Rôle de la phospholipase A2 de type V dans le recrutement de leucocytes au foyer inflammatoire

Les phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) font partie d’une grande famille d’enzymes impliquées dans la synthèse d’écosanoïdes, de chimiokines et dans l’expression de molécules d’adhérence. Ce groupe comprend dix isoformes différentes (sPLA2-IB, -IIA, -IIC, -IID, -IIE, -IIF, -III, -V, -X et XII) dont la majorité sont surexprimées en présence de molécules pro-inflammatoires telles que l’interleukine-1β (IL-1 β) et le lipopolysaccharide bactérien (LPS). La sPLA2-IIA fut longtemps considérée comme la principale sPLA2 associée à l’inflammation. Toutefois, un nombre grandissant d’études suggère l’implication d’autres isoformes dans la réponse inflammatoire. Étant donné la similarité structurelle des différentes isoformes de sPLA2, la majorité des inhibiteurs présentement disponibles sont non spécifiques et bloquent simultanément plus d’une sPLA2. De ce fait, encore peu de choses sont connues quant au rôle précis de chacune des sPLA2 dans la réponse inflammatoire. Ayant accès à des souris génétiquement modifiées n’exprimant pas la sPLA2-V (sPLA2-V-/-), nous avons donc investigué le rôle spécifique de la sPLA2-V dans le recrutement leucocytaire induit par le LPS, ainsi que sa capacité à moduler l’expression de certaines molécules d’adhérence. Pour ce faire, nous avons utilisé le modèle inflammatoire de la poche d’air sous-cutanée. L’administration de LPS dans la poche d’air de souris contrôles (WT) entraîne un recrutement leucocytaire important. Cet appel de cellules inflammatoires est cependant significativement diminué chez les souris sPLA2-V-/-. De plus, l’expression des molécules d’adhérence VCAM-1 et ICAM-1 est également diminuée chez les souris sPLA2-V-/- comparativement aux souris WT. Nos résultats démontrent donc le rôle important de la sPLA2-V dans le recrutement leucocytaire et l’expression de molécules d’adhérence induits par le LPS, confirmant ainsi l’implication de cette enzyme dans le processus inflammatoire.

The proprotein convertase PC5/6 is protective against intestinal tumorigenesis: in vivo mouse model

BACKGROUND: The secretory basic amino acid-specific proprotein convertases (PCs) have often been associated with cancer/metastasis. By controlling the cleavage of cancer-associated proteins, PCs play key roles in multiple steps of cancer development. Most analyses of the implication of PCs in cancer/metastasis relied on the use of in vitro overexpression systems or inhibitors that can affect more than one PC. Aside from the role of furin in salivary gland tumorigenesis, no other in vivo genetic model of PC-knockout was reported in relation to cancer development. RESULTS: Since PC5/6 is highly expressed in the small intestine, the present study examined its in vivo role in intestinal tumorigenesis. Analysis of human intestinal tumors at various stages showed a systematic down-regulation of PC5/6 expression. Since gene inactivation of PC5/6 leads to lethality at birth, we generated mice lacking PC5/6 in enterocytes and analyzed the impact of the presence or absence of this PC in the mouse ApcMin/+ model that develops numerous adenocarcinomas along the intestinal tract. This resulted in viable mice with almost no expression of PC5/6 in small intestine, but with no overt phenotype. The data showed that by themselves ApcMin/+ tumors express lower levels of PC5/6 mRNA, and that the lack of PC5/6 in enterocytes results in a significantly higher tumor number in the duodenum, with a similar trend in other intestinal segments. Finally, the absence of PC5/6 is also associated with a premature mortality of ApcMin/+ mice. CONCLUSION: Overall, these data suggest that intestinal PC5/6 is protective towards tumorigenesis, especially in mouse duodenum, and possibly in human colon.

Regulation of cholesterol intake by the corpus luteum

Studies were funded by Colegio de Postgraduados, México. CONACyT, México. SRE, México. Ministère de l’Éducation du Québec, University of Montreal and an Operating Grant to B.D. Murphy from the Canadian Institutes of Health Research.

Contribution de la Glycoprotéine M dans la Sortie de HSV-1

Le Virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1) est un agent infectieux qui cause l’herpès chez une grande proportion de la population mondiale. L’herpès est généralement considéré comme une maladie bénigne dont la forme la plus commune est l'herpès labial (communément appelé « bouton de fièvre »), mais elle peut se révéler très sérieuse et causer la cécité et l’encéphalite, voir létale dans certain cas. Le virus persiste toute la vie dans le corps de son hôte. Jusqu'à présent, aucun traitement ne peut éliminer le virus et aucun vaccin n’a été prouvé efficace pour contrôler l’infection herpétique. HSV-1 est un virus avec un génome d’ADN bicaténaire contenu dans une capside icosaèdrale entourée d’une enveloppe lipidique. Treize glycoprotéines virales se trouvent dans cette enveloppe et sont connues ou supposées jouer des rôles distincts dans différentes étapes du cycle de réplication viral, incluant l'attachement, l'entrée, l’assemblage, et la propagation des virus. La glycoprotéine M (gM) qui figure parmi ces glycoprotéines d’enveloppe, est la seule glycoprotéine non essentielle mais est conservée dans toute la famille herpesviridae. Récemment, l’homologue de gM dans le Pseudorabies virus (PRV), un autre herpesvirus, a été impliqué dans la phase finale de l’assemblage (i.e. l’enveloppement cytoplasmique) au niveau du réseau trans-Golgi (TGN) en reconnaissant spécifiquement des protéines tégumentaires et d’autres glycoprotéines d’enveloppe ([1]). Toutefois, il a été proposé que cette hypothèse ne s’applique pas pour le HSV-1 ([2]). De plus, contrairement à la localisation au TGN dans les cellules transfectées, HSV-1 gM se localise dans la membrane nucléaire et sur les virions périnucléaires durant une infection. L’objectif du projet présenté ici était d’éclaircir la relation de la localisation et la fonction de HSV-1 gM dans le contexte d’une infection. Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons tout abord un mécanisme spécifique de ciblage nucléaire de HSV-1 gM. En phase précoce d’une infection, gM est ciblée à la membrane nucléaire d'une manière virus ii dépendante. Cela se produit avant la réorganisation du TGN normalement induite par l’infection et avant que gM n’entre dans la voie de sécrétion. Ce ciblage nucléaire actif et spécifique de gM ne semble pas dépendre des plusieurs des partenaires d’interaction proposés dans la littérature. Ces données suggèrent que la forme nucléaire de gM pourrait avoir un nouveau rôle indépendant de l’enveloppement final dans le cytoplasme. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous avons concentré nos efforts sur le rôle de gM dans l’assemblage du virus en phase tardive de l’infection et en identifiant un domaine critique de gM. Nos résultats mettent en valeur l’importance du domaine carboxyl-terminal cytoplasmique de gM dans le transport de gM du réticulum endoplasmique (RE) à l’appareil de Golgi, dans l’enveloppement cytoplasmique et la propagation intercellulaire du virus. Ainsi, l’export du RE de gM a été complètement compromis dans les cellules transfectées exprimant un mutant de gM dépourvu de sa région C-terminale. La délétion la queue cytoplasmique de gM cause une réduction légère du titre viral et de la taille des plaques. L'analyse de ces mutants par microscopie électronique a démontré une accumulation des nucléocapsides sans enveloppe dans le cytoplasme par rapport aux virus de type sauvage. Étrangement, ce phénotype était apparent dans les cellules BHK mais absent dans les cellules 143B, suggérant que la fonction de gM dépende du type cellulaire. Finalement, le criblage de partenaires d’interaction du domaine C-terminal de gM identifiés par le système de double-hybride nous a permis de proposer plusieurs candidats susceptibles de réguler la fonction de gM dans la morphogénèse et la propagation de virus.

Études sur la dérégulation des cytokines et des cellules Natural Killer chez les patients infectés par le VIH-1

La prolifération, la différenciation ainsi que les fonctions des cellules du système immunitaire sont contrôlées en partie par les cytokines. Lors de l’infection par le VIH-1, les défauts observés dans les fonctions, la maintenance, ainsi que la consistance des cellules du système immunitaire sont en large partie attribués à une production altérée des cytokines et à un manque d’efficacité au niveau de leurs effets biologiques. Durant ces études, nous nous sommes intéréssés à la régulation et aux fonctions de deux cytokines qui sont l’IL-18 et l’IL-21. Nous avons observé une corrélation inversée significative entre les concentrations sériques d’IL-18 et le nombre des cellules NK chez les patients infectés par le VIH-1. Nos expériences in vitro ont démontré que cette cytokine induit l’apoptose des cellules NK primaires et que cette mort peut être inhibée par des anticorps neutralisants spécifiques pour FasL et TNF-α. Cette mort cellulaire est due à l’expression de FasL sur les cellules NK et à la production de TNF-α par ces cellules. L’IL-18 augmente aussi la susceptibilité à la mort des cellules NK par un stimulus pro-apoptotique, en diminuant l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL. Nous démontrons aussi que, contrairement à l’IL-18, les niveaux d’IL-18BP sont plus faibles dans les sérum de patients infectés. Ceci résulte sur une production non coordonnée de ces deux facteurs, aboutissant à des niveaux élevés d’IL-18 libre et biologiquement active chez les patients infectés. L’infection de macrophages in vitro induit la production d’IL-18 et réduit celle d’IL-18BP. De plus, l’IL-10 et le TGF-β, dont les concentrations sont élevées chez les patients infectés, réduisent la production d’IL-18BP par les macrophages in vitro. Finalement, nous démontrons que l’IL-18 augmente la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Les niveaux élevés d’IL-18 libres et biologiquement actives chez les patients infectés contribuent donc à l’immuno-pathogénèse induite par le VIH-1 en perturbant l’homéostasie des cellules NK ainsi qu’en augmentant la réplication du virus chez les patients. Ces études suggèrent donc la neutralisation des effets néfastes de l’IL-18 en utilisant son inhibiteur naturel soit de l’IL-18BP exogène. Ceci permettrait de moduler l’activité de l’IL-18 in vivo à des niveaux souhaitables. L’IL-21 joue un rôle clef dans le contrôle des infections virales chroniques. Lors de ces études, nous avons déterminé la dynamique de la production d’IL-21 lors de l’infection par le VIH-1 et sa conséquence sur la survie des cellules T CD4+ et la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1. Nous avons démontré que sa production est compromise tôt au cours de l’infection et que les concentrations d’IL-21 corrèlent avec le compte de cellules T CD4+ chez les personnes infectées. Nos études ont démontré que le traitement antirétroviral restaure partiellement la production d’IL-21. De plus, l’infection par le VIH-1 de cellules T CD4+ humaines inhibe sa production en réduisant l’expression du facteur de transcription c-Maf. Nous avons aussi démontré que la fréquence des cellules T CD4+ spécifiques au VIH-1 qui produisent de l’IL-21 est réduite chez les patients virémiques. Selon nos résultats, l’IL-21 empêche l’apoptose spontanée des cellules T CD4+ de patients infectés et l’absence d’IL-21 réduit la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1 chez ces patients. Nos résultats démontrent que l'IL-21R est exprimé de façon égale sur tous les sous-types de cellules NK chez les donneurs sains et chez les patients infectés. L’IL-21 active les protéines STAT-3, MAPK et Akt afin d'augmenter les fonctions effectrices des cellules NK. L'activation de STAT-3 joue un rôle clef dans ces fonctions avec ou sans un traitement avec de l'IL-21. L'IL-21 augmente l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, augmente la viabilité des cellules NK, mais ne possède aucun effet sur leur prolifération. Nous démontrons de plus que l'IL-21 augmente l'ADCC, les fonctions sécrétrices et cytotoxiques ainsi que la viabilité des cellules NK provenant de patients chroniquement infectés par le VIH-1. De plus, cette cytokine semble présenter ces effets sans augmenter en contrepartie la réplication du VIH-1. Elle permet donc d'inhiber la réplication virale lors de co-cultures autologues de cellules NK avec des cellules T CD4+ infectées d'une manière dépendante à l'expression de perforine et à l'utilisation de la protéine LFA-1. Les niveaux d’IL-21 pourraient donc servir de marqueurs biologiques pour accompagner les informations sur le taux de cellules T CD4+ circulantes en nous donnant des informations sur l’état de fonctionnalité de ce compartiment cellulaire. De plus, ces résultats suggèrent l’utilisation de cette cytokine en tant qu’agent immunothérapeutique pour restaurer les niveaux normaux d’IL-21 et augmenter la réponse antivirale chez les patients infectés par le VIH-1.

Importance du stress oxydant dans le diabète secondaire à la fibrose kystique

Introduction : La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique mortelle qui touche principalement les poumons et l’appareil digestif. Elle est causée par des mutations sur le gène codant la protéine du CFTR, un canal chlore exprimé à la surface des organes à sécrétions exocrines. Les fonctions principales du CFTR sont les suivantes: 1) la régulation de l’homéostasie ionique des sécrétions; 2) le maintien de la fluidité des sécrétions et; 3) le transport du glutathion. Le dysfonctionnement de la protéine du CFTR rend les sécrétions visqueuses et épaisses, avec des phénomènes obstructifs qui sont responsables de l’apparition de fibrose au sein des divers organes. Dans le poumon, l’accumulation du mucus épais rend difficile l’élimination des bactéries inhalées, ces dernières établissent alors des cycles d’infection qui endommagent les tissus pulmonaires à travers des processus inflammatoires. Dans le tube digestif, le mucus épais entrave l’absorption d’une quantité suffisante d’éléments nutritifs incluant les principaux antioxydants. L’infection et l’inflammation des poumons favorisent l’apparition d’un stress oxydant qui détruit davantage le tissu pulmonaire. Le déficit en glutathion, probablement lié au dysfonctionnement de la proteine du CFTR, et la malabsorption des antioxydants favorisent l’augmentation du stress oxydant. Une augmentation du stress oxydant a été démontrée au cours du diabète et les produits dérivés du stress oxydant ont été mis en évidence dans la pathogenèse des complications associées au diabète. Une augmentation du stress oxydant a également été montrée durant la FK, mais sans pour autant expliquer la survenue du diabète secondaire à la FK dont la prévalence augmente sans cesse. Objectifs : Notre étude consiste à évaluer l’impact du stress oxydant dans les anomalies du métabolisme du glucose durant la FK, et à étudier son rôle dans les mécanismes de sécrétion d’insuline induite par le glucose. Pour ce faire, nous avons déterminé l’impact de la peroxydation lipidique sur la tolérance au glucose et la défense antioxydante globale, in vivo, chez des patients FK présentant une altération du métabolisme du glucose. De plus, nous avons évalué le rôle du stress oxydatif sur la synthèse et la sécrétion d’insuline, in vitro, dans les cellules pancréatiques βTC-tet. Résultats : Dans l’étude in vivo, nous avons démontré que l’intolérance au glucose et le diabète étaient associés à une augmentation de la peroxydation lipidique, traduite par la hausse des niveaux sanguins de 4-hydroxynonenal lié aux protéines (HNE-P). La défense antioxydante évaluée par la mesure du glutathion sanguin démontre que les niveaux de glutathion oxydé restent également élevés avec l’intolérance au glucose. Dans l’étude in vitro, nos résultats ont mis en évidence que l’exposition de la cellule βTC-tet au stress oxydant: 1) induit un processus de peroxydation lipidique; 2) augmente la sécrétion basale d’insuline; 3) diminue la réponse de la sécrétion d’insuline induite par le glucose; et 4) n’affecte que légèrement la synthèse de novo de l’insuline. Nous avons aussi démontré que les cellules pancréatiques βTC-tet résistaient au stress oxydant en augmentant leur synthèse en glutathion tandis que la présence d’un antioxydant exogène pouvait restaurer la fonction sécrétoire de ces cellules. Conclusion : Le stress oxydant affecte le fonctionnement de la cellule pancréatique β de plusieurs manières : 1) il inhibe le métabolisme du glucose dont les dérivés sont nécessaires à la sécrétion d’insuline; 2) il active la voie de signalisation impliquant les gènes pro-inflammatoires et; 3) il affecte l’intégrité membranaire en induisant le processus de peroxydation lipidique.

The proprotein convertase PC5/6 is protective against intestinal tumorigenesis: In vivo mouse model

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Structures photoniques à base de nanocristaux de silicium

Il y a des indications que les nanocristaux de silicium (nc-Si) présentent un gain optique qui est potentiellement assez grand pour permettre l'amplification optique dans la gamme de longueurs d'ondes où une photoluminescence (PL) intense est mesurée (600- 1000 nm). Afin de fabriquer des cavités optiques, nous avons implantés des morceaux de silice fondue avec des ions de Si pour former une couche de nc-Si d'une épaisseur d'environ 1 μm. Le Si a été implanté à quatre énergies comprises entre 1 MeV et 1,9 MeV de manière à obtenir une concentration atomique de Si en excès variant entre 25% et 30%. Les pièces ont été flanquées de miroirs diélectriques composés de filtres interférentiels multicouches. Sur une plage de longueurs d'ondes d'environ 200 nm de large, un filtre réfléchit près de 100%, alors que l'autre a une réflexion moyenne d'environ 90%. Nous avons mesuré et comparé les spectres de PL de trois échantillons: le premier sans miroir, le second avec des filtres réfléchissant autour de 765 nm (entre 700 nm et 830 nm), et la troisième avec des filtres agissant autour de 875 nm (entre 810 nm et 940 nm). Lorsque les échantillons sont excités avec un laser pulsé à 390 nm, des mesures de photoluminescence résolue dans le temps (PLT) révèlent des taux de décroissance plus rapides en présence de miroirs dans le domaine de longueurs d'onde où ceux-ci agissent comparé aux échantillons sans miroirs. Aussi, l'intensité PL en fonction de la fluence d'excitation montre une augmentation plus rapide de la présence de miroirs, même si celle-ci reste sous-linéaire. Nous concluons que de l'émission stimulée pourrait être présente dans la cavité optique, mais sans dominer les autres mécanismes d'émission et de pertes.

Étude de l'association supramoléculaire à l'état solide des fullerènes C60 et C70 avec des dérivés triptycényles fonctionnalisés

Le fullerène C60 est une molécule sphérique composée exclusivement d'atomes de carbone. Ce composé possède une surface aromatique convexe homogène et peut s'associer, entre autres, avec des molécules possédant des surfaces aromatiques par des interactions non-covalentes. Le triptycène est une molécule en forme de "Y" qui possède des surfaces aromatiques convexes. Cette molécule possède l'habileté de s'associer avec le C60 par des interactions de type π qui sont amplifiées par la complémentarité des surfaces concaves et convexes impliquées dans les arrangements cristallins. Nous avons synthétisé des dérivés triptycényles portant des groupements fonctionnels aux extrémités des bras de ce noyau de façon à étendre les cavités disponibles pour interagir avec le C60. En effet, nous avons découvert que les atomes de chlore, de brome et d'iode ainsi que les groupements méthyle permettent d'étendre les surfaces disponibles pour interagir avec les fullerènes C60 et C70. Nous avons étudié les associations entre les dérivés triptycényles et les fullerènes par l'analyse des structures cristallographiques résolues par diffraction des rayons-X. De plus, nous avons étudié les associations entre les molécules considérées par l'analyse des surfaces d'Hirshfeld entourant les fullerènes. Découlant de ces études, l'effet d'amplification des atomes de chlore, de brome et d'iode ainsi que les groupements méthyle a été employé pour identifier de nouveaux solvants aptes à solubiliser efficacement le C60.

Actin cytoskeleton regulates pollen tube growth and tropism

La fertilisation chez les plantes dépend de la livraison des cellules spermatiques contenues dans le pollen à l’ovule. Au contact du stigmate, le grain de pollen s’hydrate et forme une protubérance, le tube pollinique, chargé de livrer les noyaux spermatiques à l’ovule. Le tube pollinique est une cellule à croissance rapide, anisotrope et non autotrophe; ainsi tout au long de sa croissance à travers l’apoplaste du tissu pistillaire, le tube pollinique puise ses sources de carbohydrates et de minéraux du pistil. Ces éléments servent à la synthèse des constituants de la paroi qui seront acheminés par des vésicules de sécrétion jusqu’à l’apex du tube. Ce dernier doit aussi résister à des pressions mécaniques pour maintenir sa forme cylindrique et doit répondre à différents signaux directionnels pour pouvoir atteindre l’ovule. Mon projet de doctorat était de comprendre le rôle du cytosquelette dans la croissance anisotrope du tube pollinique et d’identifier les éléments responsables de sa croissance et de son guidage. Le cytosquelette du tube pollinique est composé des microfilaments d’actine et des microtubules. Pour assurer une bonne croissance des tubes polliniques in vitro, les carbohydrates et les éléments de croissance doivent être ajoutés au milieu à des concentrations bien spécifiques. J’ai donc optimisé les conditions de croissance du pollen d’Arabidopsis thaliana et de Camellia japonica qui ont été utilisés avec le pollen de Lilium longiflorum comme modèles pour mes expériences. J’ai développé une méthode rapide et efficace de fixation et de marquage du tube pollinique basée sur la technologie des microondes. J’ai aussi utilisé des outils pharmacologiques, mécaniques et moléculaires couplés à différentes techniques de microscopie pour comprendre le rôle du cytosquelette d’actine lors de la croissance et le tropisme du tube pollinique. J’ai trouvé que le cytosquelette d’actine et plus précisément l’anneau d’actine localisé dans la partie sub-apicale du tube est fortement impliqué dans la croissance et le maintien de l’architecture du tube à travers le contrôle de la livraison des vésicules de sécrétion. J’ai construit une chambre galvanotropique qui peut être montée sur un microscope inversé et qui sert à envoyer des signaux tropistiques bien précis à des tubes polliniques en croissance. J’ai trouvé que les filaments d’actine sont impliqués dans la capacité du tube pollinique à changer de direction. Ce comportement tropistique dépend de la concentration du calcium dans le milieu de croissance et du flux de calcium à travers des canaux calciques. Le gradient de calcium établi dans le tube pollinique affecte l’activité de certaines protéines qui se lient à l’actine et dont le rôle est la réorganisation des filaments d’actine. Parmi ces protéines, il y a celles de dépolymérisation de l’actine (ADF) dont deux spécifiquement exprimées dans le gamétophyte mâle d’Arabidopsis (ADF7 et ADF10). Par marquage avec des proteins fluorescents, j’ai trouvé que l’ADF7 et l’ADF10 ont des expressions différentielles pendant la microsporogenèse et la germination et croissance du tube pollinique et qu’elles partagent entre elles des rôles importants durant ces différents stades.

Identification de nouveaux partenaires protéiques des récepteurs couplés aux protéines G contrôlant leur transport du reticulum endoplasmique à la membrane plasmique

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifiée des familles de protéines localisées à la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux à l’intérieur des cellules. D’intenses recherches effectuées au cours des trente dernières années ont mené à l’identification de dizaines de protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant la signalisation, la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus régulant l’activité des récepteurs à partir de la membrane plasmique, les mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu’à la surface cellulaire sont très peu caractérisés. Une meilleure compréhension de ces processus nécessite l’identification de la machinerie protéique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protéomique basé sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure d’interactions protéiques dans les cellules vivantes, a mené à l’identification de plusieurs nouvelles protéines localisées dans la voie de sécrétion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthèse, du repliement adéquat et du transport à la membrane plasmique des récepteurs, il est très probable qu’elles soient impliquées dans le contrôle de l’expression des RCPGs à la surface cellulaire. La caractérisation de l’homologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intéracteur des RCPGs identifié dans le crible, a démontré que cette protéine localisée dans les compartiments précoces de la voie de sécrétion (RE et ERGIC) interagit de façon sélective avec les RCPGs. De plus, la suppression de l’expression endogène de cette protéine préalablement non-caractérisée, diminue le transport à la membrane plasmique d’un récepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement l’export des RCPGs du RE. Ceci est supporté par l’observation que la surexpression de CNIH4 à de faibles niveaux favorise la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons également pu démontrer que CNIH4 est associée à la protéine Sec23, une des composantes de l’enveloppe des vésicules COPII qui sont responsables du transport des protéines du RE vers le Golgi, suggérant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des récepteurs dans ces vésicules. La surexpression de CNIH4 à de très hauts niveaux provoque également la rétention intracellulaire des récepteurs. Cet effet dominant négatif pourrait être causé par la titration d’un autre facteur d’export des RCPGs. Une deuxième étude a permis de révéler que la protéine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intéracteur des RCPGs également identifié dans le crible, interagit sélectivement avec les récepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protéine aux fonctions précédemment inconnues, rétablit le transport normal d’un récepteur en présence de CNIH4 surexprimée. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacité de CNIH4 à augmenter la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggérant que ces deux protéines forment un complexe régulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thèse, de nouvelles protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant leur expression à la membrane plasmique ont donc été identifiées, permettant une meilleure compréhension des mécanismes régulant le transport des récepteurs du RE à la surface cellulaire.

Rôles du stress du réticulum endoplasmique et de l'immunité innée dans l'inhibition de la transcription du gène de l'insuline : étude du facteur de transcription ATF6 et du récepteur TLR4

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance des tissus périphériques à l’action de l’insuline et par une insuffisance de la sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas. Différents facteurs tels que le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’immunité innée affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Toutefois, leur implication dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline demeure imprécise. Le but de cette thèse était d’identifier et de caractériser le rôle du stress du RE et de l’immunité innée dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline. Les cellules β-pancréatiques ont un RE très développé, conséquence de leur fonction spécialisée de biosynthèse et de sécrétion d’insuline. Cette particularité les rend très susceptible au stress du RE qui se met en place lors de l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE. Nous avons montré qu’ATF6 (de l’anglais, activating transcription factor 6), un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress du RE, lie directement la boîte A5 de la région promotrice du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans isolés de rat. Nous avons également montré que la surexpression de la forme active d’ATF6α, mais pas ATF6β, réprime l’activité du promoteur de l’insuline. Toutefois, la mutation ou l’absence de la boîte A5 ne préviennent pas l’inhibition de l’activité promotrice du gène de l’insuline par ATF6. Ces résultats montrent qu’ATF6 se lie directement au promoteur du gène de l’insuline, mais que cette liaison ne semble pas contribuer à son activité répressive. Il a été suggéré que le microbiome intestinal joue un rôle dans le développement du DT2. Les patients diabétiques présentent des concentrations plasmatiques élevées de lipopolysaccharides (LPS) qui affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Nous avons montré que l’exposition aux LPS entraîne une réduction de la transcription du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans de rats, de souris et humains. Cette répression du gène de l’insuline par les LPS est associée à une diminution des niveaux d’ARNms de gènes clés de la cellule β-pancréatique, soit PDX-1 (de l’anglais, pancreatic duodenal homeobox 1) et MafA (de l’anglais, mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). En utilisant un modèle de souris déficientes pour le récepteur TLR4 (de l’anglais, Toll-like receptor), nous avons montré que les effets délétères des LPS sur l’expression du gène de l’insuline sollicitent le récepteur de TLR4. Nous avons également montré que l’inhibition de la voie NF-kB entraîne une restauration des niveaux messagers de l’insuline en réponse à une exposition aux LPS dans les îlots de Langerhans de rat. Ainsi, nos résultats montrent que les LPS inhibent le gène de l’insuline dans les cellules β-pancréatiques via un mécanisme moléculaire dépendant du récepteur TLR4 et de la voie NF-kB. Ces observations suggèrent ainsi un rôle pour le microbiome intestinal dans la fonction de la cellule β du pancréas. Collectivement, ces résultats nous permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la répression du gène de l'insuline en réponse aux divers changements survenant de façon précoce dans l’évolution du diabète de type 2 et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui permettraient de prévenir ou ralentir la détérioration de l'homéostasie glycémique au cours de cette maladie, qui affecte plus de deux millions de Canadiens.

La sécrétion de la protéine Tau : nouveau mécanisme de propagation de la pathologie de Tau dans la maladie d'Alzheimer

Tau est une protéine associée aux microtubules enrichie dans l’axone. Dans la maladie d’Alzheimer, Tau devient anormalement hyperphosphorylée, s’accumule dans le compartiment somato-dendritique et s’agrège pour former des enchevêtrements neurofibrillaires (NFTs). Ces NFTs se propagent dans le cerveau dans un ordre bien précis. Ils apparaissent d’abord dans le cortex transenthorinal pour ensuite se propager là où ces neurones projettent, c’est-à-dire au cortex entorhinal. Les NFTs s’étendent ensuite à l’hippocampe puis à différentes régions du cortex et néocortex. De plus, des études récentes ont démontré que la protéine Tau peut être sécrétée par des lignées neuronales et que lorsqu’on injecte des agrégats de Tau dans un cerveau de souris, ceux-ci peuvent pénétrer dans les neurones et induire la pathologie de Tau dans le cerveau. Ces observations ont mené à l’hypothèse que la protéine Tau pathologique pourrait être sécrétée par les neurones, pour ensuite être endocytée par les cellules avoisinantes et ainsi propager la maladie. L’objectif de la présente étude était donc de prouver la sécrétion de la protéine Tau par les neurones et d’identifier par quelle voie elle est secrétée. Nos résultats ont permis de démontrer que la protéine Tau est sécrétée par des neurones corticaux de souris de type sauvage ainsi que dans un modèle de surexpression dans des cellules HeLa et PC12. Nos résultats indiquent que la sécrétion de Tau se ferait par les autophagosomes. Finalement, nous avons démontré que la protéine Tau sécrétée est déphosphorylée et clivée par rapport à la protéine Tau intracellulaire non sécrétée.

Rôle de l'estérification des acides gras dans la régulation de la sécrétion d'insuline et le stress métabolique induits par le glucose

Le diabète est une maladie chronique de l’homéostasie du glucose caractérisée par une hyperglycémie non contrôlée qui est le résultat d’une défaillance de la sécrétion d’insuline en combinaison ou non avec une altération de l’action de l’insuline. La surnutrition et le manque d’activité physique chez des individus qui ont des prédispositions génétiques donnent lieu à la résistance à l’insuline. Pendant cette période dite de compensation où la concentration d’acides gras plasmatiques est élevée, l’hyperinsulinémie compense pleinement pour la résistance à l’insuline des tissus cibles et la glycémie est normale. Le métabolisme du glucose par la cellule pancréatique bêta entraîne la sécrétion d’insuline. Selon le modèle classique de la sécrétion d’insuline induite par le glucose, l’augmentation du ratio ATP/ADP résultant de la glycolyse et de l’oxydation du glucose, induit la fermeture des canaux KATP-dépendant modifiant ainsi le potentiel membranaire suivi d’un influx de Ca2+. Cet influx de Ca2+ permet l’exocytose des granules de sécrétion contenant l’insuline. Plusieurs nutriments comme les acides gras sont capables de potentialiser la sécrétion d’insuline. Cependant, le modèle classique ne permet pas d’expliquer cette potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Pour expliquer l’effet potentialisateur des acides gras, notre laboratoire a proposé un modèle complémentaire où le malonyl-CoA dérivé du métabolisme anaplérotique du glucose inhibe la carnitine palmitoyltransférase-1, l’enzyme qui constitue l’étape limitante de l’oxydation des acides gras favorisant ainsi leur estérification et donc la formation de dérivés lipidiques signalétiques. Le modèle anaplérotique/lipidique de la sécrétion d'insuline induite par le glucose prédit que le malonyl-CoA dérivé du métabolisme du glucose inhibe la bêta-oxydation des acides gras et augmente la disponibilité des acyl-CoA ou des acides gras non-estérifiés. Les molécules lipidiques agissant comme facteurs de couplage du métabolisme des acides gras à l'exocytose d'insuline sont encore inconnus. Des travaux réalisés par notre laboratoire ont démontré qu’en augmentant la répartition des acides gras vers la bêta-oxydation, la sécrétion d’insuline induite par le glucose était réduite suggérant qu’un des dérivés de l’estérification des acides gras est important pour la potentialisation sur la sécrétion d’insuline. En effet, à des concentrations élevées de glucose, les acides gras peuvent être estérifiés d’abord en acide lysophosphatidique (LPA), en acide phosphatidique (PA) et en diacylglycérol (DAG) et subséquemment en triglycérides (TG). La présente étude a établi l’importance relative du processus d’estérification des acides gras dans la production de facteurs potentialisant la sécrétion d’insuline. Nous avions émis l’hypothèse que des molécules dérivées des processus d’estérification des acides gras (ex : l’acide lysophosphatidique (LPA) et le diacylglycerol (DAG)) agissent comme signaux métaboliques et sont responsables de la modulation de la sécrétion d’insuline en présence d’acides gras. Afin de vérifier celle-ci, nous avons modifié le niveau d’expression des enzymes clés contrôlant le processus d’estérification par des approches de biologie moléculaire afin de changer la répartition des acides gras dans la cellule bêta. L’expression des différents isoformes de la glycérol-3-phosphate acyltransférase (GPAT), qui catalyse la première étape d’estérification des acides gras a été augmenté et inhibé. Les effets de la modulation de l’expression des isoenzymes de GPAT sur les processus d’estérifications, sur la bêta-oxydation et sur la sécrétion d’insuline induite par le glucose ont été étudiés. Les différentes approches que nous avons utilisées ont changé les niveaux de DAG et de TG sans toutefois altérer la sécrétion d’insuline induite par le glucose. Ainsi, les résultats de cette étude n’ont pas associé de rôle pour l’estérification de novo des acides gras dans leur potentialisation de la sécrétion d’insuline. Cependant, l’estérification des acides gras fait partie intégrante d’un cycle de TG/acides gras avec sa contrepartie lipolytique. D’ailleurs, des études parallèles à la mienne menées par des collègues du laboratoire ont démontré un rôle pour la lipolyse et un cycle TG/acides gras dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Parallèlement à nos études des mécanismes de la sécrétion d’insuline impliquant les acides gras, notre laboratoire s’intéresse aussi aux effets négatifs des acides gras sur la cellule bêta. La glucolipotoxicité, résultant d’une exposition chronique aux acides gras saturés en présence d’une concentration élevée de glucose, est d’un intérêt particulier vu la prépondérance de l’obésité. L’isoforme microsomal de GPAT a aussi utilisé comme outil moléculaire dans le contexte de la glucolipotoxicité afin d’étudier le rôle de la synthèse de novo de lipides complexes dans le contexte de décompensation où la fonction des cellules bêta diminue. La surexpression de l’isoforme microsomal de la GPAT, menant à l’augmentation de l’estérification des acides gras et à une diminution de la bêta-oxydation, nous permet de conclure que cette modification métabolique est instrumentale dans la glucolipotoxicité.

Caractérisation et délétion de tous les systèmes d'adhésion connus de Salmonella enterica sérovar Typhi

Les fimbriae sont des structures protéiques extracellulaires retrouvées chez une vaste diversité de bactéries. Ces structures ont fait l’objet de nombreuses études et sont maintenant reconnus pour leur implication dans l’adhésion et l’invasion aux cellules eucaryotes, mais aussi dans la production de biofilms. Ils sont groupés selon leur voie de sécrétion. Certains utilisent une machinerie spécifique et individuelle, c’est le cas des pili de type IV, tandis que d’autres utilisent la voie de sécrétion générale suivit d’une voie spécifique telle que la voie du chaperon-placier (« Chaperon Usher Pathway ») (fimbriae CUP) ou la voie de nucléation précipitation (« nucleation precipitation pathway ») (Curli). Malgré toutes les connaissances actuelles concernant les fimbriae, très peu d’informations sont disponibles quant aux fimbriae de Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi). Ce pathogène unique à l’homme est l’agent étiologique de la fièvre typhoïde. Puisque les fimbriae sont reconnus pour être impliqués dans l’adaptation à l’hôte, nous avons décidé d’étudier davantage l’arsenal fimbriaire de S. Typhi, dans l’espoir d’identifier des facteurs de virulence uniques à S. Typhi et impliqués dans la ségrégation de l’hôte. La souche S. Typhi ISP1820 possède 14 opérons codant pour des systèmes d’adhésion, mais plusieurs contiennent des pseudogènes et leur expression n’a jamais été observée in vitro. Afin d’étudier les systèmes d’adhésion de S. Typhi, nous avons supprimé chaque opéron du génome individuellement et cumulativement à l’aide une technique de mutagénèse par échange allélique. Ainsi, nous avons testé chaque mutant individuel et la souche mutante pour tous les systèmes d’adhésion dans plusieurs essais tels que des infections de cellules épithéliales et de macrophages, de mobilité et de formation de biofilm. Nous avons aussi évalué l’expression des fimbriae lors de différentes conditions de croissance en laboratoire par RT-PCR. Tous les tests réalisés nous ont permis de découvrir que plusieurs opérons fimbriaires de S. Typhi sont opérationnels et utilisés pour différentes fonctions par la bactérie.