Genes involved in the metabolism of fatty acids and risk for Crohn's disease in children: a candidate gene study

Contexte - La prévalence de la maladie de Crohn (MC), une maladie inflammatoire chronique du tube digestif, chez les enfants canadiens se situe parmi les plus élevées au monde. Les interactions entre les réponses immunes innées et acquises aux microbes de l'hôte pourraient être à la base de la transition de l’inflammation physiologique à une inflammation pathologique. Le leucotriène B4 (LTB4) est un modulateur clé de l'inflammation et a été associé à la MC. Nous avons postulé que les principaux gènes impliqués dans la voie métabolique du LTB4 pourrait conférer une susceptibilité accrue à l'apparition précoce de la MC. Dans cette étude, nous avons exploré les associations potentielles entre les variantes de l'ADN des gènes ALOX5 et CYP4F2 et la survenue précoce de la MC. Nous avons également examiné si les gènes sélectionnés montraient des effets parent-d'origine, influençaient les phénotypes cliniques de la MC et s'il existait des interactions gène-gène qui modifieraient la susceptibilité à développer la MC chez l’enfant. Méthodes – Dans le cadre d’une étude de cas-parents et de cas-témoins, des cas confirmés, leurs parents et des contrôles ont été recrutés à partir de trois cliniques de gastro-entérologie à travers le Canada. Les associations entre les polymorphismes de remplacement d'un nucléotide simple (SNP) dans les gènes CYP4F2 et ALOX5 ont été examinées. Les associations allélique et génotypiques ont été examinées à partir d’une analyse du génotype conditionnel à la parenté (CPG) pour le résultats cas-parents et à l’aide de table de contingence et de régression logistique pour les données de cas-contrôles. Les interactions gène-gène ont été explorées à l'aide de méthodes de réduction multi-factorielles de dimensionnalité (MDR). Résultats – L’étude de cas-parents a été menée sur 160 trios. L’analyse CPG pour 14 tag-SNP (10 dans la CYP4F2 et 4 dans le gène ALOX5) a révélé la présence d’associations alléliques ou génotypique significatives entre 3 tag-SNP dans le gène CYP4F2 (rs1272, p = 0,04, rs3093158, p = 0.00003, et rs3093145, p = 0,02). Aucune association avec les SNPs de ALOX5 n’a pu être démontrée. L’analyse de l’haplotype de CYP4F2 a montré d'importantes associations avec la MC (test omnibus p = 0,035). Deux haplotypes (GAGTTCGTAA, p = 0,05; GGCCTCGTCG, p = 0,001) montraient des signes d'association avec la MC. Aucun effet parent-d'origine n’a été observé. Les tentatives de réplication pour trois SNPs du gene CYP4F2 dans l'étude cas-témoins comportant 225 cas de MC et 330 contrôles suggèrent l’association dans un de ceux-ci (rs3093158, valeur non-corrigée de p du test unilatéral = 0,03 ; valeur corrigée de p = 0.09). La combinaison des ces deux études a révélé des interactions significatives entre les gènes CYP4F2, ALOX et NOD2. Nous n’avons pu mettre en évidence aucune interaction gène-sexe, de même qu’aucun gène associé aux phénotypes cliniques de la MC n’a pu être identifié. Conclusions - Notre étude suggère que la CYP4F2, un membre clé de la voie métabolique LTB4 est un gène candidat potentiel pour MC. Nous avons également pu mettre en évidence que les interactions entre les gènes de l'immunité adaptative (CYP4F2 et ALOX5) et les gènes de l'immunité innée (NOD2) modifient les risques de MC chez les enfants. D'autres études sur des cohortes plus importantes sont nécessaires pour confirmer ces conclusions.

Effect of fatty acids on hyphal growth in the pathogenic yeast Candida albicans

Candida albicans est une levure pathogène qui, à l’état commensal, colonise les muqueuses de la cavité orale et du tractus gastro-intestinal. De nature opportuniste, C. albicans cause de nombreuses infections, allant des candidoses superficielles (muguet buccal, vulvo-vaginite) aux candidoses systémiques sévères. C. albicans a la capacité de se développer sous diverses morphologies, telles que les formes levures, pseudohyphes et hyphes. Des stimuli environnementaux mimant les conditions retrouvées chez l’hôte (température de 37°C, pH neutre, présence de sérum) induisent la transition levure-à-hyphe (i.e. morphogenèse ou filamentation). Cette transition morphologique contribue à la pathogénicité de C. albicans, du fait que des souches présentant un défaut de filamentation sont avirulentes. Non seulement la morphogenèse est un facteur de virulence, mais elle constituerait aussi une cible pour le développement d’antifongiques. En effet, il a déjà été démontré que l’inhibition de la transition levure-à-hyphe atténuait la virulence de C. albicans lors d’infections systémiques. Par ailleurs, des études ont démontré que de nombreuses molécules pouvaient moduler la morphogenèse. Parmi ces molécules, certains acides gras, dont l’acide linoléique conjugué (CLA), inhibent la formation d’hyphes. Ainsi, le CLA posséderait des propriétés thérapeutiques, du fait qu’il interfère avec un déterminant de pathogénicité de C. albicans. Par contre, avant d’évaluer son potentiel thérapeutique dans un contexte clinique, il est essentiel d’étudier son mode d’action. Ce projet vise à caractériser l’activité anti-filamentation des acides gras et du CLA et à déterminer le mécanisme par lequel ces molécules inhibent la morphogenèse chez C. albicans. Des analyses transcriptomiques globales ont été effectuées afin d’obtenir le profil transcriptionnel de la réponse de C. albicans au CLA. L’acide gras a entraîné une baisse des niveaux d’expression de gènes encodant des protéines hyphes-spécifiques et des régulateurs de morphogenèse, dont RAS1. Ce gène code pour la GTPase Ras1p, une protéine membranaire de signalisation qui joue un rôle important dans la transition levure-à-hyphe. Des analyses de PCR quantitatif ont confirmé que le CLA inhibait l’induction de RAS1. De plus, le CLA a non seulement causé une baisse des niveaux cellulaires de Ras1p, mais a aussi entraîné sa délocalisation de la membrane plasmique. En affectant les niveaux et la localisation cellulaire de Ras1p, le CLA nuit à l’activation de la voie de signalisation Ras1p-dépendante, inhibant ainsi la morphogenèse. Il est possible que le CLA altère la structure de la membrane plasmique et affecte indirectement la localisation membranaire de Ras1p. Ces travaux ont permis de mettre en évidence le mode d’action du CLA. Le potentiel thérapeutique du CLA pourrait maintenant être évalué dans un contexte d’infection, permettant ainsi de vérifier qu’une telle approche constitue véritablement une stratégie pour le traitement des candidoses.

Anaerobic Digestibility of Microalgae : Fate and Limitations of Long Chain Fatty Acids in the Biodegradation of Lipids

La digestion anaérobie est un processus biologique dans lequel un consortium microbien complexe fonctionnant en absence d’oxygène transforme la matière organique en biogaz, principalement en méthane et en dioxyde de carbone. Parmi les substrats organiques, les lipides sont les plus productifs de méthane par rapport aux glucides et aux protéines; mais leur dégradation est très difficile, en raison de leur hydrolyse qui peut être l’étape limitante. Les algues peuvent être une source importante pour la production de méthane à cause de leur contenu en lipides potentiellement élevé. L’objectif de cette étude était, par conséquent, d’évaluer la production en méthane des microalgues en utilisant la technique du BMP (Biochemical méthane Potential) et d’identifier les limites de biodégradion des lipides dans la digestion anaérobie. Le plan expérimental a été divisé en plusieurs étapes: 1) Comparer le potentiel énergétique en méthane des macroalgues par rapport aux microalgues. 2) Faire le criblage de différentes espèces de microalgues d’eau douce et marines afin de comparer leur potentiel en méthane. 3) Déterminer l'impact des prétraitements sur la production de méthane de quelques microalgues ciblées. 4) Identifier les limites de biodégradation des lipides algaux dans la digestion anaérobie, en étudiant les étapes limitantes de la cinétique des lipides et de chacun des acides gras à longues chaines. Les résultats ont montré que les microalgues produisent plus de méthane que les macroalgues. Les BMP des microalgues d'eau douce et marines n'ont montré aucune différence en termes de rendement en méthane. Les résultats des prétraitements ont montré que le prétraitement thermique (microonde) semblait être plus efficace que le prétraitement chimique (alcalin). Les tests de contrôle du BMP faits sur l'huile de palme, l’huile de macadamia et l'huile de poisson ont montré que l'hydrolyse des huiles en glycérol et en acides gras à longues chaines n'était pas l'étape limitante dans la production de méthane. L'ajout de gras dans les échantillons de Phaeodactylum dégraissée a augmenté le rendement de méthane et cette augmentation a été corrélée à la quantité de matières grasses ajoutées.

Mechanisms of lipid malabsorption in Cystic Fibrosis: the impact of essential fatty acids deficiency

Affiliation: CHU-Sainte-Justine, Université de Montréal

Polymeric micelles as versatile carriers for drugs and nucleic acids

Le cancer est la principale cause de mortalité au Canada. Les taxanes (e.g. le paclitaxel et le docétaxel (DCTX)) constituent des remèdes efficaces contre une série de tumeurs solides telles que les cancers du sein, du poumon et de l’ovaire. Par ailleurs, des acides nucléiques (e.g. les oligonucléotides antisens (AON) ou les petits ARN interférents (siRNAs)), capables de supprimer sélectivement certains oncogènes impliqués dans la carcinogénèse, sont actuellement étudiés pour traiter une large gamme de cancers. Bien que l’activité des taxanes et des acides nucléiques soit bien établie sur des modèles humains et/ou animaux, plusieurs aspects physico-chimiques et cliniques restent encore à améliorer. Leur solubilité limitée (pour les taxanes), leur dégradation rapide dans le sang (pour les acides nucléiques), leur élimination précoce, leur absence de sélectivité et leur toxicité envers les tissus sains sont les principaux facteurs limitant leur efficacité. C’est pourquoi de nombreux efforts ont porté sur l’élaboration de systèmes de vectorisation ciblés à base de polymères, dans le but de surmonter les problèmes associés aux thérapies actuelles. Dans cette thèse, deux types de micelles polymères ont été développés pour la vectorisation de DCTX et d’acides nucléiques. D’une part, des micelles de poly(oxyde d’éthylène)-bloc-poly(oxyde de butylène/styrène) ont été étudiées pour la première fois pour solubiliser le DCTX et le protéger de l’hydrolyse. Ces polymères se sont révélés moins toxiques que le surfactant utilisé commercialement pour solubiliser le DCTX (i.e. polysorbate 80) et ont permis une libération prolongée du principe actif. D’autre part, deux systèmes différents de micelles polyioniques (PICM) ont été mis au point pour la vectorisation d’acides nucléiques. De nouveaux conjugués de poly(éthylène glycol) (PEG)-oligonucléotide ont été proposés pour la protection et la libération contrôlée d’AON. Lorsque ces conjugués ont été formulés avec des dendrimères de poly(amidoamine) (PAMAM), des complexes de taille homogène ont été obtenus. Ces PICM ont permis de prolonger la libération de l’AON et de le protéger efficacement contre la dégradation enzymatique. De plus, des polymères de poly(oxyde d’éthylène)-bloc-poly(méthacrylate de propyle-co-acide méthacrylique) ont été incorporés afin de conférer des propriétés acido-sensibles aux PICM. Dans ces micelles, formées de ce dernier polymère formulé avec le dendrimère PAMAM, des oligonucléotides (AON et siRNA) ciblant l’oncogène Bcl-2 ont été encapsulés. L’internalisation cellulaire fut assurée par un fragment d’anticorps monoclonal (Fab’) situé à l’extrémité de la couronne de PEG. Après l’internalisation cellulaire et la protonation des unités d’acide méthacrylique sous l’effet de l’acidification des endosomes, les micelles se sont affranchies de leur couronne. Elles ont ainsi exposé leur cœur composé d’acide nucléique et de dendrimère PAMAM, qui possède une charge positive et des propriétés endosomolytiques. En effet, ces PICM acido-sensibles ciblées ont permis d’augmenter la biodisponibilité des acides nucléiques vectorisés et se sont avérées plus efficaces pour silencer l’oncoprotéine Bcl-2 que les micelles non ciblées ou que le dendrimère de PAMAM commercial seul. Finalement, les nanovecteurs polymères présentés dans cette thèse se révèlent être des systèmes prometteurs pour la vectorisation des anticancéreux et des acides nucléiques.

Physiopathologie du diabète secondaire à la fibrose kystique : études transversales et prospectives

Résumé L’augmentation de l’espérance de vie chez les patients atteints de fibrose kystique (FK) entraine une augmentation de la prévalence des anomalies de tolérance au glucose, soit l’intolérance au glucose (IGT) et le diabète (DAFK). En dépit du fait, que les anomalies de la tolérance au glucose soient associées à un mauvais prognostic, l’origine de ces troubles n’est pas encore clairement établie. Notre objectif était d’examiner le rôle de l’insulinopénie et de la résistance à l’insuline dans la détérioration de la tolérance au glucose dans une cohorte prospective observationelle patients FK non diabétique. Nos résultats démontrent une réduction marquée de la phase précoce de la sécrétion de l’insuline ainsi qu’une augmentation de l’aire sous la courbe de la glycémie (AUC) chez tous les groupes de patients. Nous avons aussi démontré qu’une variation de la sensibilité à l’insuline joue un rôle prépondérant dans les changements de catégorie de tolérance au glucose dans cette population. Finalement, il semblerait que l’augmentation de l’AUC du glucose et la réduction de la phase précose de la sécrétion d’insuline sont des meileurs prédicateurs du status clinique que les catégories de tolérance au glucose. Il existe plusieurs indices pour évaluer la sécrétion d’insuline et pourtant aucun n’a été validé chez les patients FK. Nous avons examiné la validité des index de la sécrétion de l’insuline dérivés de l’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) ainsi que des valeurs à jeun par rapport au test de référence. Alors que la plupart des index calculés à partir de l’HGPO corrèlent significativement avec les valeurs du test de référence, cela n’est pas le cas pour les index calculés à partir des valeurs à jeun. La validation de ces index nous permet d’évaluer la sécrétion de l’insuline prospectivement dans notre cohorte de FK à partir de l’HGPO, est un test recommandé pour le dépistage du DAFK. Les recommandations nutritionnelles suggèrent aux patients FK une diète comprenant environ 40% de lipides afin d’éviter la malnutrition. Nous avons examiné le profil lipidique des patients FK diabétiques et non diabétiques après une HGPO et un repas hyperlipidique (RT). Nos résultats démontrent que la FK est associée à des augmentations de l’excursion glycémique lors de l’HGPO ou d’un RT comparativement aux témoins. Cependant, le RT provoque 1) une plus faible excursion glycémique comparativement à l’HGPO ; 2) une meilleure suppression de la production hépatique de glucose et 3) l’excursion lipidique postprandiale des patients FK reste normale. Il est donc peu probable que les anomalies de la sécrétion de l’insuline par les cellules  soient secondaires à une lipotoxicité. Nous avons aussi examiné les taux d’adiponectine, une hormone sécrétée par le tissu adipeux et pouvant moduler l’action de l’insuline. Les niveaux d’adiponectine corrèlent négativement avec plusieurs facteurs présents chez les patients FK incluant l’IGT, l’inflammation et une adiposité centrale en dépit d'un faible poids corporel. Les patients FK ne présentaient aucune altération des taux d’adiponectine malgré la présence d’une résistance à l’insuline, une inflammation sub-clinique et de l’IGT. La FK apparaît donc comme une condition où il existe une discordance entre les taux d’adiponectine et la résistance à l’insuline ou l’inflammation. En conclusion la prévalence de l’IGT est élevée dans cette population caractérisée par une excursion glycémique anormalement plus élevée, due principalement à une altération de la sécrétion de l’insuline exacerbée par une résistance à l’insuline. Mots clés : Adiponectine, Hyperglycémie par voie oral (HGPO), intolérance au glucose, fibrose kystique, diabète, résistance à l’insuline, sécrétion de l’insuline.

Étude dans la cellule bêta pancréatique de voies inhibitrices de la sécrétion d'insuline liées au métabolisme des lipides

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique complexe causée par des facteurs génétiques mais aussi environnementaux, tels la sédentarité et le surpoids. La dysfonction de la cellule β pancréatique est maintenant reconnue comme l’élément déterminant dans le développement du DT2. Notre laboratoire s’intéresse à la sécrétion d’insuline par la cellule β en réponse aux nutriments calorigéniques et aux mécanismes qui la contrôle. Alors que la connaissance des mécanismes responsables de l’induction de la sécrétion d’insuline en réponse aux glucose et acides gras est assez avancée, les procédés d’inhibition de la sécrétion dans des contextes normaux ou pathologiques sont moins bien compris. L’objectif de la présente thèse était d’identifier quelques-uns de ces mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique, et ce en situation normale ou pathologique en lien avec le DT2. La première hypothèse testée était que l’enzyme mitochondriale hydroxyacyl-CoA déshydrogénase spécifique pour les molécules à chaîne courte (short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, SCHAD) régule la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG) par la modulation des concentrations d’acides gras ou leur dérivés tels les acyl-CoA ou acyl-carnitine dans la cellule β. Pour ce faire, nous avons utilisé la technologie des ARN interférants (ARNi) afin de diminuer l’expression de SCHAD dans la lignée cellulaire β pancréatique INS832/13. Nous avons par la suite vérifié chez la souris DIO (diet-induced obesity) si une exposition prolongée à une diète riche en gras activerait certaines voies métaboliques et signalétiques assurant une régulation négative de la sécrétion d’insuline et contribuerait au développement du DT2. Pour ce faire, nous avons mesuré la SIIG, le métabolisme intracellulaire des lipides, la fonction mitochondriale et l’activation de certaines voies signalétiques dans les îlots de Langerhans isolés des souris normales (ND, normal diet) ou nourries à la dière riche en gras (DIO) Nos résultats suggèrent que l’enzyme SCHAD est importante dans l’atténuation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose et les acides aminés. En effet, l’oxydation des acides gras par la protéine SCHAD préviendrait l’accumulation d’acyl-CoA ou de leurs dérivés carnitine à chaîne courtes potentialisatrices de la sécrétion d’insuline. De plus, SCHAD régule le métabolisme du glutamate par l’inhibition allostérique de l’enzyme glutamate déshydrogénase (GDH), prévenant ainsi une hyperinsulinémie causée par une sur-activité de GDH. L’étude de la dysfonction de la cellule β dans le modèle de souris DIO a démontré qu’il existe une grande hétérogénéité dans l’obésité et l’hyperglycémie développées suite à la diète riche en gras. L’orginialité de notre étude réside dans la stratification des souris DIO en deux groupes : les faibles et forts répondants à la diète (low diet responders (LDR) et high diet responder (HDR)) sur la base de leur gain de poids corporel. Nous avons mis en lumières divers mécanismes liés au métabolisme des acides gras impliqués dans la diminution de la SIIG. Une diminution du flux à travers le cycle TG/FFA accompagnée d’une augmentation de l’oxydation des acides gras et d’une accumulation intracellulaire de cholestérol contribuent à la diminution de la SIIG chez les souris DIO-HDR. De plus, l’altération de la signalisation par les voies AMPK (AMP-activated protein kinase) et PKC epsilon (protéine kinase C epsilon) pourrait expliquer certaines de ces modifications du métabolisme des îlots DIO et causer le défaut de sécrétion d’insuline. En résumé, nous avons mis en lumière des mécanismes importants pour la régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique saine ou en situation pathologique. Ces mécanismes pourraient permettre d’une part de limiter l’amplitude ou la durée de la sécrétion d’insuline suite à un repas chez la cellule saine, et d’autre part de préserver la fonction de la cellule β en retardant l’épuisement de celle-ci en situation pathologique. Certaines de ces voies peuvent expliquer l’altération de la sécrétion d’insuline dans le cadre du DT2 lié à l’obésité. À la lumière de nos recherches, le développement de thérapies ayant pour cible les mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline pourrait être bénéfique pour le traitement de patients diabétiques.

Caractérisation et régulation du métabolisme des acides gras dans l’hypothalamus

Un déséquilibre de la balance énergétique constitue la principale cause du développement des pathologies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type 2. Au sein du cerveau, l’hypothalamus joue un rôle primordial dans le contrôle de la prise alimentaire et du métabolisme périphérique via le système nerveux autonome. Ce contrôle, repose sur l’existence de différentes populations neuronales au sein de l’hypothalamus médio-basal (MBH), neurones à neuropeptide Y (NPY)/Agouti-related peptide (AgRP), et neurones a proopiomelanocortine (POMC), dont l’activité est directement modulée par les variations des taux circulants des nutriments tels que le glucose et les acides gras (FA). Alors que les mécanismes de détection et le métabolisme intracellulaire du glucose ont été largement étudiés, l’implication du métabolisme intracellulaire des FA dans leurs effets centraux, est très peu comprise. De plus, on ignore si le glucose, module le métabolisme intracellulaire des acides gras à longue chaine (LCFA) dans le MBH. Le but de notre première étude est, de déterminer l'impact du glucose sur le métabolisme des LCFA, le rôle de l’AMP-activated protein kinase (AMPK), kinase détectrice du statut énergétique cellulaire, et d'établir s’il y a des changements dans le métabolisme des LCFA en fonction de leur structure, du type cellulaire et de la région cérébrale. Nos résultats montrent que le glucose inhibe l'oxydation du palmitate via l’AMPK dans les neurones et les astrocytes primaires hypothalamiques, in vitro, ainsi que dans les explants du MBH, ex vivo, mais pas dans les astrocytes et les explants corticaux. De plus, le glucose augmente l'estérification du palmitate et non de l’oléate dans les neurones et les explants du MBH, mais pas dans les astrocytes hypothalamiques. Ces résultats décrivent le devenir métabolique de différents LCFA dans le MBH, ainsi que, la régulation AMPK - dépendante de leur métabolisme par le glucose dans les astrocytes et les neurones, et démontrent pour la première fois que le métabolisme du glucose et des LCFA est couplé spécifiquement dans les noyaux du MBH, dont le rôle est critique pour le contrôle de l'équilibre énergétique. Le deuxième volet de cette thèse s’est intéressé à déterminer les mécanismes intracellulaires impliqués dans le rôle de la protéine de liaison ACBP dans le métabolisme central des FA. Nous avons démontré que le métabolisme de l’oléate et non celui du palmitate est dépendant de la protéine ACBP, dans les astrocytes hypothalamiques ainsi que dans les explants du MBH. Ainsi, nos résultats démontrent qu’ACBP, protéine identifiée originellement au niveau central, comme un modulateur allostérique des récepteurs GABA, agit comme un régulateur du métabolisme intracellulaire des FA. Ces résultats ouvrent de nouvelles pistes de recherche liées à la régulation du métabolisme des acides gras au niveau central, ainsi que, la nouvelle fonction de la protéine ACBP dans la régulation du métabolisme des FA au niveau du système nerveux central. Ceci aiderait à identifier des cibles moléculaires pouvant contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques de pathologies telles que l’obésité et le diabète de type 2.