration de ces connaissances au sein d’un cadre de référence en biologie systémique permettrait la prédiction de nouvelles fonctions de gènes qui demeurent non caractérisées à ce jour. Afin de réaliser de telles prédictions à l’échelle génomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons développé une stratégie innovatrice qui combine le criblage interactomique à haut débit des interactions protéines-protéines, la prédiction de la fonction des gènes in silico ainsi que la validation de ces prédictions avec la lipidomique à haut débit. D’abord, nous avons exécuté un dépistage à grande échelle des interactions protéines-protéines à l’aide de la complémentation de fragments protéiques. Cette méthode a permis de déceler des interactions in vivo entre les protéines exprimées par leurs promoteurs naturels. De plus, aucun biais lié aux interactions des membranes n’a pu être mis en évidence avec cette méthode, comparativement aux autres techniques existantes qui décèlent les interactions protéines-protéines. Conséquemment, nous avons découvert plusieurs nouvelles interactions et nous avons augmenté la couverture d’un interactome d’homéostasie lipidique dont la compréhension demeure encore incomplète à ce jour. Par la suite, nous avons appliqué un algorithme d’apprentissage afin d’identifier huit gènes non caractérisés ayant un rôle potentiel dans le métabolisme des lipides. Finalement, nous avons étudié si ces gènes et un groupe de régulateurs transcriptionnels distincts, non préalablement impliqués avec les lipides, avaient un rôle dans l’homéostasie des lipides. Dans ce but, nous avons analysé les lipidomes des délétions mutantes de gènes sélectionnés. Afin d’examiner une grande quantité de souches, nous avons développé une plateforme à haut débit pour le criblage lipidomique à contenu élevé des bibliothèques de levures mutantes. Cette plateforme consiste en la spectrométrie de masse à haute resolution Orbitrap et en un cadre de traitement des données dédié et supportant le phénotypage des lipides de centaines de mutations de Saccharomyces cerevisiae. Les méthodes expérimentales en lipidomiques ont confirmé les prédictions fonctionnelles en démontrant certaines différences au sein des phénotypes métaboliques lipidiques des délétions mutantes ayant une absence des gènes YBR141C et YJR015W, connus pour leur implication dans le métabolisme des lipides. Une altération du phénotype lipidique a également été observé pour une délétion mutante du facteur de transcription KAR4 qui n’avait pas été auparavant lié au métabolisme lipidique. Tous ces résultats démontrent qu’un processus qui intègre l’acquisition de nouvelles interactions moléculaires, la prédiction informatique des fonctions des gènes et une plateforme lipidomique innovatrice à haut débit , constitue un ajout important aux méthodologies existantes en biologie systémique. Les développements en méthodologies génomiques fonctionnelles et en technologies lipidomiques fournissent donc de nouveaux moyens pour étudier les réseaux biologiques des eucaryotes supérieurs, incluant les mammifères. Par conséquent, le stratégie présenté ici détient un potentiel d’application au sein d’organismes plus complexes.

Nanostructure des particules polymériques : aspects physiques, chimiques et biologiques

Les nanotechnologies appliquées aux sciences pharmaceutiques ont pour but d’améliorer l’administration de molécules actives par l’intermédiaire de transporteurs nanométriques. Parmi les différents types de véhicules proposés pour atteindre ce but, on retrouve les nanoparticules polymériques (NP) constituées de copolymères “en bloc”. Ces copolymères permettent à la fois l’encapsulation de molécules actives et confèrent à la particule certaines propriétés de surface (dont l’hydrophilicité) nécessaires à ses interactions avec les milieux biologiques. L’architecture retenue pour ces copolymères est une structure constituée le plus fréquemment de blocs hydrophiles de poly(éthylène glycol) (PEG) associés de façon linéaire à des blocs hydrophobes de type polyesters. Le PEG est le polymère de choix pour conférer une couronne hydrophile aux NPs et son l’efficacité est directement liée à son organisation et sa densité de surface. Néanmoins, malgré les succès limités en clinique de ces copolymères linéaires, peu de travaux se sont attardés à explorer les effets sur la structure des NPs d’architectures alternatives, tels que les copolymères en peigne ou en brosse. Durant ce travail, plusieurs stratégies ont été mises au point pour la synthèse de copolymères en peigne, possédant un squelette polymérique polyesters-co-éther et des chaines de PEG liées sur les groupes pendants disponibles (groupement hydroxyle ou alcyne). Dans la première partie de ce travail, des réactions d’estérification par acylation et de couplage sur des groupes pendants alcool ont permis le greffage de chaîne de PEG. Cette méthode génère des copolymères en peigne (PEG-g-PLA) possédant de 5 à 50% en poids de PEG, en faisant varier le nombre de chaînes branchées sur un squelette de poly(lactique) (PLA). Les propriétés structurales des NPs produites ont été étudiées par DLS, mesure de charge et MET. Une transition critique se situant autour de 15% de PEG (poids/poids) est observée avec un changement de morphologie, d’une particule solide à une particule molle (“nanoagrégat polymére”). La méthode de greffage ainsi que l’addition probable de chaine de PEG en bout de chaîne principale semblent également avoir un rôle dans les changements observés. L’organisation des chaînes de PEG-g-PLA à la surface a été étudiée par RMN et XPS, méthodes permettant de quantifier la densité de surface en chaînes de PEG. Ainsi deux propriétés clés que sont la résistance à l’agrégation en conditions saline ainsi que la résistance à la liaison aux protéines (étudiée par isothermes d’adsorption et microcalorimétrie) ont été reliées à la densité de surface de PEG et à l’architecture des polymères. Dans une seconde partie de ce travail, le greffage des chaînes de PEG a été réalisé de façon directe par cyclo-adition catalysée par le cuivre de mPEG-N3 sur les groupes pendants alcyne. Cette nouvelle stratégie a été pensée dans le but de comprendre la contribution possible des chaines de PEG greffées à l’extrémité de la chaine de PLA. Cette librairie de PEG-g-PLA, en plus d’être composée de PEG-g-PLA avec différentes densités de greffage, comporte des PEG-g-PLA avec des PEG de différent poids moléculaire (750, 2000 et 5000). Les chaines de PEG sont seulement greffées sur les groupes pendants. Les NPs ont été produites par différentes méthodes de nanoprécipitation, incluant la nanoprécipitation « flash » et une méthode en microfluidique. Plusieurs variables de formulation telles que la concentration du polymère et la vitesse de mélange ont été étudiées afin d’observer leur effet sur les caractéristiques structurales et de surface des NPs. Les tailles et les potentiels de charges sont peu affectés par le contenu en PEG (% poids/poids) et la longueur des chaînes de PEG. Les images de MET montrent des objets sphériques solides et l'on n’observe pas d’objets de type agrégat polymériques, malgré des contenus en PEG comparable à la première bibliothèque de polymère. Une explication possible est l’absence sur ces copolymères en peigne de chaine de PEG greffée en bout de la chaîne principale. Comme attendu, les tailles diminuent avec la concentration du polymère dans la phase organique et avec la diminution du temps de mélange des deux phases, pour les différentes méthodes de préparation. Finalement, la densité de surface des chaînes de PEG a été quantifiée par RMN du proton et XPS et ne dépendent pas de la méthode de préparation. Dans la troisième partie de ce travail, nous avons étudié le rôle de l’architecture du polymère sur les propriétés d’encapsulation et de libération de la curcumine. La curcumine a été choisie comme modèle dans le but de développer une plateforme de livraison de molécules actives pour traiter les maladies du système nerveux central impliquant le stress oxydatif. Les NPs chargées en curcumine, montrent la même transition de taille et de morphologie lorsque le contenu en PEG dépasse 15% (poids/poids). Le taux de chargement en molécule active, l’efficacité de changement et les cinétiques de libérations ainsi que les coefficients de diffusion de la curcumine montrent une dépendance à l’architecture des polymères. Les NPs ne présentent pas de toxicité et n’induisent pas de stress oxydatif lorsque testés in vitro sur une lignée cellulaire neuronale. En revanche, les NPs chargées en curcumine préviennent le stress oxydatif induit dans ces cellules neuronales. La magnitude de cet effet est reliée à l’architecture du polymère et à l’organisation de la NP. En résumé, ce travail a permis de mettre en évidence quelques propriétés intéressantes des copolymères en peigne et la relation intime entre l’architecture des polymères et les propriétés physico-chimiques des NPs. De plus les résultats obtenus permettent de proposer de nouvelles approches pour le design des nanotransporteurs polymériques de molécules actives.

Les effets du dalcetrapib, un inhibiteur de la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP), sur la structure et la fonction des lipoprotéines de haute densité (HDL) dans l’étude dal-PLAQUE2

Introduction : Le dalcetrapib, inhibiteur de la glycoprotéine hydrophobe de transfert des esters de cholestérol (CETP), a été étudié dans le cadre de l’essai clinique de phase II dal-PLAQUE2 (DP2). L’objectif principal est d’étudier l’effet du dalcetrapib après 1 an de traitement sur la structure et la fonction des HDL dans une sous-population de la cohorte DP2. Méthode : Les sujets de la cohorte DP2 ayant une série de mesures de cIMT et des échantillons de plasma et sérum au baseline et à 1 an de traitement furent sélectionnés (379 sujets: 193 du groupe placebo (PCB) et 186 du groupe dalcetrapib (DAL)). Des données biochimiques prédéterminées, le profil des concentrations et tailles des sous-classes de HDL et LDL en résonance magnétique nucléaire (RMN) et 2 mesures de capacité d’efflux de cholestérol (CEC) du sérum ont été explorées. Les données statistiques furent obtenues en comparant les changements à un an à partir du « baseline » avec un ANOVA ou ANCOVA. La procédure normalisée de fonctionnement d’essai d’efflux de cholestérol permet de calculer l’efflux fractionnel (en %) de 3H-cholestérol des lignées cellulaires BHK-ABCA1 (fibroblastes) et J774 (macrophages, voie ABCA1) et HepG2 (hépatocytes, voie SR-BI), vers les échantillons sériques de la cohorte DP2. Résultats : Pour la biochimie plasmatique, un effet combiné des changements d’activité de CETP dans les 2 groupes a causé une réduction de 30% dans le groupe DAL. Après 1 an de traitement dans le groupe DAL, la valeur de HDL-C a augmenté de 35,5% (p < 0,001) et l’apoA-I a augmenté de 14,0% (p < 0,001). Au profil RMN, dans le groupe DAL après 1 an de traitement, il y a augmentation de la taille des HDL-P (5,2%; p < 0,001), des grosses particules HDL (68,7%; p < 0,001) et des grosses particules LDL (37,5%; p < 0,01). Les petites particules HDL sont diminuées (-9,1%; p < 0,001). Il n’y a aucune différence significative de mesure de cIMT entre les deux groupes après 1 an de traitement. Pour la CEC, il y a augmentation significative par la voie du SR-BI et une augmentation via la voie ABCA1 dans le groupe DAL après 1 an de traitement. Conclusion : Après un an de traitement au dalcetrapib, on note une hausse de HDL-C, des résultats plutôt neutres au niveau du profil lipidique par RMN et une CEC augmentée mais trop faible pour affecter la valeur de cIMT chez les échantillons testés.