16 resultados para Receptor activator of nuclear factor
em Université de Montréal, Canada
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Introduction: La circulation extracorporelle (CEC) peut entraner une dysfonction endothliale pulmonaire et lhypertension pulmonaire. Le SN50 agit au niveau de la signalisation cellulaire pour prvenir ces ractions la CEC et pourrait renverser la dysfonction endothliale pulmonaire post-CEC sans effets nfastes sur lhmodynamie. Mthodes: Quatre groups de porcs ont reu un parmi quatre tratements avant de subir 90 minutes de CEC et 60 minutes de reperfusion: (1) milrinone nbulis; (2) sildenafil nbulis; (3) placebo nbulis; et (4) SN-50 intraveineux. Un monitoring hmodynamique invasif a t utilis. La ractivit vasculaire des artres pulmonaires de deuxime ordre a t value face lactylcholine et la bradykinine. Rsultats: Le sildnafil produit une augmentation significative de la pression de lartre pulmonaire (PAP) moyenne 60 minutes de reperfusion par rapport au dbut de la chirurgie. Les relaxations dpendantes de lendothlium face la bradykinine taient meilleurs dans les groupes milrinone et SN-50 et surtout dans le groupe sildnafil par rapport au groupe placbo. Le SN-50 produisait de moins bonnes relaxations dpendantes de lendothlium face lactylcholine que les autres traitements incluant placbo. Conclusion: Le sildnafil prvient mieux la dysfonction endothliale pulmonaire que les autres traitements. Les bnfices du SN-50 sont possiblement sous-estims vu que la dose na pas pu tre ajuste la dure de CEC. Le sildenafil inhal mrite une tude plus importante chez lhumain et le SN-50 dans un model de CEC animal.
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Les rcepteurs nuclaires (RN) sont des facteurs de transcription ligand dpendants qui contrlent une grande varit de processus biologiques de la physiologie humaine, ce qui a fait d'eux des cibles pharmacologiques privilgies pour de nombreuses maladies. L'un de ces rcepteurs, le rcepteur de lstrogne alpha (ER), peut activer la prolifration cellulaire dans certaines sections de l'pithlium mammaire tandis quun autre, le rcepteur de l'acide rtinoque alpha (RAR), peut provoquer un arrt de la croissance et la diffrenciation cellulaire. La signalisation de ces deux rcepteurs peut tre altre dans le cancer du sein, contribuant la tumorignse mammaire. Lactivit dER peut tre bloque par les anti-oestrognes (AE) pour inhiber la prolifration des cellules tumorales mammaires. Par contre, lactivation des voies de RAR avec des rtinodes dans un contexte clinique a rencontr peu de succs. Ceci pourrait rsulter du manque de spcificit des ligands tests pour RAR et/ou de leur activit seulement dans certains sous-types de tumeurs mammaires. Puisque les rcepteurs nuclaires forment des homo- et htro-dimres, nous avons cherch dvelopper de nouveaux essais pharmacologiques pour tudier l'activit de complexes dimriques spcifiques, leur dynamique dassociation et la structure quaternaire des rcepteurs des strognes. Nous dcrivons ici une nouvelle technique FRET, surnomme BRET avec renforcement de fluorescence par transferts combins (BRETFect), qui permet de dtecter la formation de complexes de rcepteurs nuclaires ternaires. Le BRETFect peut suivre l'activation des htrodimres ER-ER et met en vidence un mcanisme allostrique d'activation que chaque rcepteur exerce sur son partenaire de dimrisation. L'utilisation de BRETFect en combinaison avec le PCA nous a permis d'observer la formation de multimres dER fonctionnels dans des cellules vivantes pour la premire fois. La formation de multimres est favorise par les AE induisant la dgradation du rcepteur des oestrognes, ce qui pourrait contribuer leurs proprits spcifiques. Ces essais de BRET apportent une nette amlioration par rapport aux tests de vecteurs rapporteur lucifrase classique, en fournissant des informations spcifiques aux rcepteurs en temps rel sans aucune interfrence par d'autres processus tels que la transcription et de la traduction. L'utilisation de ces tests nous a permis de caractriser les proprits de modulation de lactivit des rcepteurs nuclaires dune nouvelle classe de molcules hybrides qui peuvent la fois lier ERa ou RAR et inhiber les HDACs, conduisant au dveloppement de nouvelles molcules prometteuses bifonctionnelles telles que la molcule hybride RAR-agoniste/HDACi TTNN-HA.
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Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en rponse un dsquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolonge ou une modification de l'quilibre hormonal. Le systme rnine-angiotensine (SRA) est un systme hormonal largement tudi et il est impliqu dans de nombreuses activits associes au remodelage cardiovasculaire. Lexistence d'un systme circulatoire coupl un systme de tissus locaux est une reprsentation classique, cependant de nouvelles donnes suggrent un SRA indpendant et fonctionnellement actif l'chelle cellulaire. La comprhension de l'activit intracellulaire du SRA pourrait mener de nouvelles pistes thrapeutiques qui pourraient prvenir un remodelage cardiovasculaire dfavorable. L'objectif de cette thse tait d'lucider le rle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Rcemment, les rcepteurs coupls aux protines G (RCPG), les protines G et leurs effecteurs ont t dtects sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nuclaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'tre accepts comme une ralit. Nous avons ds lors fait l'hypothse que la signalisation du SRA dlimitant le noyau tait implique dans le contrle de l'expression des gnes cardiaques. Nous avons dmontr la prsence de rcepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nuclaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nuclaire purifie de tissu cardiaque. Des quantits d'Ang II ont t dtectes dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donn lieu des liaisons prfrentielles aux sites nuclaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthse d'ARN de novo dans des noyaux isols stimuls l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-B taient beaucoup plus importants lorsque les noyaux taient exposs de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nuclaires a engendr une mobilisation de Ca2+ via les rcepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminu la rponse transcriptionnelle. Les mthodes disponibles actuellement pour l'tude de la signalisation intracrine sont limites aux mthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thse tait de synthtiser et caractriser des analogues d'Ang-II cellule-permants afin dtudier spcifiquement dans les cellules intactes l'activit intracellulaire du SRA. Nous avons synthtis et caractris pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsule en incorporant un groupement 4,5-dimthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifis du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsule synthtiss et purifis: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montr une rduction par un facteur deux ou trois de l'affinit de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison comptitive et une activit rduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augment la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isols elle gnrait une augmentation de Ca2+ nucloplasmique et initiait la synthse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-B. Les fibroblastes sont les principaux gnrateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus ractifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons mis l'hypothse que lAng-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nuclaires associs contrlaient les profils d'expression des gnes des fibroblastes via des systmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rle majeur dans le dveloppement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqu que les fibroblastes auriculaires expriment lAT1R et lAT2R nuclaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. Lexpression d'AT1R nuclaire a t rguls positivement dans les cas dinsuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nuclaire a t glycosyl post-traductionnellement. La machinerie protique des protines G, y compris Gq/11, Gi/3, et G, a t observe dans des noyaux isols de fibroblastes. AT1R et AT2R rgulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire dclenche la libration de Ca2+ nucloplasmique, la prolifration, et la synthse et scrtion de collagne qui ne sont pas inhibes par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires.
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Nous avons rcemment dmontr que les espces ractives oxygnes induisent une augmentation de lexpression des protines Gi dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) provenant daortes de rats spontanment hypertendus (SHR, de langlais spontaneously hypertensive rats). La prsente tude a pour but dtudier les effets du peroxyde dhydrogne (H2O2), un oxydant qui induit le stress oxydatif, sur lexpression de Gi et sur lactivit de ladnylate cyclase, et dexplorer les voies de signalisation sous-jacentes responsables de cette rponse. Nos rsultats montrent que H2O2 induit une augmentation de lexpression des protines Gi-2 et Gi-3 de manire dose- et temps-dpendante avec une augmentation maximale de 40-50% 100 M aprs 1 heure, sans affecter lexpression de Gs. Lexpression des protines Gi a t maintenue au niveau normal en presence de AG 1478, AG1295, PD98059 et la wortmannine, des inhibiteurs dEGF-R (de langlais epidermal growth factor receptor), PDGFR- (de langlais platelet-derived growth factor receptor ), de la voie de signalisation ras-ERK1/2 (de langlais extracellular regulated kinase1/2), et de la voie de la PI3Kinase-AKT (de langlais phosphatidyl inositol-3 kinase), respectivement. En outre, le traitement des CMLV avec H2O2 a induit une augmentation du degr de phosphorylation dEGF-R, PDGF-R, ERK1/2 et AKT; et cette expression a t maintenue au niveau tmoin par leurs inhibiteurs respectifs. Les inhibiteurs dEGF-R et PDGF-R ont aussi induit une diminution du degr de phosphorylation de ERK1/2, et AKT/PKB. En outre, la transfection des cellules avec le siRNA (de langlais, small interfering ribonucleic acid) de EGF-R et PDGFR- a attnu la surexpression des protines Gi-2 et Gi-3 induite par le traitement au H2O2. La surexpression des protines Gi induite par H2O2 a t corrle avec une augmentation de la fonction de la protine Gi. Linhibition de lactivit de ladnylate cyclase par de faibles concentrations de GTPS aprs stimulation par la forskoline a augment de 20% dans les cellules traites au H2O2. En outre, le traitement des CMLV au H2O2 a aussi accru linhibition de lactivit de ladnylate cyclase par les hormones inhibitrices telles que langiotensine II, oxotrmorine et C-ANP4-23. Dautre part, la stimulation de ladnylate cyclase induite par GTPS, glucagon, isoprotrnol, forskoline, et le fluorure de sodium (NaF) a t attnue de faon significative dans les cellules traites au H2O2. Ces rsultats suggrent que H2O2 induit la surexpression des protines Gi-2 and Gi-3 via la transactivation des rcepteurs des facteurs de croissance EGF-R, PDGFR- et lactivation des voies de signalisation ras-ERK1/2 et PI3K-AKT Mot-cles: Protines Gi, peroxyde dhydrogne, stress oxydant, rcepteurs des facteurs de croissance, MAP kinases, adnylate cyclase, hypertension
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Rcemment plusieurs rcepteurs coupls aux protines G (RCPGs) ont t caractriss au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nuclaire. Notre objectif tait de dterminer si les sous-types de rcepteurs -adrnergiques (AR) et leurs machineries de signalisation taient fonctionnels et localiss la membrane nuclaire des cardiomyocytes. Nous avons dmontr la prsence des 1AR et 3AR, mais pas du 2AR la membrane nuclaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protines GS, Gi, ladnylate cyclase II, et V/VI y taient galement localiss. Les sous-types de AR nuclaires taient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isols, nous avons observ que l'agoniste non-slectif isoprotrnol (ISO), et que le BRL37344, un ligand slectif du 3AR, stimulaient l'initiation de la synthse de lARN, contrairement l'agoniste slectif du 1AR, le xamotrol. Cette synthse tait abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des rcepteurs nuclaires de type B de lendothline (ETB) causaient une rduction de l'initiation de la synthse dARN. Les voies de signalisations impliques dans la rgulation de la synthse dARN par les RCPGs ont ensuite t tudies en utilisant des noyaux isols stimuls par des agonistes en prsence ou absence de diffrents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases actives par mitognes) et de la voie PI3K/PKB. Les protines impliques dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB taient prsents dans les noyaux isols. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthse dARN. Nous avons ensuite pu mettre en vidence par qPCR que la stimulation par lISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi quune diminution de l'expression dARNm de NFB. En contraste, lET-1 navait aucun effet sur le niveau dexpression de lARNr 18S. Nous avons ensuite montr que la stimulation par lISO rduisait lexpression de plusieurs gnes impliqus dans l'activation de NFB, tandis que linhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de dmontrer que les ARs et les ETRs nuclaires rgulaient un grand nombre de gnes distincts. Finalement, les ARs et ETRs nuclaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isols, ce qui pouvait tre inhibe par le LNAME. Ces rsultats ont t confirms dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cags et permables dISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nuclaire dtecte par DAF2-DA, cause par l'ET-1 et l'ISO, pouvait tre prvenue par le LNAME. Finalement, laugmentation de linitiation de la transcription induite par l'ISO tait aussi bloque par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggrant que la voie NO-GC-PKG est implique dans la rgulation de la transcription par les AR. En conclusion, les ARs et les ETRs nuclaires utilisent des voies de signalisation diffrentes et exercent ainsi des effets distincts sur lexpression des gnes cardiaques. Ils reprsentent donc une avenue intressante pour le dveloppement de drogues pharmacologiques.
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Introduction: L'arthrose est caractrise par une destruction progressive du cartilage, une inflammation synoviale, et un remodelage de los sous-chondral avec une production excessive des mdiateurs inflammatoires et cataboliques. Nous avons dmontr que le niveau du 4-hydroxynonnal (4-HNE), un produit de la peroxydation lipidique, est augment dans le cartilage humain arthrosique sans quon sache le mcanisme exacte impliqu dans laugmentation de cette molcule. Des donnes de la littrature indiquent que laccumulation du HNE est contrle par laction de la glutathione S-transfrase A4-4 (GSTA4-4), une enzyme implique dans la dtoxification du HNE. Au niveau transcriptionel, lexpression de cette enzyme est rgule par la transactivation du facteur de transcription Nrf2. Objectif: Lobjectif de cette tude vise dmontrer que laugmentation du HNE dans le cartilage arthrosique est attribue, en partie, laltration de lexpression de la GSTA4-4 et de Nrf2. Mthode: Le niveau dexpression de la GSTA4-4 et de Nrf2 a t mesure par Western blot et par PCR en temps rel dans le cartilage humain arthrosique et dans le cartilage provenant des souris atteintes darthrose. Pour dmontrer le rle du Nrf2 dans larthrose, les chondrocytes humains arthrosiques ont t traits par linterleukine 1beta (IL-1) ou par le H2O2 en prsence ou en absence des activateurs du Nrf2 tels que le Protandim, AI, et du 6-Gingrol. Par ailleurs, les chondrocytes ont t transfects par un vecteur dexpression de Nrf2 puis traits par lIL-. En utilisant le modle darthrose chez la souris, les animaux ont t traits par voie orale de 10 mg/kg/jour de Protandim pendant 8 semaines. Rsultats: Nous avons observ une diminution significative de lexpression de la GSTA4-4 et de Nrf2 dans le cartilage humain et murin arthrosique. L'activation de Nrf2 bloque la stimulation de la mtalloprotinase-13 (MMP-13), la prostaglandine E2 (PGE2) et de l'oxyde nitrique (NO) par lIL-1. En outre, nous avons montr que l'activation Nrf2 protge les cellules contre la mort cellulaire induite par H2O2. Fait intressant, l'administration orale de Protandim rduit la production du HNE par l'intermdiaire de lactivation de la GSTA4. Nous avons dmontr que le niveau dexpression de la GSTA4-4 et de Nrf2 diminue dans le cartilage provenant des patients et des souris atteints darthrose. De plus, la surexpression de ce facteur nuclaire Nrf2 empche la production du HNE et la MMP-13 et linactivation de la GSTA4-4. Dans notre modle exprimental darthrose induite par dstabilisation du mnisque mdial chez la souris, nous avons trouv que l'administration orale de Protandim 10 mg / kg / jour rduit les lsions du cartilage. Conclusion: Cette tude est de la premire pour dmontrer le rle physiopathologique du Nrf2 in vitro et in vivo. Nos rsultats dmontrent que lactivation du Nrf2 est essentielle afin de maintenir lexpression de la GSTA4-4 et de rduire le niveau du HNE. Le fait que les activateurs du Nrf2 abolissent la production de la HNE et aussi un certain nombre de facteurs connus pour tre impliqus dans la pathogense de larthrose les rend des agents cliniquement utiles pour la prvention de la maladie.
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La scoliose idiopathique de ladolescent (SIA) est dfinie comme une courbure de la colonne vertbrale suprieure 10 degrs, qui est de cause inconnue et qui affecte de faon prpondrante les adolescents. Des tudes prcdentes sur des modles murins ont dmontr une inactivation partielle du gne Pitx1. Cette inactivation partielle provoque une dformation spinale svre lors du dveloppement des souris Pitx1+/-, ce qui est grandement similaire au phnotype de la SIA. En se basant sur ces observations, nous postulons que la perte de fonction de Pitx1 pourrait avoir un rle dans la SIA et pourrait tre rgule par des mcanismes molculaires spcifiques. En effet, des tudes faites sur lexpression de Pitx1 rvlent une perte de son expression dans les ostoblastes drivs de patients SIA au niveau de lARNm. Nous mettons lhypothse que la perte de Pitx1 dans la SIA pourrait tre dclenche par des facteurs hypoxiques puisquil est connu que Pitx1 est rprim par lhypoxie et que HIF-2 alpha est surexprims dans les ostoblastes des patients SIA mme dans des conditions normoxiques. De plus, nous avons dcouvert une mutation dans le domaine ODD des HIF-1 alpha chez certains patients SIA (3,1%). Une fonction connue de ce domaine est de stabiliser et daugmenter lactivit transcriptionnelle de HIF-1 alpha dans des conditions normoxiques. Nous avons confirm, par la technique EMSA, lexistence dun lment de rponse fonctionnel lhypoxie au niveau du promoteur de Pitx1. Cependant, des co-transfections avec des vecteurs dexpression pour HIF-1 alpha et HIF-2 alpha, en prsence de leur sous-unit beta ARNT, ont conduit une activation du promoteur de Pitx1 dans la ligne cellulaire MG-63 ainsi que dans les ostoblastes des sujets contrles. Il est intressant de constater quaucune activit du promoteur de Pitx1 dans les ostoblastes SIA na t observe, mme aprs la co-expression de HIF-2 alpha et ARNT, confirmant le fait que lexpression de Pitx1 est abroge dans la SIA. Dans lensemble, nos rsultats dmontrent un rle important de Pitx1 dans la SIA et une possible rgulation par des facteurs hypoxiques.
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Dans ce mmoire, je prsente mes tudes sur la synthse, la caractrisation et lvaluation biologique de diffrentes sries danalogues du D-heptapeptide appel 101.10, un modulateur ngatif allostrique du rcepteur de linterleukine-1 (IL-1). Sachant que les peptides ont gnralement de faibles proprits pharmacologiques, le but de ce projet portait sur lexamen des structures ncessaires la bioactivit, la conformation tridimensionnelle de ces derniers afin damliorer la droguabilit du peptide parent. Les stratgies doptimisation du 101.10 utilises furent : la coupure N- et C-terminale; la substitution par la proline, -amino--lactame (Agl), -amino--lactame (Bgl) et -amino--hydroxy--lactame (Hgl); et la rigidification du squelette laide dun bicycle, lindolozidin-2-one (I2aa). Afin de clarifier certaines relations de structure-activit, quelques modifications furent apportes au peptide, incluant lchange de la thronine pour la valine, la permutation de la strochimie de certains rsidus cls ainsi que le remplacement de certaines chanes latrales par un mthyle. Pour pallier aux difficults de reproductibilit des rsultats avec des chantillons provenant de diffrentes sources, des tudes sur lidentit du contre-anion et la puret du peptide furent conduites. Afin dvaluer leffet des modifications sur la conformation aqueuse et lactivit biologique du peptide, des analyses de dichrosme circulaire et des tests in vitro mesurant linhibition de certains effets de lIL-1 furent effectus. Ces essais cellulaires comportaient linhibition de la prolifration de cellules immunes et de lactivation des voies de signalisation inflammatoires du facteur nuclaire B (NF-B) et de la protine kinase active par mitogne (MAPK), toutes deux stimules par lIL-1. La compilation de ces donnes a permis de dceler certaines tendances entre la structure, la conformation et lactivit anti-IL-1 des peptidomimtiques.
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Linsuffisance rnale chronique (IRC) est associe une rduction du mtabolisme de plusieurs mdicaments, due une diminution du cytochrome P450 (CYP450) hpatique. Nos tudes prcdentes ont montr que lIRC affecte lactivit in vivo et in vitro, de mme que lexpression protique et gnique des diffrents isoformes du CYP450, via la prsence du srum urmique et de lhormone parathyrodienne (PTH). Ce projet de doctorat se divise en quatre parties. Premirement, nous avons dvelopp une mthode danalyse de lactivit du CYP450, laide de la production du 3-hydroxy-5,5-dimethyl-4-[4-(methylsulfonyl)phenyl] furan-2(5H)-one (DFH) partir du 3-[(3,4-difluorobenzyl)oxy]-5,5-dimethyl-4-[4-methylsulfonyl)phenyl] furan-2(5H)-one (DFB). Cette mthode nous a permis de mieux quantifier lactivit dans les tudes subsquentes. Deuximement, lactivit du CYP450 3A est diminue chez les patients atteints dIRC. De plus, il a dj t dmontr que des toxines urmiques dialysables seraient impliques puisque lhmodialyse prvient cette inhibition du CYP450. Par contre, le mcanisme expliquant lamlioration transitoire la composition du srum de patients atteints dIRC par lhmodialyse nest pas connu. Lobjectif du projet est dvaluer leffet de lhmodialyse sur lexpression protique et gnique, de mme que sur lactivit du CYP450 3A2 dans un modle dhpatocytes de rat en culture. Troisimement, la dficience en calcidiol est frquente dans les cas dIRC et ltiologie est peu connue. Nous avons rcemment montr que lIRC est associe une diminution du mtabolisme des mdicaments par le foie suite une rduction des diffrents isoformes du CYP450 en partie mdie par lhormone parathyrodienne (PTH). La 25-hydroxylation de la vitamine D, au niveau du foie, permet la formation du calcidiol par diffrents isoformes du CYP450 (CYP2C11, 27A1, 2R1, 3A2 et 2J3) et pourrait tre ainsi altre en prsence dIRC. Les objectifs de cette tude sont de a) confirmer la diminution de synthse de calcidiol en prsence dIRC et b) valuer le rle de la PTH dans la dficience en calcidiol. Finalement, afin de mieux comprendre les inhibitions du CYP450, nous avons tudi les voies de signalisation impliques dans la rgulation du CYP450 en prsence dIRC et avec la PTH puisque les mcanismes daction demeurent imprcis. La contribution des facteurs de transcription et des rcepteurs nuclaires suivants est tudie ; le rcepteur pregnane X (PXR), le rcepteur constitutif androstane (CAR) et le facteur nuclaire kappa B (NF-B), puisquils sont potentiellement activs par le rcepteur de la PTH et ces molcules ont t prcdemment impliqus dans la rgulation du CYP450. Les rsultats obtenus montrent que lhmodialyse des patients atteints dIRC amliore transitoirement lexpression du CYP450 lorsque des hpatocytes sont mis en culture avec du srum provenant de ces patients. Aussi, la 25-hydroxylation de la vitamine D est affecte par lIRC. Les voies de signalisation du NF-B et les facteurs nuclaires PXR et CAR sont impliqus dans linhibition du CYP450. En conclusion, lIRC affecte, non seulement le mtabolisme des mdicaments mais aussi lhydroxylation de la vitamine D, un des rles endognes effectus par le CYP450. Ces tudes nous permettent de mieux comprendre les effets de lIRC afin de mieux cibler les traitements de choix pour les patients qui en sont atteints.
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CONTEXTE: Bien que la dysfunction mitochondriale et le stress oxydant jouent des rles prpondrants dans plusieurs conditions pathologiques, ils nont pas t tudis de faon extensive au niveau du tube digestif qui est constamment expos aux oxydants (provenant de lalimentation) et divers agents pathognes. Lingestion simultane de sels ferreux et dacide ascorbique peut causer le dommage des macromolcules par oxydation. Le Nuclear factor erythroid 2 related factor (Nrf2) est un important facteur de transcription sensible au potentiel redox et qui protge contre le stress oxydant en induisant des gnes anti-oxydants et de detoxification par sa liaison llment de rponse antioxydante (ARE). Les fonctions anti-oxydantes et anti-inflammatoires de Nrf2 ont t dcrites dans une varit de types cellulaires et de tissus. Cependant son rle est trs peu connu au niveau du tube digestif. OBJECTIFS: Les objectifs sont dvaluer comment la peroxydation lipidique mdie par le fer/ascorbate (FE/ASC) affecte les fonctions mitochondriales dans les cellules Caco-2/15, et de dterminer lampleur de limplication de Nrf2. MTHODES: Le stress oxydant a t induit dans les cellules Caco2/15 en les traitant avec 0.2mm/2mm de FE/ASC. Laugmentation de lexpression de Nrf2 a t obtenue suite au prtraitement des cellules Caco2/15 avec 50 M dOlitpraz (OPZ), un puissant activateur. Linvalidation du gne de Nrf2 a t ralise dans les cellules par transfection avec un vecteur lentiviral contenant un shRNA contre Nrf2. RSULTATS: Nos rsultats montrent que le traitement des cellules Caco-2/15 avec du FE/ASC (0.2 mm/2 mm) augmente les niveaux du malondialdehyde (MDA), rduit la production dATP, entrane une surcharge mitochondriale de calcium, active lexpression protique du cytochrome C et de lAIF (apoptotic inducing factor), rduit lactivit des complexes I, II, 2 III et IV de la chane respiratoire mitochondriale, augmente les niveaux de 8-OHdG, un marqueur des dommages lADN mitochondrial, diminue la DNA glycosylase, et altre les expressions gnique et protique des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). De plus, nos observations montrent que linduction et lactivation de Nrf2 dans les cellules Caco-2/15 rsultent en: une augmentation des enzymes anti-oxydantes endognes (catalase, glutathion peroxydase, et superoxyde dismutase), une rduction du facteur nuclaire NF et de TNF-, une augmentation de la production d ATP et de lactivit des complexes respiratoires (I, II, III, IV) et de PGC-1, et une rgulation des niveaux de la prohibitine mitochondriale, du Bcl-2 anti-apoptotique et de loccludine. CONCLUSION: Dans lensemble, nos rsultats montrent que lexposition aige des cellules Caco-2/15 la peroxydation par le FE/ASC entrane des effets pathologiques sur les fonctions mitochondriales et lintgrit de lADN, qui sont abolis par linduction de Nrf2. Il en ressort que Nrf2 joue un rle majeur dans la protection de lpithlium intestinal contre le stress oxydant.
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Introduction: Au Canada, le cancer de la prostate est le cancer le plus frquemment diagnostiqu chez les hommes et le plus mortel aprs les cancers du poumon et du clon. Il y a place optimiser le traitement du cancer de la prostate de manire mettre en uvre une mdecine personnalise qui sadapte aux caractristiques de la maladie de chaque patient de faon individuelle. Dans ce mmoire, nous avons valu la rponse aux dommages de lADN (RDA) comme biomarqueur potentiel du cancer de la prostate. Les lsions potentiellement oncognes de l'ADN dclenche une cascade de signalisation favorisant la rparation de l'ADN et lactivation des points de contrle du cycle cellulaire pour prserver lintgrit du gnome. La RDA est un mcanisme central de suppression tumorale chez lhomme. La RDA joue un rle important dans larrt de la prolifration des cellules dont les gnomes sont compromis, et donc, prvient la progression du cancer en agissant comme une barrire. Cette rponse cellulaire dtermine galement comment les cellules normales et cancreuses ragissent aux agents utiliss pour endommager l'ADN lors du traitement du cancer comme la radiothrapie ou la chimiothrapie, en plus la prsence d,un certain niveau de RDA dans les cellules du cancer de la prostate peuvent galement influer sur l'issue de ces traitements. Lactivation des signaux de la RDA peut agir comme un frein au cancer dans plusieurs lsions pr-noplasiques de l'homme, y compris le cancer de la prostate. Il a t dmontr que la RDA est augmente dans les cellules de noplasie intra- pithliale (PIN) comparativement aux cellules prostatiques normales. Toutefois, le devient de la RDA entre le PIN et ladnocarcinome est encore mal document et aucune corrlation n'a t ralise avec les donnes cliniques des patients. Notre hypothse est que les niveaux dactivation de la RDA seront variables selon les diffrents grades et agressivit du cancer de la prostate. Ces niveaux pourront tre corrls et possiblement prdire les rponses cliniques aux traitements des patients et aider dfinir une stratgie plus efficace et de nouveaux biomarqueurs pour prdire les rsultats du traitement et personnaliser les traitements en consquence. Nos objectifs sont de caractriser l'activation de la RDA dans le carcinome de la prostate et corrler ses donnes avec les rsultats cliniques. Mthodes : Nous avons utilis des micro-talages de tissus (tissue microarrays- TMAs) de 300 patients ayant subi une prostatectomie radicale pour un cancer de la prostate et dtermin le niveau dexpression de protines de RDA dans le compartiment stromal et pithlial des tissus normaux et cancreux. Les niveaux dexpression de 53BP1, p-H2AX, p65 et p-CHK2 ont t quantifis par immunofluorescence (IF) et par un logiciel automatis. Ces marqueurs de RDA ont dabord t valids sur des TMAs-cellule constitus de cellules de fibroblastes normales ou irradies (pour induire une activation du RDA). Les donnes ont t quantifies l'aide de couches binaires couramment utilises pour classer les pixels d'une image pour que lanalyse se fasse de manire indpendante permettant la dtection de plusieurs rgions morphologiques tels que le noyau, l'pithlium et le stroma. Des oprations arithmtiques ont ensuite t ralises pour obtenir des valeurs correspondant l'activation de la RDA qui ont ensuite t corrles la rcidive biochimique et l'apparition de mtastases osseuses. Rsultats : De faibles niveaux d'expression de la protine p65 dans le compartiment nuclaire pithlial du tissu normal de la prostate sont associs un faible risque de rcidive biochimique. Par ailleurs, nous avons aussi observ que de faibles niveaux d'expression de la protine 53BP1 dans le compartiment nuclaire pithliale du tissu prostatique normal et cancreux ont t associs une plus faible incidence de mtastases osseuses. Conclusion: Ces rsultats confirment que p65 a une valeur pronostique chez les patients prsentant un adnocarcinome de la prostate. Ces rsultats suggrent galement que le marqueur 53BP1 peut aussi avoir une valeur pronostique chez les patients avec le cancer de la prostate. La validation d'autres marqueurs de RDA pourront galement tre corrls aux rsultats cliniques. De plus, avec un suivi des patients plus long, il se peut que ces rsultats se traduisent par une corrlation avec la survie. Les niveaux d'activit de la RDA pourront ventuellement tre utiliss en clinique dans le cadre du profil du patient comme le sont actuellement lantigne prostatique spcifique (APS) ou le Gleason afin de personnaliser le traitement.
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La signalisation par lestrogne a longtemps t considre comme jouant un rle critique dans le dveloppement et la progression des cancers hormono-dpendants tel que le cancer du sein. Deux tiers des cancers du sein expriment le rcepteur des estrognes (ER) qui constitue un lment indiscutable dans cette pathologie. Lacquisition dune rsistance endocrinienne est cependant un obstacle majeur au traitement de cette forme de cancer. Lmergence de cancers hormono-indpendants peut est produite par lactivation de ER en absence destrogne, lhypersensibilit du rcepteur aux faibles concentrations plasmique destrogne ainsi que lactivation de ER par des modulateurs slectifs. Lactivit du ER est fortement influence par lenvironnement cellulaire tel que lactivation de voie de signalisation des facteurs de croissances, la disponibilit de protines co-rgulatrices et des squences promotrices cibles. Prsentement, les tudes ont principalement considres le rle de ER, cependant avec la dcouverte de ER, notre comprhension de la diversit des mcanismes potentiels impliquant des rponses ER-dpendantes sest amliore. Lactivation des voies des kinases par les facteurs de croissance entrane le dveloppement dun phnotype tumoral rsistant aux traitements actuels. Nos connaissances des voies impliques dans lactivation de ER sont restreintes. ER est considr comme le sous-type dominant et corrle avec la plupart des facteurs de pronostic dans le cancer du sein. Le rle de ER reste imprcis. Les rsultats prsents dans cette thse ont pour objectif de mieux comprendre limplication de ER dans la prolifration cellulaire par ltude du comportement de ER et ER suite lactivation des voies de signalisation par les facteurs de croissance. Nous dmontrons que lactivation des rcepteurs de surfaces de la famille ErbB, spcifiquement ErbB2/ErbB3, inhibe lactivit transcriptionnelle de ER, malgr la prsence du coactivateur CBP, tout en activant ER. De plus, linhibition de ER est attribue un rsidu srine (Ser-255) situ dans la rgion charnire, absente dans ER. Des tudes supplmentaires de ErbB2/ErbB3 ont rvl quils activent la voie PI3K/Akt ciblant son tour la Ser-255. En effet, cette phosphorylation de ER par PI3K/Akt induit une augmentation de lubiquitination du rcepteur qui promeut sa dgradation par le systme ubiquitine-protasome. Cette dgradation est spcifique pour ER. De faon intressante, la dgradation par le protasome requiert la prsence du coactivateur CBP normalement requis pour lactivit transcriptionnelle des rcepteurs nuclaires. Malgr le fait que lactivation de la voie PI3K/Akt corrle avec une diminution de lexpression des gnes sous le contrle de ER, on observe une augmentation de la prolifration des cellules cancreuses. Linhibition de la dgradation de ER rduit cette prolifration excessive cause par le traitement avec Hrg1, un ligand de ErbB3. Un nombre croissant dvidences indique que les voies de signalisations des facteurs de croissance peuvent slectivement rguler lactivit transcriptionnelle de sous-types de ER. De plus, le ratio ER/ER dans les cancers du sein devient un outil de diagnostique populaire afin de dterminer la svrit dune tumeur. En conclusion, la caractrisation molculaire du couplage entre la signalisation des facteurs de croissance et la fonction des ERs permettra le dveloppement de nouveaux traitements afin de limiter lapparition de cellules tumorales rsistantes aux thrapies endocriniennes actuelles.
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La priode de rceptivit endomtriale chez lhumain concide avec la diffrentiation des cellules stromales de lendomtre en cellules hautement spcifiques, les cellules dciduales, durant le processus dit de dcidualisation. Or, on sait quune transformation anormale des cellules endomtriales peut tre lorigine de pertes rcurrentes de grossesses. LRH-1 est un rcepteur nuclaire orphelin et un facteur de transcription rgulant de nombreux vnements relatif la reproduction et comme tout rcepteur, son activation promouvoit lactivit transcriptionnelle de ses gnes cibles. Nous avons dj montr que LRH-1 et son activit sont essentiels pour la dcidualisation au niveau de lutrus chez la souris et nous savons quil est prsent dans lutrus chez lhumain au moment de la phase de prolifration mais aussi de scrtion du cycle menstruel, et que son expression augmente dans des conditions de dcidualisation in vitro. Notre hypothse est alors la suivante : LRH-1 est indispensable la dcidualisation du stroma endomtrial, agissant par le biais de la rgulation transcriptionnelle de gnes requis pour la transformation de cellules stromales en cellules dciduales. Afin dexplorer le mcanisme molculaire impliqu dans la rgulation transcriptionnelle effectue par lintermdiaire de ce rcepteur, nous avons mis en place un modle de dcidualisation in vitro utilisant une ligne de cellules stromales de lendomtre, cellules humaines et immortelles (hESC). Notre modle de surexpression dvelopp en transfectant les dites cellules avec un plasmide exprimant LRH-1, rsulte en laugmentation, dun facteur 5, de labondance du transcriptome de gnes marqueurs de la dcidualisation que sont la prolactine (PRL) et linsulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). En outre, la sous-rgulation de ce rcepteur par lintermdiaire de petits ARN interfrents (shRNA) abolit la raction dciduale, dun point de vue morphologique mais aussi en terme dexpression des deux gnes marqueurs cits ci-dessus. Une analyse par Chromatin ImmunoPrcipitation (ou ChIP) a dmontr que LRH-1 se lie des rgions gnomiques se trouvant en aval de certains gnes importants pour la dcidualisation comme PRL, WNT 4, WNT 5, CDKN1A ou encore IL-24, et dans chacun de ces cas cits, cette capacit de liaison augmente dans le cadre de la dcidualisation in vitro. Par ailleurs, des tudes structurelles ont identifi les phospholipides comme des ligands potentiels pour LRH-1. Nous avons donc choisi dorienter notre travail de faon explorer les effets sur les ligands lis LRH-1 de traitements impliquant des agonistes et antagonistes notre rcepteur nuclaire. Les analyses par q-PCR et Western blot ont montr que la modulation de lactivit de LRH-1 par ses ligands influait aussi sur la raction dciduale. Enfin, des tudes rcentes de Salker et al (Salker, Teklenburg et al. 2010) ont mis en vidence que les cellules stromales humaines dcidualises sont de vritables biocapteurs de la qualit embryonnaire et quelles ont la capacit de migrer en direction de lembryon. La srie dexpriences que nous avons ralise laide de cellules hESC places en co-culture avec des embryons de souris confirme que la migration cellulaire est bien dirige vers les embryons. Cette proprit quant lorientation de la migration cellulaire est notoirement diminue dans le cas o lexpression de LRH-1 est dplte par shRNA dans les hESC. Nos donnes prouvent donc que LRH-1 rgule non seulement la transcription dun ensemble de gnes impliqus dans le processus de dcidualisation mais agit aussi sur la motilit directionnelle de ces cellules hESC dcidualises in vitro.
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Les maladies cardio-vasculaires (MCV), telles que lhypertension et lathrosclrose, saccompagnent de modifications structurales et fonctionnelles au niveau vasculaire. Un fonctionnement aberrant de la migration, lhypertrophie et la prolifration des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des vnements cellulaires lorigine de ces changements. Lendothline-1 (ET-1) contribue la pathognse des anomalies vasculaires, notamment via lactivation des protines MAPK et PI3-K/PKB, des composantes cls impliques dans les voies prolifratives et de croissance cellulaires. Il a t suggr que le stress oxydant jouerait un rle intermdiaire dans les effets pathophysiologiques vasculaires de lET-1. En consquence, une modulation de la signalisation induite par lET-1 peut servir comme ventuelle stratgie thrapeutique contre le dveloppement des MCV. Il apparat de nos jours un regain dintrt dans lutilisation des agents phyto-chimiques pour traiter plusieurs maladies. La curcumine, constituant essentiel de lpice curcuma, est dote de plusieurs proprits biologiques parmi lesquelles des proprits anti-oxydantes, anti-prolifratrices et cardio-protectrices. Cependant, les mcanismes molculaires de son effet cardio-protecteur demeurent obscurs. Dans cette optique, lobjectif de cette tude a t dexaminer lefficacit de la curcumine inhiber la signalisation induite par lET-1 dans les CMLV. La curcumine a inhib la phosphorylation des protines IGF-1R, PKB, c-Raf et ERK1/2, induite par lET-1 et lIGF-1. De plus, la curcumine a inhib lexpression du facteur de transcription Egr-1 induite par lET-1 et lIGF-1, dans les CMLV. Ces rsultats suggrent que la capacit de la curcumine attnuer ces voies de signalisation serait un mcanisme daction potentiel de ses effets protecteurs au niveau cardiovasculaire.
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Les lymphocytes B et T sont issus de cellules prognitrices lymphodes de la moelle osseuse qui se diffrencient grce laction de facteurs de transcription, cytokines et voies de signalisation, dont linterleukine-7 (IL-7)/IL-7 rcepteur (IL-7R). Le facteur de transcription c-Myc est exprim par les cellules lymphodes et contrle leur croissance et leur diffrenciation. Cette rgulation transcriptionnelle peut tre coordonne par le complexe c-Myc/Myc-Interacting Zinc finger protein-1 (Miz-1). Le but de ce projet tait de comprendre les mcanismes qui impliquent Miz-1 et le complexe c-Myc/Miz-1 dans le dveloppement des lymphocytes B et T. Pour raliser ce projet, des souris dficientes pour le domaine de transactivation de Miz-1 (Miz-1POZ) et des souris allles mutantes pour c-MycV394D, mutation qui empche linteraction avec Miz-1, ont t gnres. La caractrisation des souris Miz 1POZ a dmontr que linactivation de Miz-1 perturbe le dveloppement des lymphocytes B et T aux stades prcoces de leur diffrenciation qui dpend de lIL-7. Lanalyse de la cascade de signalisation IL-7/IL-7R a montr que ces cellules surexpriment la protine inhibitrice SOCS1 qui empche la phosphorylation de STAT5 et perturbe la rgulation la hausse de la protine de survie Bcl-2. De plus, Miz-1 se lie directement au promoteur de SOCS1 et contrle son activit. En plus de contrler laxe IL-7/IL-7R/STAT5/Bcl-2 spcifiquement aux stades prcoces du dveloppement afin dassurer la survie des progniteurs B et T, Miz-1 rgule laxe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B afin de coordonner les signaux ncessaires pour la diffrenciation des cellules immatures. La caractrisation des souris c-MycV394D a montr, quant elle, que les fonctions de Miz-1 dans les cellules B et T semblent indpendantes de c-Myc. Les cellules T des souris Miz-1POZ ont un dfaut de diffrenciation additionnel au niveau de la -slection, tape o les signaux initis par le TCR remplacent ceux induits par IL-7 pour assurer la prolifration et la diffrenciation des thymocytes en stades plus matures. cette tape du dveloppement, une forme fonctionnelle de Miz-1 semble tre requise pour contrler le niveau dactivation de la voie p53, induite lors du processus de rarrangement V(D)J du TCR. Lexpression de gnes pro-apoptotiques PUMA, NOXA, Bax et du rgulateur de cycle cellulaire p21CIP1 est rgule la hausse dans les cellules des souris Miz-1POZ. Ceci provoque un dbalancement pro-apoptotique qui empche la progression du cycle cellulaire des cellules TCR-positives. La survie des cellules peut tre rtablie ce stade de diffrenciation en assurant une coordination adquate entre les signaux initis par lintroduction dun TCR transgnique et dun transgne codant pour la protine Bcl-2. En conclusion, ces tudes ont montr que Miz-1 intervient deux niveaux du dveloppement lymphode: lun prcoce en contrlant la signalisation induite par lIL-7 dans les cellules B et T, en plus de laxe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B; et lautre tardif, en coordonnant les signaux de survie issus par le TCR et p53 dans les cellules T. tant donn que les thymocytes et lymphocytes B immatures sont sujets plusieurs rondes de prolifration, ces tudes serviront mieux comprendre limplication des rgulateurs du cycle cellulaire comme c-Myc et Miz-1 dans la gnration des signaux ncessaires la diffrenciation non aberrante et la survie des ces cellules. Enfin, les modles exprimentaux, souris dficientes ou allles mutantes, utiliss pour ce travail permettront de mieux dfinir les bases molculaires de la transformation maligne des lymphocytes B et T et de rvler les mcanismes conduisant au lymphome.
