Suppression of long-branch attraction artefacts in the animal phylogeny using a site-heterogeneous model

Affiliation: Département de Biochimie, Université de Montréal

Couplage entre les régions IIS4-S5 et IIS6 lors de l’activation du canal calcique CaV2.3

Les canaux calciques dépendants du voltage CaV font partie de la famille structurale des canaux ioniques à 6 segments transmembranaires. Tout comme les canaux potassiques Kv, les canaux CaV possèdent une série de résidus chargés dans l’hélice S4 de chaque domaine ou sous-unité qui conférerait à la protéine une sensibilité aux changements de voltage. De plus les hélices S6 tapissent la paroi du pore et forment la porte d’activation de la protéine. Comment le mouvement des hélices S4 se traduit par l’ouverture de la porte d’activation des hélices S6 demeure une question encore non résolue. Suite à la publication de la structure cristalline du canal Kv1.2 en 2005, le groupe de MacKinnon a proposé que le mouvement des hélices S4 est mécaniquement couplé à la porte d’activation S6 à travers le glissement de l’hélice amphiphile S4-S5 selon un mécanisme nommé couplage électromécanique (Long et al. 2005b). Dans le but de déterminer si la région S4-S5 joue un rôle dans l’activation du canal calcique CaV2.3, nous avons étudié, par la méthode d’analyse cyclique de mutations doubles (« Double Mutant Cycle Analysis », (Horovitz 1996)), le couplage entre la boucle S4-S5 et l’hélice S6 du domaine II de ce canal. Les mesures d’énergies d’activation, ΔGact, obtenues en présence des sous-unités auxiliaires CaVα2δ et CaVβ3 ont affiché un couplage significatif pour l’activation entre les paires de résidus V593G/L699G, V593G/A700G, V593G/A702G, S595G/V703G L596G/L699G, L596G/A700G, L596G/I701G, L596G/A702G, L596G/V703G, L596G/D704G, M597G/I701G, et S602G/I701G. Aucune de ces paires de résidus n’a affiché de couplage lors de l’inactivation, suggérant que les effets observés sont spécifiques au mécanisme d’activation. Mis ensemble, ces résultats suggèrent que la boucle IIS4-S5 et l’hélice IIS6 interagissent et jouent un rôle déterminant dans l’activation de CaV2.3.

Influence des glycines du lien S4-S5 sur le couplage électromécanique des canaux ioniques dépendants du voltage

Les canaux potassiques dépendants du voltage sont formés de quatre sous-unités, chacune possédant six segments transmembranaires (S1-S6) et une boucle (p-loop) qui se trouve entre le cinquième et le sixième segment au niveau du pore. Il est connu que le segment senseur du voltage (S1-S4) subit un mouvement lorsque le potentiel membranaire change. Pour ouvrir le canal, il est nécessaire de transférer l'énergie du senseur du voltage (généré par le mouvement des charges positives de S4) au pore. Le mécanisme exact de ce couplage électromécanique est encore sous étude. Un des points de liaison entre le senseur de voltage et le pore est le lien physique fait par le segment S4-S5 (S45L). Le but de cette étude est de déterminer l'influence de la flexibilité du segment S45L sur le processus de couplage. Dans le S45L, trois glycines sont distribuées dans des positions différentes. Elles sont responsables de la flexibilité des hélices-alpha. Ces glycines (mais pas leurs positions exactes) sont conservées pour tous les canaux potassiques dépendants de potentiel. En utilisant la technique de mutagènes dirigé, la glycine a été remplacée dans chacune de ces différentes positions par une alanine et dans une deuxième étape, par une proline (pour introduire un angle dans l'hélice). Pour étudier le comportement des canaux dans cette nouvelle conformation, on a appliqué la technique de « patch clamp » pour déterminer les effets lors de l'ouverture du pore (courant ionique). Avec le « cut-open oocyte voltage-clamp », nous avons étudié les effets sur le mouvement du senseur de voltage (courant “gating”) et la coordination temporelle avec l'ouverture du pore (courant ionique). Les données ont montré qu’en réduisant la flexibilité dans le S45L, il faut avoir plus d'énergie pour faire ouvrir le canal. Le changement pour une proline suggère que le mouvement du senseur est indépendant du pore pendant l'ouverture du canal.