Implication des endothélines et de leurs récepteurs vasculaires dans la circulation pulmonaire en condition contrôle et pathophysiologique

Le système endothéline (ET) est activé en condition d’hypertension pulmonaire (HTP). L’efficacité des antagonistes des récepteurs à l’ET a clairement été démontrée et a menée à l’approbation clinique de tels antagonistes dans le traitement de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Toutefois, il existe présentement un important débat opposant l’utilisation d’un antagoniste sélectif des récepteur ETA à l’utilisation d’un antagoniste double ETA/ETB dans le traitement de cette pathologie. Bien que nous sachions que le système ET est activé et contribue à l’HTAP, les modifications locales de ce système induites par la pathologie, particulièrement au niveau des artères de résistance pulmonaires, demeurent inconnues. De plus, l’impact de ces modifications sur la réponse pharmacologique aux divers antagonistes des récepteurs à l’ET (sélectifs versus double) est d’une importance capitale. Ainsi, le but de la première étude de cette thèse était d’évaluer les modifications potentielles de la pharmacologie du système ET au niveau des artères de résistance pulmonaires induites par l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’en condition contrôle l’antagoniste sélectif ETA et l’antagoniste double n’ont eu aucun effet sur la réponse vasoconstrictrice à l’ET-1. Toutefois, en condition d’HTAP, les antagonistes sélectif et double ont tous deux été en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire induite par l’ET-1. Une diminution importante de l’expression génique du récepteur ETB pourrait être à l’origine de cette modification du profil pharmacologique des antagonistes. Une meilleure compréhension des rôles joués par les récepteurs ETA et ETB au niveau des artères de résistance pulmonaires pourrait permettre l’optimisation des traitements de l’HTAP. Ainsi, le but de la deuxième étude était d’évaluer les effets d’un traitement antisens ex vivo dirigé contre l’ARNm des récepteurs ETA et ETB dans la vasoconstriction des artères de résistance pulmonaires induite par l’ET-1. Dans cette étude, nous avons démontré dans un premier temps que les récepteurs ETA et ETB pouvaient former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’expression protéique du R-ETA entraînait une potentialisation de la vasoconstriction ETB dépendante suggérant ainsi qu’en condition contrôle, le récepteur ETA aurait un effet inhibiteur sur la vasoconstriction pulmonaire induite par la stimulation du récepteur ETB. Les effets délétères de l’ET-1 sur la circulation pulmonaire sont bien connus, toutefois seules quelques études ont porté leur attention sur l’implication de l’ET-3 dans l’HTAP. Ainsi, le but de la troisième étude était d’évaluer l’implication potentielle de l’ET-3 dans l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’il était nécessaire en condition contrôle de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin de réduire la réponse vasoconstrictrice pulmonaire à l’ET-3. En condition d’HTAP, nous avons observé une augmentation non-significative des concentrations plasmatiques d’ET-3 ainsi qu’une modification du profil pharmacologique des antagonistes des récepteurs à l’ET. En effet, l’utilisation de l’antagoniste sélectif ETA ou de l’antagoniste double était dans les deux cas en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire à l’ET-3. Les résultats de ces trois études suggèrent qu’il est préférable d’utiliser un antagoniste double dans le traitement de l’HTAP. En effet, (1) en condition d’HTAP, l’utilisation d’un antagoniste double est aussi efficace que l’utilisation d’un antagoniste sélectif ETA; (2) les récepteurs ETA et ETB peuvent former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires et (3) le récepteur ETB joue un rôle prédominant dans la vasoconstriction pulmonaire, il semble donc essentiel de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin d’inhiber la réponse vasoconstrictrice induite par l’ET. Mots-clés: endothéline-1, endothéline-3, artère de résistance pulmonaire, récepteur vasculaire, antagoniste des récepteurs à l’ET, dimérisation, phosphorothioate, hypertension artérielle pulmonaire

Peptides vasoactifs endogènes dans la prolifération accrue des cellules musculaires lisses vasculaires de rats spontanément hypertendus: rôle des facteurs de croissance.

Contribuant à la pathophysiologie des maladies vasculaires comme dans le cas de l’hypertension, le remodelage vasculaire est associé à une altération de la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) (prolifération, taille, etc.). Or la prolifération des CMLV est augmentée par les peptides vasoactifs tels que l’angiotensine II (AngII) et l’endothéline-1 (ET-1). Ces peptides étant surexprimés lors de l’hypertension, cette étude fut entreprise pour déterminer leur contribution endogène ainsi que celles du facteur de croissance épidermique (EGF), du facteur de croissance insulinique (IGF-1) et du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) à la prolifération accrue des CMLV et aux mécanismes sous-jacents. Des CMLV A-10 et des CMLV de rats WKY et SHR âgés de 12 semaines ont été utilisées pour cette étude. La prolifération cellulaire fut déterminée par incorporation de [3H]thymidine. La phosphorylation de ERK 1/2 et du récepteur de EGF fut déterminée par immunobuvardage. Les CMLV de SHR, comparées à celles de WKY, ont montré une prolifération accrue qui fut atténuée par le losartan, un antagoniste du récepteur AT1 de l’AngII et par le BQ-123 et le BQ-788, antagonistes des récepteurs ETA et ETB de l’ET-1. La prolifération accrue des CMLV de SHR fut ramenée à celle des WKY par les inhibiteurs des récepteurs au PDGF (AG-1295), au IGF-1 (AG-1024) et au EGF (AG-1478). La phosphorylation du récepteur au EGF, accrue dans les CMLV de rats SHR comparée à celle des WKY, fut atténuée par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et l’AG-1478, mais ne fut pas atténuée par l’AG-1295 et l’AG-1024. De plus, la phosphorylation accrue de ERK 1/2 dans les CMLV de rats SHR fut atténuée par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et les inhibiteurs des récepteurs aux facteurs de croissance. Parallèlement, le rôle de la transactivation de EGF-R dans la prolifération accrue induite par AngII et ET-1 fut aussi examiné dans les CMLV A-10. L’augmentation, induite par AngII et ET-1, de la prolifération et de la phosphorylation de ERK 1/2 dans les CMLV A-10 fut ramenée au niveau contrôle par AG-1478. Ces données suggèrent que les peptides vasoactifs endogènes induisent la prolifération accrue des CMLV par la signalisation des MAP kinases résultant de la transactivation de EGF-R.

Étude de la polyubiquitination en lysine 63 dans les effets proinflammatoires de l'angiotensine II in vitro

Les évidences scientifiques révèlent l’implication des actions proinflammatoires de l’angiotensine II (Ang II) dans le développement de l’athérosclérose. Cependant, la caractérisation des bases moléculaires de l’Ang II sur le tissu vasculaire n’est pas totalement élucidée. La majorité des actions de l’Ang II implique l’activation d’une variété de cascades de signalisation dont les voies mitogen-activated protein kinases (MAPKs) ; c-Jun N-terminal kinases (JNKs), p38 kinases et extracellular signal-regulated kinases (ERK) et l’activation du facteur de transcription NF-κB via le complexe IKK. Récemment, une nouvelle modification post-traductionnelle dans les actions de l’Ang II, soit la polyubiquitination de la sous-unité NF-κB essential modulator (NEMO) du complexe IKK, a été révélée. L’objectif de mon projet de recherche est de vérifier l’importance de la polyubiquitination en K63 tout en caractérisant les protéines impliquées dans la modification de NEMO dans des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) exposées à l’Ang II. Notre étude suggère, selon une approche siARN combinant Ubc7 et Ubc13, la diminution de la phosphorylation du complexe IKK, de Akt et des MAPKs. De plus, nos résultats illustrent l’implication de TRAF6 dans la signalisation cellulaire de l’Ang II. Finalement, notre étude révèle la présence de la polyubiquitination en K63 dans la signalisation cellulaire de l’Ang II par chromatographie d’affinité. Cette étude met en évidence l’implication de la polyubiquitination en K63 dans la signalisation de l’Ang II dans des CMLV et implique Ubc13 et Ubc7 dans le remodelage vasculaire et l’inflammation dépendante de l’Ang II dans des CMLV.

Études du remodelage vasculaire utérin durant la grossesse : caractérisation du rôle de l’œstrogène et de son action vasorelaxante

La grossesse est un état physiologique particulier où de nombreux changements fonctionnels et structuraux surviennent. Chez la rate, pour répondre aux besoins grandissants du fœtus, l’artère utérine se développe pour atteindre le double de son diamètre original avant parturition. Par conséquent, le débit sanguin utérin augmente d’environ vingt fois. Pour ce faire, les vaisseaux utérins sont l’objet d’un remodelage caractérisé par une hypertrophie et une hyperplasie des différentes composantes de la paroi. De plus, ce remodelage est complètement réversible après la parturition, par opposition au remodelage vasculaire « pathologique » qui affecte les artères systémiques, dans l’hypertension chronique, par exemple. La grossesse s’accompagne aussi de modifications hormonales importantes, comme les œstrogènes dont la concentration s’accroît progressivement au cours de cette période. Elle atteindra une concentration trois cents fois plus élevée avant terme que chez une femme non gravide. Cette hormone possède de multiples fonctions, ainsi qu’un mode d’action à la fois génomique et non génomique. Considérant l’ensemble de ces éléments, nous avons formulé l’hypothèse que l’œstradiol serait responsable de modifier la circulation utérine durant la grossesse, par son action vasorelaxante, mais aussi en influençant le remodelage de la vasculature utérine. Nous avons montré que le 17β-Estradiol (17β-E2) produit une relaxation due à un effet non génomique des artères utérines en agissant directement sur le muscle lisse par un mécanisme indépendant du monoxyde d’azote et des récepteurs classiques aux œstrogènes (ERα, ERβ). De plus, la relaxation induite par le 17β-E2 dans l’artère utérine durant la gestation est réduite par rapport à celle des artères des rates non gestantes. Ceci serait attribuable à une diminution de monoxyde d’azote provenant de la synthase de NO neuronale dans les muscles lisses des artères utérines. Nos résultats démontrent que le récepteur à l’œstrogène couplé aux protéines G (GPER), la protéine kinase A (PKA) et la protéine kinase G (PKG) ne sont pas impliqués dans la signalisation intracellulaire associée à l’effet vasorelaxant induit par le 17β-E2. Cependant, nous avons montré une implication probable des canaux potassiques sensibles au voltage, ainsi qu’un rôle possible des canaux potassiques de grande conductance activés par le potentiel et le calcium (BKCa). En effet, le penitrem A, un antagoniste présumé des canaux potassiques à grande conductance, réduit la réponse vasoralaxante du 17β-E2. Toutefois, une autre action du penitrem A n’est pas exclue, car l’ibériotoxine, reconnue pour inhiber les mêmes canaux, n’a pas d’effet sur cette relaxation. Quoi qu’il en soit, d’autres études sont nécessaires pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la relaxation non génomique sur le muscle lisse des artères utérines. Quant à l’implication de l’œstrogène sur le remodelage des artères utérines durant la gestation, nous avons tenté d’inhiber la synthèse d’œstrogènes durant la gestation en utilisant un inhibiteur de l’aromatase. Plusieurs paramètres ont été évalués (paramètres sanguins, réactivité vasculaire, pression artérielle) sans changements significatifs entre le groupe contrôle et celui traité avec l’inhibiteur. Le même constat a été fait pour le dosage plasmatique de l’œstradiol, ce qui suggère l’inefficacité du blocage de l’aromatase dans ces expériences. Ainsi, notre protocole expérimental n’a pas réussi à inhiber la synthèse d’œstrogène durant la grossesse chez le rat et, ce faisant, nous n’avons pas pu vérifier notre hypothèse. En conclusion, nous avons démontré que le 17β-E2 agit de façon non génomique sur les muscles lisses des artères utérines qui implique une action sur les canaux potassiques de la membrane cellulaire. Toutefois, notre protocole expérimental n’a pas été en mesure d’évaluer les effets génomiques associés au remodelage vasculaire utérin durant la gestation et d’autres études devront être effectuées.

Early growth response protein 1 (Egr-1) expression by Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) involves MAPKs and PKB pathways

Un remodelage vasculaire anormal est à la base de la pathogenèse des maladies cardio-vasculaires (MCV) telles que l’athérosclérose et l’hypertension. Des dysfonctionnements au niveau de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires qui jouent un rôle primordial dans le remodelage vasculaire. L’insulin-like growth factor 1 (IGF-1), puissant facteur mitogène, contribue au développement des MCV, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, composantes clés impliquées dans les voies de croissance cellulaire. Ces molécules sont également impliquées dans la modulation de l’expression de nombreux facteurs de transcription, incluant le facteur Egr-1. Egr-1 est régulé à la hausse dans différents types de maladies vasculaires impliquant les voies de signalisation de croissance et de stress oxydant qui par ailleurs peuvent être déclenchées par l’IGF-1. Cependant, la question d’une possible modulation de l’expression d’Egr-1 dans les CMLV demeure inabordée; plus spécifiquement, la caractérisation de la voie de signalisation reliant l’action d’IGF-1 à l’expression d’Egr-1 reste à établir. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’implication de MAPK, PKB et des dérivés réactifs de l’oxygène (DRO) dans l’expression d’Egr-1 induite par l’IGF-1 dans les CMLV. L’IGF-1 a induit une augmentation marquée du niveau protéique de l’Egr-1 en fonction du temps et de la concentration utilisés. Cette augmentation a été inhibée en fonction des doses d’agents pharmacologiques qui ciblent les voies de signalisation de MAPK, PKB et DRO. De plus, l’expression du facteur de transcription, Egr-1, en réponse de l’IGF-1, a été atténuée suite à un blocage pharmacologique des processus cellulaires responsables de la synthèse d’ARN et de synthèse protéique. Pour conclure, on a démontré que l’IGF-1 stimule l’expression d’Egr-1 via les voies de signalisation, impliquant ERK1/2/JNK, PI3K/PKB. On a également proposé que les DRO jouent un rôle important dans ce processus. Dans l’ensemble, nous avons suggéré un nouveau mécanisme par lequel l’IGF-1 promeut la prolifération et l’hypertrophie cellulaire, processus à la base des anomalies vasculaires.

Implication des cellules Nestin+ dans le remodelage vasculaire en conditions pathologiques

La protéine de filament intermédiaire Nestin, marqueur de cellules souches neurales, est exprimée dans les cellules vasculaires. Il a été démontré que les cellules de la crosse aortique dérivent de la crête neurale pendant le développement. Des cellules endothéliales exprimant Nestin sont retrouvées dans les capillaires durant l’embryogénèse ainsi que durant la vascularisation de tumeurs cancéreuses. Cette protéine est impliquée dans les mécanismes de prolifération cellulaire. Récemment des cellules Nestin+ ont été identifiées au niveau des cellules du muscle lisse de l’aorte. La régulation de Nestin dans ces cellules, pendant le développement et en conditions pathologiques, est inconnue. Cette thèse porte sur l’analyse de la protéine Nestin dans le remodelage vasculaire en situation diabétique et d’hypertension au niveau des artères carotide et aortique. Nos travaux examinent l’hypothèse que l’expression vasculaire de Nestine joue un rôle dans l’homéostasie durant le vieillissement physiologique et participe au remodelage suite à des stimuli pathologiques. La protéine Nestin est fortement exprimée dans les aortes de rats néonataux et cette expression diminue rapidement avec le développement. Au niveau de l’aorte l’expression de la protéine Nestin est retrouvée dans une sous-population de cellules du muscle lisse et au niveau des cellules endothéliales. L’expression de la protéine Nestin est corrélée avec sa proximité au cœur, une plus grande expression est observée dans l’arche aortique et une faible expression est détectée dans la partie thoracique. Nous avons déterminé qu’en présence de diabète de type I, il y a une perte de l’expression de la protéine Nestin dans la média de l’aorte et de la carotide. Cette perte d’expression représente un évènement précoce dans la pathologie diabétique et précède la dysfonction endothéliale. La diminution de l’expression de la protéine Nestin est également concomitante avec la perte de la capacité proliférative des cellules du muscle lisse. Dans les rats souffrant de diabète de type 1, une réduction significative de la densité des cellules du muscle lisse exprimant la protéine phosphorylée phosphohistone 3, une protéine impliquée dans un cycle cellulaire actif, est observée. De plus, cette réduction est corrélée avec la perte de l’expression de la protéine Nestin. Nous avons également démontré in vitro qu’un traitement hyperglycémique réduit l’expression de Nestin ainsi que la prolifération des cellules du muscle lisse. Enfin, l’utilisation d’un shARN dirigé contre Nestin nous a permis de déterminer l’implication de cette protéine dans la prolifération des cellules du muscle lisse en condition basale caractérisée par la diminution de l’incorporation de [3H] thymidine. Dans le modèle d’hypertension induite par une constriction aortique abdominale surrénale, l’augmentation de la pression sanguine est associée avec l’augmentation de l’expression de la protéine Nestin dans l’artère carotidienne. Une corrélation positive a été observée entre l’expression de la protéine Nestin dans la carotide et la pression artérielle moyenne à laquelle la paroi de la carotide est soumise. De plus, les facteurs de croissance impliqués dans le remodelage vasculaire secondaire à l’hypertension augmentent l’expression de Nestin dans les cellules du muscle lisse isolées des carotides. Puis, la réduction de l’expression de la protéine Nestin via un shARN atténue l’incorporation de [3H] thymidine, associée à la prolifération cellulaire, stimulée par ces facteurs de croissance alors que l’incorporation de [3H] leucine, associée à la synthèse protéique, demeure inchangée. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression de la protéine Nestin, secondaire à l’hypertension, pourrait représenter une réponse adaptative où il y a une augmentation de la croissance des cellules du muscle lisse afin de permettre à la paroi vasculaire de s’ajuster à l’augmentation de la pression sanguine.

The effects of administration of a nuclear factor kappa-B inhibitor on pulmonary endothelial dysfunction after cardiopulmonary bypass: impact on oxygenation and hemodynamics and development of therapeutic and preventive modalities in a porcine model

Introduction: La circulation extracorporelle (CEC) peut entraîner une dysfonction endothéliale pulmonaire et l’hypertension pulmonaire. Le SN50 agit au niveau de la signalisation cellulaire pour prévenir ces réactions à la CEC et pourrait renverser la dysfonction endothéliale pulmonaire post-CEC sans effets néfastes sur l’hémodynamie. Méthodes: Quatre groups de porcs ont reçu un parmi quatre traîtements avant de subir 90 minutes de CEC et 60 minutes de reperfusion: (1) milrinone nébulisé; (2) sildenafil nébulisé; (3) placebo nébulisé; et (4) SN-50 intraveineux. Un monitoring hémodynamique invasif a été utilisé. La réactivité vasculaire des artères pulmonaires de deuxième ordre a été évaluée face à l’acétylcholine et la bradykinine. Résultats: Le sildénafil produit une augmentation significative de la pression de l’artère pulmonaire (PAP) moyenne à 60 minutes de reperfusion par rapport au début de la chirurgie. Les relaxations dépendantes de l’endothélium face à la bradykinine étaient meilleurs dans les groupes milrinone et SN-50 et surtout dans le groupe sildénafil par rapport au groupe placébo. Le SN-50 produisait de moins bonnes relaxations dépendantes de l’endothélium face à l’acétylcholine que les autres traitements incluant placébo. Conclusion: Le sildénafil prévient mieux la dysfonction endothéliale pulmonaire que les autres traitements. Les bénéfices du SN-50 sont possiblement sous-estimés vu que la dose n’a pas pu être ajustée à la durée de CEC. Le sildenafil inhalé mérite une étude plus importante chez l’humain et le SN-50 dans un model de CEC animal.

Signaling of angiotensin II-induced vascular protein synthesis in conduit and resistance arteries in vivo

Affiliation: Faculté de pharmacie, Université de Montréal & Institut de recherches cliniques de Montréal

L’effet des différents facteurs de croissance sur la viabilité et la prolifération des ostéoblastes scoliotiques

Résumé: La Scoliose Idiopathique de l’Adolescent (SIA) est une condition débilitante qui peut avoir comme résultat une douleur importante, une altération du fonctionnement quotidien et une détérioration de la qualité de vie. Pour les patients qui ne répondent pas au traitement conservateur, la fusion vertébrale, en utilisant des greffes osseuses, est devenue un traitement de choix pour stabiliser la colonne. Des connaissances plus pointues à propos des facteurs impliqués dans l’ostéogénèse et la formation de l’os peuvent raccourcir le processus de guérison et permettre aux patients de réintégrer leurs activités dans un laps de temps plus court. Les plaquettes peuvent jouer un rôle important dans la première étape de la guérison des fractures car elles sont une source autologue de plusieurs facteurs de croissance qui soutiennent la prolifération et la différenciation des ostéoblastes in vivo et in vitro. Au cours des dernières années, plusieurs tentatives ont été réalisées afin de trouver des traitements additionnels pour : 1) Raccourcir le temps de guérison des fractures relativement long ; 2) Obtenir une plus courte période de convalescence pour les patients qui ont besoin de prothèses ; 3) Corriger plus facilement plusieurs maladies congénitales; 4) Améliorer le processus de fusion vertébrale et 5) Développer de nouvelles approches thérapeutiques, notamment au niveau des processus régularisant le remodelage osseux et la régénération des tissus osseux. Dans le cadre de la présente étude, j’ai étudié la contribution possible du facteur de croissance de l’insuline (IGF) et du facteur vasculaire endothélial de croissance (VEGF) sur la maturation de l’ostéoblaste scoliotique dans des cultures cellulaires in vitro et j’ai comparé les résultats avec celles obtenues dans les mêmes conditions mais en stimulant les ostéoblastes avec de la mélatonine. Cette étude préliminaire a été réalisée sur des échantillons d’os récoltés de quatre patients atteints par la Scoliose Idiopathique de l‘Adolescent (SIA), ainsi que sur des échantillons d’os issus de quatre sujets témoins (cas traumatiques). Les résultats montrent que l’IGFs et le VEGFs possèdent une action d’inhibition sur la prolifération d’ostéoblastes scoliotiques et non scoliotiques, et que cette action est proportionnelle à la concentration de ces facteurs. Les ostéoblastes scoliotiques tendent à avoir une prolifération cellulaire plus rapide et plus élevée que les témoins non scoliotiques. De façon générale les ostéoblastes provenant de patients scoliotiques ont une ostéogénèse in vitro plus accélérée que le sujet non scoliotique. De plus, il semble que la mélatonine joue un rôle physiologique dans la différenciation de l’ostéoblaste scoliotique et elle semble aider à avoir une différenciation plus précoce que chez les non traités. Les ostéoblastes scoliotiques expriment un défaut d’expression de l’IGF 1 et d’IGF 1R en présence de la mélatonine. En conclusion, le VEGF A et l’IGF 1 peuvent également promouvoir la différenciation et la prolifération des ostéoblastes humains scoliotiques en culture primaire.

Étude du rôle de l’auto-antigène nucléaire centromérique B (CENP-B) et des auto-anticorps anti-CENP-B dans l’activation des cellules musculaires lisses vasculaires : implication potentielle dans la pathophysiologie de la sclérose systémique

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dont l’un des principaux auto-anticorps, dirigé contre la protéine centromérique B (CENP-B), est fortement associé à l’hypertension artérielle pulmonaire, l’une des causes majeures de décès dû à la ScS. L’hypertension résulte de l’occlusion progressive des vaisseaux suite à une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs études récentes ont démontré que certains auto-antigènes possèdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois libérés par nécrose ou apoptose, ces auto-antigènes adoptent une activité biologique qui s'apparente à celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de réparation de blessure et/ou acquérir une activité pathogène qui contribue au développement de certaines maladies auto-immunes. Nos résultats suggèrent que la CENP-B peut être ajoutée à cette liste de molécules bifonctionnelles. À l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytométrie en flux, nous avons démontré que la CENP-B se liait spécifiquement à la surface des CML vasculaire de l’artère pulmonaire avec une plus grande affinité pour le phénotype contractile que synthétique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protéine exerçait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des études de signalisation intracellulaire effectuées à l’aide de plusieurs inhibiteurs spécifiques ainsi que des études de désensibilisation nous ont permis d’identifier le récepteur de la CENP-B en plus d’identifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons démontré que la CENP-B se liait de manière spécifique aux CML vasculaire via le récepteur de chémokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le récepteur EGF, selon un mécanisme métalloprotéase-dépendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans l’activation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la sécrétion d’IL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons démontré que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empêchant ainsi la CENP-B d’exercer son rôle de cytokine. L’identification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant à l’étude du rôle pathogène des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS.

Modulation of Oxytocin Receptors in Right Ventricular Hypertrophy

L’hypertension pulmonaire (HP) est une maladie dont l’étiologie est inconnue et qui entraîne ultimement une défaillance du ventricule droit (VD) et le décès. L’HP peut être induite chez le rat par la la monocrotaline (MCT), un alcaloïde pyrrolizidique extrait de la plante Crotalaria Spectabilis, causant des lésions à l’endothélium des artères pulmonaires, menant à un épaississement de ces dernières et à une augmentation de la résistance vasculaire. Ceci à pour conséquence de causer une hypertrophie du VD, de l’inflammation, une dysfonction endothéliale NO-dépendante des artères coronariennes et une augmentation des peptides natriurétiques circulants. Objectif: Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle l’étiopathologie de l’HP impliquerait le récepteur à ocytocine (OTR) dû à son implication fonctionnelle avec les cytokines inflammatoires et la libération du peptide natriurétique atrial (ANP) et du NO. Méthodes: Des rats mâles Sprague-Dawley pesant 220-250g reçurent une seule injection sous-cutanée de MCT (60 mg/kg). 6 à 7 semaines (46±1 jours) suivant l’injection, les rats furent sacrifiés et l’expression génique et protéique fut déterminée par PCR en temps réel et par western blot, respectivement, dans le VD et le ventricule gauche (VG) Résultats: Les rats traités au MCT démontrèrent une augmentation significative du VD. Une hypertrophie du VD était évidente puisque le ratio du VD sur le VG ainsi que le poids du septum étaient près de 77% plus élevés chez les rats traités au MCT que chez les rats contrôles. Le traitement au MCT augmenta l’expression génique d’ANP (3.7-fois dans le VG et 8-fois dans le VD) ainisi que le NP du cerveau (2.7-fois dans le VG et 10-fois dans le VD). Les transcrits de trois récepteurs de NP augmentèrent significativement (0.3-2 fois) seulement dans le VD. L’expression protéique de la NO synthase (iNOS) fut également augmentée de façon sélective dans le VD. Par contre, les transcripts de NOS endothéliale et de NOS neuronale étaient plus élevés (0.5-2 fold) dans le VG. L’ARNm et l’expression protéique d’OTR furent diminués de 50% dans le VD, tandis qu’une augmentation de l’expression des cytokines IL-1β and IL-6 fut observée. L’ARNm de Nab1, un marqueur d’hypertrophie pathologique, fut augmentée de deux-fois dans le VD. Conclusion: L’augmentation d’expression génique de NP dans le VD des rats traités au MCT est associée à une augmentation des transcripts du récepteur NP, suggérant une action locale de NP dans le VD durant l’HP. L’expression d’OTR est atténuée dans le VD, possiblement par des cytokines inflammatoires puisque le promoteur du gène de l’OTR contient de multiples éléments de réponse aux interleukines. Diminuer l’expression d’OTR dans le VD durant l’hypertension pulmonaire pourrait influencer de manière positive la fonction cardiaque car l’OTR régule la contractilité et le rythme cardiaque. Mots clés: hypertension pulmonaire, hypertrophie du ventricule droit monocrotaline, récepteur à ocytocine, inflammation, peptides natriurétiques.

Endothelin-1 and H2O2-induced signaling in vascular smooth muscle cells : modulation by CaMKII and Nitric oxide

L’endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoactif extrêmement puissant qui possède une forte activité mitogénique dans les cellules du muscle lisse vasculaire (VSMCs). Il a été démontré que l’ET-1 est impliquée dans plusieurs maladies cardio-vasculaires, comme l’athérosclérose, l'hypertension, la resténose après l'angioplastie, l’insuffisance cardiaque et l'arythmie. L’ET-1 exerce ses effets via plusieurs voies de signalisation qui incluent le Ca2+, les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPKs) y compris les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB). Plusieurs études ont démontré que les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) peuvent jouer un rôle important dans la signalisation d’ERK1/2 et de PKB induite par plusieurs facteurs de croissance et hormones. Nous avons précédemment montré que l'ET-1 produit des ROS qui agissent comme médiateur de la signalisation cellulaire induite par l’ET-1. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), une molécule qui appartient à la famille des ROS, peut activer les voies de la MAPK et de la PKB dans les VSMCs. Par ailleurs, nos résultats suggèrent également que le Ca2+ et la calmoduline (CaM) sont essentiels pour la phosphorylation d’ERK1/2, de p38 et de PKB induite par le H2O2 dans les VSMCs. La Ca2+/CaM-dependent protein kinases II (CaMKII) est une sérine/thréonine protéine kinase multifonctionnelle activée par le Ca2+/CaM. Il a été montré que la CaMKII est impliquée dans les voies de signalisation induite par le H2O2 dans les cellules endothéliales. Cependant, le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de la proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) induite par l’ET-1 et le H2O2, de même que son rôle dans l’effet hypertrophique et prolifératif de l’ET-1 dans les VSMCs demeure inexploré. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule vasoactive impliquée dans la régulation de plusieurs réponses hormonales. Le NO peut moduler la signalisation contrôlant la croissance cellulaire induite par plusieurs agonistes d’où son rôle protecteur dans le système vasculaire. Des études ont montré que le NO peut inhiber la voie de Ras/Raf/ERK1/2 et la voie de PKB induite par le facteur de croissance endothélial (EGF) et l’angiotensine II (Ang II). Beaucoup d’autres travaux ont mis en évidence un cross-talk entre les voies de signalisation activées par l’ET-1 et le NO. La capacité du NO à inhiber la signalisation intracellulaire induite par l’ET-1 dans les VSMCs demeure inconnue. Le travail présenté dans cette thèse vise à déterminer le rôle du système Ca2+-CaM-CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 et le H2O2 ainsi que son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire induites par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également testé le rôle du NO dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 ainsi que la synthèse protéique induite par l’ET-1. Dans la première partie de notre étude, nous avons examiné le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs en utilisant trois approches différentes i.e. l'usage d'inhibiteurs pharmacologiques, un peptide auto-inhibiteur de la CaMKII (CaMKII AIP) et la technique de siRNA. Nous avons démontré que la CaMKII est impliquée dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Des études précédentes ont montré à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques comme le KN-93 que l'Ang II et les agents induisant une augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire comme l’ionomycine, provoquent la phosphorylation d’ERK1/2 via la CaM dans les VSMCs. Cependant, en utilisant différentes approches, nos études ont montré pour la première fois une implication de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également rapporté pour la première fois, un rôle crucial de la CaMKII dans la pathophysiologie vasculaire associée à l’ET-1 puisque l’activation de la CaMKII joue un rôle important dans l’hypertrophie et la croissance cellulaire. Dans la deuxième partie, à la lumière des études précédentes qui montraient que les ROS agissent comme médiateurs de la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs, nous avons examiné si la CaMKII est également impliquée dans l’activation des voies d’ERK1/2 et de PKB induite par le H2O2. En utilisant des approches pharmacologiques et moléculaires, nous avons montré, comme pour l’ET-1, que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par le H2O2. Nous avons précédemment montré que la transactivation du récepteur de type I de l’insulin-like growth factor (IGF-1R) est nécessaire à l’activation de PKB induite par le H2O2. Pour cette raison, nous avons examiné l'effet de l'inhibition de la CaMKII par l’inhibiteur pharmacologique ou par le knock-down de la CaMKII sur la phosphorylation d’IGF-1R induite par le H2O2. Les résultats démontrent que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et d’IGF-1R induite par le H2O2. Dans la troisième partie de notre étude, nous avons également examiné le mécanisme moléculaire par lequel le NO exerce ses effets anti-mitogéniques et anti-hypertrophiques dans la signalisation induite par l’ET-1. En testant l'effet de deux différents donneurs de NO (S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), sodium nitroprusside (SNP)) et un inhibiteur de NO synthase, le N (G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1, nous avons observé que le NO a un effet inhibiteur sur la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Par ailleurs, le 8-Br-GMPc, un analogue du GMPc, a un effet similaire à celui des deux donneurs du NO, tandis que l’oxadiazole quinoxaline (ODQ), un inhibiteur de la guanylate cyclase soluble, inverse l'effet inhibiteur du NO. Nous concluons que le NO diminue la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 d’une manière dépendante du GMPc. Le NO inhibe aussi les effets hypertrophiques de l’ET-1 puisque le traitement avec le SNAP diminue la synthèse des protéines induite par l’ET-1. En résumé, les études présentées dans cette thèse démontrent que l’ET-1 et le H2O2 sont des activateurs de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 dans les VSMCs et que la CaMKII s’avère nécessaire pour ce processus, en agissant en amont de l’activation de IGF-1R induite par le H2O2 dans les VSMCs. Elles montrent également que le NO inhibe la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1. Enfin, nos travaux suggèrent aussi que l’activation de la CaMKII stimule la synthèse des protéines et de l’ADN induites par l’ET-1 alors que le NO inhibe la synthèse des protéines induite par ET-1. Mots clés: Endothéline ; Peroxyde d'hydrogène ; CaMKII ; Monoxyde d’azote ; Système vasculaire ; PKB; ERK1/2; IGF-1R; Hypertrophie.

Hydrogen peroxide enhances the expression and function of Giα proteins in aortic vascular smooth muscle cells from Sprague-Dawley rats : role of growth factor receptors transactivation

Nous avons récemment démontré que les espèces réactives oxygénées induisent une augmentation de l’expression des protéines Giα dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) provenant d’aortes de rats spontanément hypertendus (SHR, de l’anglais spontaneously hypertensive rats). La présente étude a pour but d’étudier les effets du peroxyde d’hydrogène (H2O2), un oxydant qui induit le stress oxydatif, sur l’expression de Giα et sur l’activité de l’adénylate cyclase, et d’explorer les voies de signalisation sous-jacentes responsables de cette réponse. Nos résultats montrent que H2O2 induit une augmentation de l’expression des protéines Giα-2 et Giα-3 de manière dose- et temps-dépendante avec une augmentation maximale de 40-50% à 100 µM après 1 heure, sans affecter l’expression de Gsα. L’expression des protéines Giα a été maintenue au niveau normal en presence de AG 1478, AG1295, PD98059 et la wortmannine, des inhibiteurs d’EGF-R (de l’anglais epidermal growth factor receptor), PDGFR-β (de l’anglais platelet-derived growth factor receptor β), de la voie de signalisation ras-ERK1/2 (de l’anglais extracellular regulated kinase1/2), et de la voie de la PI3Kinase-AKT (de l’anglais phosphatidyl inositol-3 kinase), respectivement. En outre, le traitement des CMLV avec H2O2 a induit une augmentation du degré de phosphorylation d’EGF-R, PDGF-R, ERK1/2 et AKT; et cette expression a été maintenue au niveau témoin par leurs inhibiteurs respectifs. Les inhibiteurs d’EGF-R et PDGF-R ont aussi induit une diminution du degré de phosphorylation de ERK1/2, et AKT/PKB. En outre, la transfection des cellules avec le siRNA (de l’anglais, small interfering ribonucleic acid) de EGF-R et PDGFR-β a atténué la surexpression des protéines Giα-2 et Giα-3 induite par le traitement au H2O2. La surexpression des protéines Giα induite par H2O2 a été corrélée avec une augmentation de la fonction de la protéine Giα. L’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par de faibles concentrations de GTPγS après stimulation par la forskoline a augmenté de 20% dans les cellules traitées au H2O2. En outre, le traitement des CMLV au H2O2 a aussi accru l’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par les hormones inhibitrices telles que l’angiotensine II, oxotrémorine et C-ANP4-23. D’autre part, la stimulation de l’adénylate cyclase induite par GTPγS, glucagon, isoprotérénol, forskoline, et le fluorure de sodium (NaF) a été atténuée de façon significative dans les cellules traitées au H2O2. Ces résultats suggèrent que H2O2 induit la surexpression des protéines Giα-2 and Giα-3 via la transactivation des récepteurs des facteurs de croissance EGF-R, PDGFR-β et l’activation des voies de signalisation ras-ERK1/2 et PI3K-AKT Mot-cles: Protéines Giα, peroxyde d’hydrogène, stress oxydant, récepteurs des facteurs de croissance, MAP kinases, adénylate cyclase, hypertension

L'élastographie ultrasonore dynamique vasculaire : une nouvelle modalité d'imagerie non-invasive pour la caractérisation mécanique de la thrombose veineuse

L’accident thromboembolique veineux, tel que la thrombose veineuse profonde (TVP) ou thrombophlébite des membres inférieurs, est une pathologie vasculaire caractérisée par la formation d’un caillot sanguin causant une obstruction partielle ou totale de la lumière sanguine. Les embolies pulmonaires sont une complication mortelle des TVP qui surviennent lorsque le caillot se détache, circule dans le sang et produit une obstruction de la ramification artérielle irriguant les poumons. La combinaison d’outils et de techniques d’imagerie cliniques tels que les règles de prédiction cliniques (signes et symptômes) et les tests sanguins (D-dimères) complémentés par un examen ultrasonographique veineux (test de compression, écho-Doppler), permet de diagnostiquer les premiers épisodes de TVP. Cependant, la performance de ces outils diagnostiques reste très faible pour la détection de TVP récurrentes. Afin de diriger le patient vers une thérapie optimale, la problématique n’est plus basée sur la détection de la thrombose mais plutôt sur l’évaluation de la maturité et de l’âge du thrombus, paramètres qui sont directement corrélées à ses propriétés mécaniques (e.g. élasticité, viscosité). L’élastographie dynamique (ED) a récemment été proposée comme une nouvelle modalité d’imagerie non-invasive capable de caractériser quantitativement les propriétés mécaniques de tissus. L’ED est basée sur l’analyse des paramètres acoustiques (i.e. vitesse, atténuation, pattern de distribution) d’ondes de cisaillement basses fréquences (10-7000 Hz) se propageant dans le milieu sondé. Ces ondes de cisaillement générées par vibration externe, ou par source interne à l’aide de la focalisation de faisceaux ultrasonores (force de radiation), sont mesurées par imagerie ultrasonore ultra-rapide ou par résonance magnétique. Une méthode basée sur l’ED adaptée à la caractérisation mécanique de thromboses veineuses permettrait de quantifier la sévérité de cette pathologie à des fins d’amélioration diagnostique. Cette thèse présente un ensemble de travaux reliés au développement et à la validation complète et rigoureuse d’une nouvelle technique d’imagerie non-invasive élastographique pour la mesure quantitative des propriétés mécaniques de thromboses veineuses. L’atteinte de cet objectif principal nécessite une première étape visant à améliorer les connaissances sur le comportement mécanique du caillot sanguin (sang coagulé) soumis à une sollicitation dynamique telle qu’en ED. Les modules de conservation (comportement élastique, G’) et de perte (comportement visqueux, G’’) en cisaillement de caillots sanguins porcins sont mesurés par ED lors de la cascade de coagulation (à 70 Hz), et après coagulation complète (entre 50 Hz et 160 Hz). Ces résultats constituent les toutes premières mesures du comportement dynamique de caillots sanguins dans une gamme fréquentielle aussi étendue. L’étape subséquente consiste à mettre en place un instrument innovant de référence (« gold standard »), appelé RheoSpectris, dédié à la mesure de la viscoélasticité hyper-fréquence (entre 10 Hz et 1000 Hz) des matériaux et biomatériaux. Cet outil est indispensable pour valider et calibrer toute nouvelle technique d’élastographie dynamique. Une étude comparative entre RheoSpectris et la rhéométrie classique est réalisée afin de valider des mesures faites sur différents matériaux (silicone, thermoplastique, biomatériaux, gel). L’excellente concordance entre les deux technologies permet de conclure que RheoSpectris est un instrument fiable pour la mesure mécanique à des fréquences difficilement accessibles par les outils actuels. Les bases théoriques d’une nouvelle modalité d’imagerie élastographique, nommée SWIRE (« shear wave induced resonance dynamic elastography »), sont présentées et validées sur des fantômes vasculaires. Cette approche permet de caractériser les propriétés mécaniques d’une inclusion confinée (e.g. caillot sanguin) à partir de sa résonance (amplification du déplacement) produite par la propagation d’ondes de cisaillement judicieusement orientées. SWIRE a également l’avantage d’amplifier l’amplitude de vibration à l’intérieur de l’hétérogénéité afin de faciliter sa détection et sa segmentation. Finalement, la méthode DVT-SWIRE (« Deep venous thrombosis – SWIRE ») est adaptée à la caractérisation de l’élasticité quantitative de thromboses veineuses pour une utilisation en clinique. Cette méthode exploite la première fréquence de résonance mesurée dans la thrombose lors de la propagation d’ondes de cisaillement planes (vibration d’une plaque externe) ou cylindriques (simulation de la force de radiation par génération supersonique). DVT-SWIRE est appliquée sur des fantômes simulant une TVP et les résultats sont comparés à ceux donnés par l’instrument de référence RheoSpectris. Cette méthode est également utilisée avec succès dans une étude ex vivo pour l’évaluation de l’élasticité de thromboses porcines explantées après avoir été induites in vivo par chirurgie.

Modulation of Endothelin-1 and Insulin-like Growth Factor Type 1-induced Signaling by Curcumin in A-10 Vascular Smooth Muscle Cells

Les maladies cardio-vasculaires (MCV), telles que l’hypertension et l’athérosclérose, s’accompagnent de modifications structurales et fonctionnelles au niveau vasculaire. Un fonctionnement aberrant de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires à l’origine de ces changements. L’endothéline-1 (ET-1) contribue à la pathogénèse des anomalies vasculaires, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, des composantes clés impliquées dans les voies prolifératives et de croissance cellulaires. Il a été suggéré que le stress oxydant jouerait un rôle intermédiaire dans les effets pathophysiologiques vasculaires de l’ET-1. En conséquence, une modulation de la signalisation induite par l’ET-1 peut servir comme éventuelle stratégie thérapeutique contre le développement des MCV. Il apparaît de nos jours un regain d’intérêt dans l’utilisation des agents phyto-chimiques pour traiter plusieurs maladies. La curcumine, constituant essentiel de l’épice curcuma, est dotée de plusieurs propriétés biologiques parmi lesquelles des propriétés anti-oxydantes, anti-prolifératrices et cardio-protectrices. Cependant, les mécanismes moléculaires de son effet cardio-protecteur demeurent obscurs. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’efficacité de la curcumine à inhiber la signalisation induite par l’ET-1 dans les CMLV. La curcumine a inhibé la phosphorylation des protéines IGF-1R, PKB, c-Raf et ERK1/2, induite par l’ET-1 et l’IGF-1. De plus, la curcumine a inhibé l’expression du facteur de transcription Egr-1 induite par l’ET-1 et l’IGF-1, dans les CMLV. Ces résultats suggèrent que la capacité de la curcumine à atténuer ces voies de signalisation serait un mécanisme d’action potentiel de ses effets protecteurs au niveau cardiovasculaire.