La modulation transcriptionnelle du neuropeptide enképhaline par les récepteurs nucléaires Nur77 et RXRγ

Certains neuropeptides (enképhaline et neurotensine) sont des modulateurs du système dopaminergique. Chez les rongeurs, le traitement avec l’antipsychotique typique halopéridol (antagoniste des récepteurs D2), augmente fortement leurs niveaux d’ARNm dans le striatum, une structure centrale du système dopaminergique qui contrôle l’activité locomotrice. Comme l’halopéridol est associé avec de nombreux effets secondaires moteurs, on peut penser que la modulation des neuropeptides est possiblement un mécanisme d’adaptation visant à rétablir l’homéostasie du système dopaminergique après le blocage des récepteurs D2. Cependant, le mécanisme moléculaire de cette régulation transcriptionnelle n’est pas bien compris. Nur77 est un facteur de transcription de la famille des récepteurs nucléaires orphelins qui agit en tant que gène d’induction précoce. Le niveau de son ARNm est aussi fortement augmenté dans le striatum suivant un traitement avec halopéridol. Plusieurs évidences nous suggèrent que Nur77 est impliqué dans la modulation transcriptionnelle des neuropeptides. Nur77 peut former des hétérodimères fonctionnels avec le récepteur rétinoïde X (RXR). En accord avec une activité transcriptionnelle d’un complexe Nur77/RXR, l’agoniste RXR (DHA) réduit tandis que l’antagoniste RXR (HX531) augmente les troubles moteurs induits par un traitement chronique à l’halopéridol chez les souris sauvages tandis que ces ligands pour RXR n’ont aucun effet chez les souris Nur77 nulles. Nos travaux ont révélé que l’antagoniste RXR (HX531) réduit l’augmentation des niveaux d’enképhaline suivant un traitement chronique avec l’halopéridol. Nous avons ensuite démontré la liaison in vitro de Nur77 sur un élément de réponse présent dans le promoteur proximal de la proenképhaline, le peptide précurseur de l’enképhaline. Ces résultats supportent l’hypothèse que Nur77, en combinaison avec RXR, pourrait participer à la régulation transcriptionnelle des neuropeptides dans le striatum et donc contribuer à la neuroadaptation du système dopaminergique suivant un traitement aux antipsychotiques typiques.

L'implication de la phosphorylation de RXR[alpha] dans la résistance de lignées cellulaires cancéreuses à l'acide rétinoïque

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Effets d'agents morphogénétiques sur la prolifération et la différenciation neuronales et épithéliales chez la pensée de mer Renilla koellikeri

La présence d’un récepteur de type RXR a récemment été rapporté chez la pensée de mer, Renilla koellikeri, de même que chez d’autres anthozoaires, et le NO semble jouer des différents rôles physiologiques, chez plusieurs cnidaires. L’acide rétinoïque (AR) et le monoxyde d’azote (NO) sont connus pour leur implication dans l’induction de la croissance des neurites chez les vertébrés ainsi que chez les invertébrés. Mais jusqu’à présent, aucun rôle de ces agents n’a encore été identifié chez ce phylum ancien des invertébrés. Dans le but de montrer que ces agents morphogénétiques ont un rôle dans le développement neuronal chez ces ancêtres des métazoaires bilatéraux, nous avons utilisé des cultures primaires de cellules du cnidaire anthozoaire Renilla koellikeri (pensée de mer), doté d’un système nerveux des plus primitif. Nous avons trouvé que les deux types d’acide rétinoïque, 9-cis et 11-trans, induisent une prolifération cellulaire dose-dépendante en fonction du temps dans les boîtes de pétri enduites de polylysine. Les cultures cellulaires exposées à l’acide rétinoïque dans les boîtes sans polylysine montrent une différenciation en des cellules épithéliales. D’autre part, le NO induit exclusivement une différenciation neuronale dans les boîtes enduites de polylysine. Aucun autre type de cellules subit un différenciation en présence de NO et la densité des cellules dédifférenciées a diminué. Les prolongements des neurones différenciés semblent s’enchevêtrer et former un réseau neuronal assez dense. L’ensemble de ces observations suggère que l’acide rétinoïque, contrairement à NO, est associé à l’activité mitotique, et que l’acide rétinoïque et le NO sont impliqués différemment dans la spécification cellulaire, respectivement épithéliale et neuronale, chez la pensée de mer. Le type d’action déclenchée, qu’il soit la mitogénèse ou la différenciation (épithéliale ou neuronale), varie alors selon l’état d’adhésion des cellules au substrat. Comme les données moléculaires et paléontologiques rapprochent les cnidaires, telle la pensée de mer, des ancêtres des eumétazoaires, nos résultats suggèrent que le rôle morphogénétique de l’acide rétinoïque et du NO est enraciné dans l’ancêtre commun de tous les métazoaires.

Rôle de la synthèse de l'acide rétinoïque dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules épithéliales mammaires

L’acide rétinoïque (AR) est le ligand des récepteurs nucléaires RAR et RXR qui agissent comme facteurs de transcription ligand-inductibles et médient ses effets biologiques. Il est connu que l’AR a des propriétés prodifférenciatrices et antiprolifératives, notamment sur les cellules de l’épithélium mammaire. Une perte de sensibilité de l’AR a toutefois été mise en évidence dans plusieurs lignées cellulaires mammaires cancéreuses, ce qui pourrait faciliter la croissance des tumeurs. Or jusqu’ici cette perte de sensibilité avait été attribuée à des défauts de la voie de signalisation de l’AR, causée par la perte de l’expression des récepteurs à l’AR dans la tumeur, bien que plusieurs lignées de cellules cancéreuses y soient tout de même très sensibles. Peu d’études se sont intéressées au rôle de la voie de synthèse de l’AR dans la transformation des cellules mammaires. En effet, l’AR est synthétisé à partir de la vitamine A, ou rétinol, son précurseur sanguin provenant de la diète. Les cellules de l’épithélium mammaire normales ont la capacité de synthétiser l’AR à partir du rétinol. Nos rapportons pour la première fois que l’épithélium mammaire est probablement le siège de la synthèse et de la signalisation de l’AR. Cela est dû, au moins en partie, à l’expression d’une enzyme de synthèse de l’AR, RALDH3, dans l’épithélium mammaire normal. Dans cette étude, nous démontrons que les cellules cancéreuses de type luminal, qui ont sensibles à l’AR (et qui expriment le récepteur des estrogènes ER, catégorie qui regroupe 75 % des tumeurs diagnostiquées) n’ont au contraire pas la capacité de sythétiser l’AR, probablement en raison d’une faible expression de RALDH3 dans les tumeurs, sous l’effet des estrogènes. Cela pourrait représenter un nouveau mécanisme favorisant la croissance des tumeurs luminales dont les cellules proliférent en présence du rétinol sanguin. RALDH1, une autre enzyme de la voie de synthèse de l’AR, et qui partage 70 % d’identité de séquence avec RALDH3, est un marqueur de tumeurs plus agressives et de la formation de métastase. Nous montrons au contraire, que RALDH3 est un marqueur d’une moindre probabilité de développer des métastases chez les patientes atteintes d’une tumeur luminale. Cela suggère des rôles different pour ces deux enzymes dans la glande mammaire. Nos résultats indiquent que RALDH1 et 3 ont des propriétés enzymatiques très différentes, ce qui est en accord avec cette dernière hypothèse. Nos données suggèrent aussi que RALDH1 et 3 pourraient être des marqueurs de populations distinctes de cellules dans la glande mammaire normale. Nous proposons d’exploiter les diffèrences entre RALDH1 et 3 afin de mettre au point des méthodes de séparation des différentes population de cellules de l’épithélium mammaire ce qui pourrait aider à comprendre le rôle de la synthèse d’AR dans ce tissu.

Modulation de l'expression et de l'activité de la NADPH P450 réductase chez le lapin.

L’activité catalytique du cytochrome P450 dépend de la disponibilité d’électrons produits par la NADPH P450 réductase (NPR). Notre étude a pour but de déterminer comment l’expression de la NPR est modulée chez le lapin. Afin de comprendre comment l’expression de la NPR est modulée, des hépatocytes de lapins témoins ont été incubés pendant 2, 4, 24 et 48 heures en présence de plusieurs activateurs de facteurs de transcription connus du cytochrome P450. De plus, des lapins ayant reçu une injection sous-cutanée de térébenthine afin de produire une réaction inflammatoire aseptique sont sacrifiés 48 heures plus tard dans le but d’étudier les effets de l’inflammation sur l’expression de la NPR. La rosiglitazone, le fénofibrate, l’acétate de plomb et le chlorure de cobalt (des inducteurs des PPAR, PPAR, AP-1 et HIF-1), après 48 heures d’incubation, n’ont provoqué aucun changement d’expression ou d’activité de la NPR. Après 48 heures d’incubation, la dexaméthasone (Dexa) a augmenté la quantité d’ARNm (QT-PCR), l’expression et l’activité de la NPR (p<0,05), en plus d’augmenter l’ARNm des récepteurs nucléaires CAR (récepteur constitutif à l’androstane) et PXR (récepteur X prégnane) (p<0.05). Le phénobarbital (PB) a augmenté seulement l’activité de la NPR (p<0.05). Par contre, après 48 heures d’incubation, la combinaison PB et Dexa a augmenté la quantité d’ARNm, ainsi que l’expression et l’activité de la NPR (p<0.05). La combinaison de PB et Dexa a induit une augmentation d’ARNm des récepteurs nucléaires CAR, PXR et RXR (récepteur X du rétinoïde) plus précocement, soit après 2 heures d’incubation (p<0.05). Le PD098059 (PD), un bloqueur de l’activation de MAPK1 (mitogen-activated protein kinase), et l’acide okadaïque (OA), un inhibiteur de la protéine phosphatase 2A (PP2A), ont bloqué l'augmentation d'expression et d'activité de la NPR induite par le PB après 48 heures d’incubation. La réaction inflammatoire aseptique a diminué l’expression et l’activité de la NPR après 48 heures d’incubation (p<0.05). On conclue que la dexaméthasone et le phénobarbital sont des inducteurs potentiels de la NPR et que les voies de signalisation de CAR, PXR et RXR semblent être impliquées dans le contrôle de cette induction. Des études supplémentaires devront être complétées afin de confirmer ces résultats préliminaires.

Évaluation des rétinoïdes dans l'infection par le VIH : impact de l'infection et du traitement antirétroviral

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Nur77 au sein des désordres dopaminergiques inhérents à la schizophrénie, la maladie de Parkinson ou la dépendance aux drogues d'abus

Cette thèse vise à mieux comprendre le rôle du facteur de transcription Nur77 au sein des fonctions physiologiques et pathologiques des voies de neurotransmission dopaminergiques des gaglions de la base. Nous basant sur une implication motrice de Nur77 au sein des dyskinésies induites à la L-DOPA (LIDs), nous avons voulu tester in vivo son implication éventuelle dans les phénomènes moteurs et de sensibilisation associés à l’amphétamine ainsi qu’une implication possible du récepteur nucléaire aux rétinoïdes RXR dont nous avons déjà démontré une implication dans les effets moteurs des antipsychotiques. Un deuxième volet de la recherche à consisté en l’étude de l’implication des extracellular signal-regulated kinase (ERK) et de la protéine kinase C (PKC) dans l’induction de l’ARNm des membres de la famille des Nurs suite à l’activation des cascades de signalisation des récepteurs dopamiergiques D1 et D2 in vivo pour une meilleure compréhension des mécanismes physiopatholoiques liés aux désordres dopaminergiques. Pour ce faire, nous avons, premièrement, soumis des souris sauvages et Nur77-/- à un paradigme de sensibilisation à l’amphétamine ainsi qu’a différents agonistes antagonistes RAR/RXR afin de tester l’implication de Nur77 et d’un éventuel complexe Nur77/RXR dans les effets de l’amphétamine. Deuxièmement, soumis des souris sauvages à une combinaison d’agonistes D1/D2 ou une injection d’antagoniste D2 avec ou sans inhibiteur (ERK1/2 ou PKC) afin de tester l’implication de ces kinases sur l’induction de l’ARNm des membres de la famille des Nurs par hybridation in situ. Nous avons ainsi pu démontrer 1- un rôle moteur de Nur77 dans les effets liés à l’amphétamine notamment avec une absence de stéréotypies et un allongement de la durée de la phase de locomotion chez les souris Nur77-/-; ainsi qu’un rôle éventuel du complexe potentiel Nur77/RXR dans les D1 à mieux définir. 2- un rôle des kinases ERKs et PKCs dans les cascades de signalisation des récepteurs dopaminergiques D1 et D2 menant à l’induction des ARNms de Nur77, Nor-1 et Nurr-1. En perspective, ces résultats nous ouvrent la voie vers une implication éventuelle de Nur77 dans les mécanismes d’apprentissage que sont le Long Terme Potentiation (LTP) et la Long Terme Depotentialisation (LTD) liés aux LIDs et à l’amphétamine.

Carence en œstrogènes et bases moléculaires du métabolisme des triglycérides et du cholestérol dans le foie et l'intestin : effet de l'exercice physique

La stéatose hépatique et la détérioration du profil lipidique plasmatique sont des pathologies métaboliques favorisées par la carence œstrogénique post-ménopausique. Cependant les mécanismes à la base de ces pathologies n’ont été que très peu étudiés. Le but de cette thèse a été d’investiguer les mécanismes moléculaires possibles à l’origine de l’hypercholestérolémie et de l’accumulation des lipides (triglycérides : TG et cholestérol) dans le foie en utilisant un modèle animal de la ménopause, la rate Sprague Dawley ovariectomisée (Ovx). Nous avons également examiné si le changement des habitudes de vie comme la pratique de l’exercice physique pouvait prévenir ou corriger les modifications induites par l’Ovx. Enfin, rosuvastatine (statine) a été utilisée comme thérapie pharmacologique de l’hypercholestérolémie dans le but de comprendre son effet au niveau moléculaire chez la rate Ovx. L’objectif de la première étude était de déterminer comment l’Ovx peut affecter les niveaux de TG et de cholestérol dans le foie des rates nourries avec une diète riche en lipides (HF : 42% gras). Les rates ont été soumises à la diète HF ou normale pendant 6 semaines avant d’être Ovx ou Sham (ovariectomie simulée), puis maintenues aux mêmes conditions diététiques pour 6 autres semaines. L’Ovx a provoqué une accumulation de TG dans le foie, mais pas la diète HF seule. Cependant, lorsque l’Ovx était combinée à la diète HF, l’accumulation des TG était beaucoup plus importante comparé à ce qui était observé chez les rates Ovx soumises à la diète normale. L’expression génique (ARNm) de CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1), PGC1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1) et PPARα (Peroxysome proliferetor activated receptor alpha) intervenant dans l’oxydation des acides gras dans le foie était augmentée par la diète HF (p ˂ 0.001; p ˂ 0.01; p ˂ 0.05 respectivement) ; mais atténuée (p ˂ 0.05; p ˂ 0.05; p ˂ 0.07 respectivement) lorsque les rates ont été Ovx, favorisant ainsi l’accumulation des TG dans le foie. La combinaison de la diète HF à l’Ovx a également provoqué une hypercholestérolémie et une accumulation de cholestérol dans le foie malgré la diminution de l’expression de la HMGCoA-r (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase), enzyme clé de la synthèse du cholestérol. Ceci était associé à l’inhibition de l’expression génique de CYP7a1 (Cytochrome P450, family 7, subfamily a, polypeptide 1), suggérant une diminution de la synthèse des acides biliaires. Ayant constaté dans la première étude que l’Ovx élevait les niveaux de cholestérol hépatique et plasmatique, nous nous sommes fixés comme objectif dans la deuxième étude d’évaluer les effets de l’Ovx sur l’expression génique des transporteurs et enzymes responsables du métabolisme du cholestérol et des acides biliaires dans le foie et l’intestin, et de vérifier si l’exercice sur tapis roulant pouvait prévenir ou corriger les changements causés par l’Ovx. L’hypercholestérolémie constatée chez les rates Ovx comparativement aux Sham était accompagnée de la diminution de l’expression génique des récepteurs des LDL (R-LDL), des résidus de lipoprotéines (LRP1), de SREBP-2 (Sterol regulatory element binding protein 2) et de PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) dans le foie, suggérant une défaillance dans la clairance des lipoprotéines plasmatiques. L’Ovx a aussi inhibé l’expression génique de la MTP (Microsomal triglyceride transfer protein) et stimulé celle de SR-B1 (Scavenger receptor class B, member 1); mais aucun changement n’a été observé avec CYP7a1. Ces changements moléculaires pourraient par conséquent favoriser l’accumulation de cholestérol dans le foie. L’exercice physique n’a pas corrigé les modifications causées par l’Ovx sur l’expression génique de ces molécules au niveau hépatique à l’exception de SREBP-2. Par contre, au niveau intestinal (iléum), l’exercice sur tapis roulant a inhibé l’expression génique des marqueurs moléculaires intervenant dans l’absorption des acides biliaires (OSTα/β, FXR, RXRα, Fgf15) et du cholestérol (LXRα, NCP1L1) au niveau de l’iléum chez les rates Sham entraînées. Ces adaptations pourraient prévenir le développement de l’hypercholestérolémie protégeant en partie contre la survenue de l’athérosclérose. Au vue des effets délétères (hypercholestérolémie et diminution de l’expression du R-LDL, PCSK9, LRP1, SREBP-2 et HMGCOA-r dans le foie) causés par l’Ovx sur le métabolisme du cholestérol constatés dans l’étude 2, la 3ième étude a été conçue pour évaluer l’efficacité de rosuvastatine (Ros) sur l’expression génique de ces marqueurs moléculaires chez les rates Ovx sédentaires ou soumises à l’entraînement volontaire. Ros a été administrée aux rates Ovx pendant 21 jours par voie sous-cutanée à la dose de 5mg/kg/j à partir de la 9ième semaine après l’Ovx. Ros n’a pas diminué la concentration plasmatique de LDL-C et de TC chez les rates Ovx. Par contre, Ros a stimulé (P ˂ 0.05) l’expression génique de PCSK9, SREBP-2, LRP1, HMGCoA-r et ACAT2 (Acyl-CoA cholesterol acyltransferase) mais pas significativement (P = 0.3) celle du R-LDL dans le foie des rates Ovx sédentaires et entraînées. Ros n’a pas réduit la concentration plasmatique de LDL-C probablement à cause de l’induction plus importante de PCSK9 par rapport au R-LDL. Cependant, la stimulation de LRP1 par Ros protège partiellement contre la survenue des maladies cardiovasculaires. En conclusion, les études de cette thèse indiquent que la baisse du niveau des œstrogènes entraîne des changements radicaux du métabolisme hépatique des TG et du cholestérol provoqués par des altérations de l’expression des gènes clés des voies métaboliques associées.

Rôle de l'isoforme p35 de la chaîne invariante humaine dans la formation et le transport de complexes de CMH II

La présentation antigénique par les molécules de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH II) est un mécanisme essentiel au contrôle des pathogènes par le système immunitaire. Le CMH II humain existe en trois isotypes, HLA-DP, DQ et DR, tous des hétérodimères composés d’une chaîne α et d’une chaîne β. Le CMH II est entre autres exprimé à la surface des cellules présentatrices d’antigènes (APCs) et des cellules épithéliales activées et a pour fonction de présenter des peptides d’origine exogène aux lymphocytes T CD4+. L’oligomérisation et le trafic intracellulaire du CMH II sont largement facilités par une chaperone, la chaîne invariante (Ii). Il s’agit d’une protéine non-polymorphique de type II. Après sa biosynthèse dans le réticulum endoplasmique (ER), Ii hétéro- ou homotrimérise, puis interagit via sa région CLIP avec le CMH II pour former un complexe αβIi. Le complexe sort du ER pour entamer son chemin vers différents compartiments et la surface cellulaire. Chez l’homme, quatre isoformes d’Ii sont répertoriées : p33, p35, p41 et p43. Les deux isoformes exprimées de manière prédominante, Iip33 et p35, diffèrent par une extension N-terminale de 16 acides aminés portée par Iip35. Cette extension présente un motif de rétention au réticulum endoplasmique (ERM) composé des résidus RXR. Ce motif doit être masqué par la chaîne β du CMH II pour permettre au complexe de quitter le ER. Notre groupe s’est intéressé au mécanisme du masquage et au mode de sortie du ER des complexes αβIi. Nous montrons ici que l’interaction directe, ou en cis, entre la chaîne β du CMH II et Iip35 dans une structure αβIi est essentielle pour sa sortie du ER, promouvant la formation de structures de haut niveau de complexité. Par ailleurs, nous démontrons que NleA, un facteur de virulence bactérien, permet d’altérer le trafic de complexes αβIi comportant Iip35. Ce phénotype est médié par l’interaction entre p35 et les sous-unités de COPII. Bref, Iip35 joue un rôle central dans la formation des complexes αβIi et leur transport hors du ER. Ceci fait d’Iip35 un régulateur clef de la présentation antigénique par le CMH II.

Caractérisation de l’activité Nur77 et de ses complexes en essais BRET par complémentation

Dans le système nerveux central, la dopamine joue un rôle crucial dans de nombreuses fonctions physiologiques telles que : l’apprentissage, le mouvement volontaire, la motivation, la cognition et la production hormonale. Il a été aussi démontré que le système de signalisation dopaminergique est altéré dans plusieurs maladies neurologiques et psychiatriques comme la maladie de Parkinson et la schizophrénie. Des études, effectuées dans le laboratoire du Dr.Daniel Lévesque (laboratoire d’accueil), ont montré que les récepteurs nucléaires Nur77 (NR4A1, NGFI-B) et RXRγ (retinoid X receptors γ) sont impliqués dans la régulation des effets de la dopamine dans le système nerveux central. De plus, ces données suggèrent que le complexe Nur77 et RXR joueraient un rôle crucial dans l’effet des médicaments antipsychotiques et antiparkinsoniens. Toutefois, très peu de médicaments ciblant Nur77 ont été identifiés à ce jour et les médicaments agissant sur RXRγ restent mal caractérisés. En outre, les analyses actuellement disponibles ne peuvent pas résumer la complexité des activités des NRs et génèrent des mesures indirectes des activités des drogues. Afin de mieux comprendre comment est régulée l’interaction Nur77/RXRγ dans ces processus, mon projet a été de mettre au point un essai BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) et PCA-BRET (Protein Complementation Assay-BRET) basé sur le recrutement d'un motif mimant un co-activateur fusionné avec la YFP. Nos différents essais ont été validés par courbes dose-réponse en utilisant différents composés RXR . Les EC50 (concentration efficace médiane, qui permet de mesurer l'efficacité d'un composé) obtenues étaient très semblables aux valeurs précédemment rapportées dans la littérature. Nous avons aussi pu identifier un composé le SR11237 (BMS649) qui semble posséder une sélectivité pour le complexe Nur77/RXRγ par rapport aux complexes Nurr1/RXRγ et RXRγ /RXRγ. Nos résultats indiquent que ces essais de BRET peuvent être utilisés pour évaluer la sélectivité de nouveaux composés pour les complexes Nur77/RXRγ, Nurr1/RXRγ et RXRγ /RXRγ. Un autre aspect de mon projet de doctorat a été de mettre en évidence par BRET l’importance de la SUMOylation dans la régulation de l'activité de Nur77 dans sa forme monomèrique, homodimèrique et hétérodimèrique. Nous avons ainsi identifié que Nur77 recrute principalement SUMO2 sur sa lysine 577. Il est intéressant de noté que le recrutement de la SUMO2 à Nur77 est potentialisé en présence de la SUMO E3 Ligase PIASγ. Aussi, la perte de la SUMOylation sur la lysine 577 entraîne l'incapacité de Nur77 de recruter divers motifs de co-activation mais pas pour ses formes homo- et hétérodimèrique. Cependant, la présence de PIASγ ne potentialise pas le recrutement du co-activateur, suggérant que cette SUMO E3 Ligase est seulement impliqué dans le processus de recrutement de la SUMO mais pas dans celui du co-activateur. Nous avons ainsi déterminé une nouvelle modification post-traductionnelle sur Nur77 régulant spécifiquement son activité monomérique Ces projets pourraient donc apporter de nouvelles données cruciales pour l’amélioration du traitement de la maladie de Parkinson ou de la schizophrénie, ainsi que d'obtenir une meilleure compréhension sur les mécanismes permettant la régulation de la fonction de Nur77