The Effects of Pro-inflammatory Cytokines on the L-type Calcium Current in Mouse Ventricular Myocytes

L’inflammation: Une réponse adaptative du système immunitaire face à une insulte est aujourd’hui reconnue comme une composante essentielle à presque toutes les maladies infectieuses ou autres stimuli néfastes, tels les dommages tissulaires incluant l’infarctus du myocarde et l’insuffisance cardiaque. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, l’inflammation se caractérise principalement par une activation à long terme du système immunitaire, menant à une faible, mais chronique sécrétion de peptides modulateurs, appelés cytokines pro-inflammatoires. En effet, la littérature a montré à plusieurs reprises que les patients souffrant d’arythmies et de défaillance cardiaque présentent des taux élevés de cytokines pro-inflammatoires tels le facteur de nécrose tissulaire alpha (TNFα), l’interleukine 1β (IL-1β) et l’interleukine 6. De plus, ces patients souffrent souvent d’une baisse de la capacité contractile du myocarde. Le but de notre étude était donc de déterminer si un lien de cause à effet existe entre ces phénomènes et plus spécifiquement si le TNFα, l’IL-1β et l’IL-6 peuvent affecter les propriétés électriques et contractiles du cœur en modulant le courant Ca2+ de type L (ICaL) un courant ionique qui joue un rôle primordial au niveau de la phase plateau du potentiel d’action ainsi qu’au niveau du couplage excitation-contraction. Les possibles méchansimes par lesquels ces cytokines exercent leurs effets seront aussi explorés. Pour ce faire, des cardiomyocytes ventriculaires de souris nouveau-nées ont été mis en culture et traités 24 heures avec des concentrations pathophysiologiques (30 pg/mL) de TNFα, IL-1β ou IL-6. Des enregistrements de ICaL réalisés par la technique du patch-clamp en configuration cellule entière ont été obtenus par la suite et les résultats montrent que le TNFα n’affecte pas ICaL, même à des concentrations plus élevées (1 ng/mL). En revanche, l’IL-1β réduisait de près de 40% la densité d’ICaL. Afin d’examiner si le TNFα et l’IL-1β pouvaient avoir un effet synergique, les cardiomyocytes ont été traité avec un combinaison des deux cytokines. Toutefois aucun effet synergique sur ICaL n’a été constaté. En outre, l’IL-6 réduisait ICaL significativement, cependant la réduction de 20% était moindre que celle induite par IL-1β. Afin d’élucider les mécanismes sous-jacents à la réduction de ICaL après un traitement avec IL-1β, l’expression d’ARNm de CaV1.2, sous-unité α codante pour ICaL, a été mesurée par qPCR et les résultats obtenus montrent aucun changement du niveau d’expression. Plusieurs études ont montré que l’inflammation et le stress oxydatif vont de pair. En effet, l’imagerie confocale nous a permis de constater une augmentation accrue du stress oxydatif induit par IL-1β et malgré un traitement aux antioxydants, la diminution de ICaL n’a pas été prévenue. Cette étude montre qu’IL-1β et IL-6 réduisent ICaL de façon importante et ce indépendamment d’une régulation transcriptionelle ou du stress oxydatif. De nouvelles données préliminaires suggèrent que ICaL serait réduit suite à l’activation des protéines kinase C mais des études additionelles seront nécessaires afin d’étudier cette avenue. Nos résultats pourraient contribuer à expliquer les troubles du rythme et de contractilité observés chez les patients souffrant de défaillance cardiaque.

Pro-inflammatory and angiogenic activities of VEGF and angiopoietins in murine sponge/Matrigel model

La dérégulation de la formation et l'intégrité des vaisseaux sanguins peut conduire à un état pathologique tel qu’observé dans de nombreuses maladies ischémiques telles que: la croissance de tumeur solide, l’arthrite rhumatoïde, le psoriasis, les rétinopathies et l'athérosclérose. Par conséquent, la possibilité de moduler l'angiogenèse régionale chez les patients souffrant d'ischémie est cliniquement pertinente. Un élément clé dans l'induction de l'angiogenèse pathologique est une inflammation qui précède et accompagne la formation des nouveaux vaisseaux. Ce phénomène est démontré par l'augmentation de la perméabilité vasculaire et le recrutement de monocytes/ macrophages et cellules polynucléaires (neutrophiles). En collaboration avec d'autres groupes, nous avons montré que différents facteurs de croissance tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire et les angiopoïétines peuvent non seulement promouvoir l'angiogenèse mais aussi induire diverses étapes connexes au processus de la réaction inflammatoire, y compris la synthèse et la libération des médiateurs inflammatoires et la migration des neutrophiles. Les objectifs de notre étude étaient d'adresser si le vascular endothelial growth factor (VEGF) et les angiopoïétines (Ang1 et Ang2) sont capables de promouvoir la formation des nouveaux vaisseaux sanguins au fil du temps et d'identifier la présence de différentes cellules inflammatoires dans ce processus. Des éponges d'alcool polyvinylique stérilisées et imbibées de Matrigel appauvri en facteur de croissance (contenant PBS, VEGF, Ang1 ou Ang2 (200 ng/200 μl)) ont été insérées sous la peau de souris C57/Bl6 anesthésiées. Les éponges ont ensuite été retirées aux jours 4, 7, 14 ou 21 après la procédure pour des analyses histologiques, immunohistologiques et cytométriques. La formation des nouveaux vaisseaux a été validée par la coloration au Trichrome de Masson et des analyses histologiques et immunohistologiques contre les cellules endothéliales (anti-CD31). De plus, la maturation des vaisseaux a été démontrée par la coloration séquentielle contre les cellules endothéliales (anti-CD31) et musculaires lisses (anti-alpha-actine). Nous avons effectué la même procédure pour caractériser le recrutement de neutrophiles (anti-MPO), et de macrophages (anti-F4/80). Afin de mieux délimiter la présence de différents sous-ensembles de leucocytes recrutés dans les éponges, nous avons utilisé une technique de cytométrie en flux sur des préparations de cellules isolées à partir de ces éponges. Nous avons observé que le VEGF et les angiopoïétines favorisent le recrutement de cellules endothéliales et la formation de nouveaux vaisseaux plus rapidement qu’en présence de PBS. Une fois formé au jour 7, ces nouveaux vaisseaux restent stables en nombre, et ne subissent pas une réorganisation importante de leur surface. Ces vaisseaux maturent grâce au recrutement et au recouvrement par les cellules musculaires lisses des néovaisseaux. En outre, le microenvironnement angiogénique est composé de cellules inflammatoires, principalement de neutrophiles, macrophages et quelques cellules de type B et T. Donc, le VEGF, l’Ang1 et l’Ang2 induisent séparément la formation et la stabilisation de nouveaux vaisseaux sanguins, ainsi que le recrutement de cellules inflammatoires avec des puissances différentes et une action temps-dépendante dans un modèle d’éponge/Matrigel.

Angiopoietin like-2: a pro-inflammatory and pro-oxidative protein that contributes to endothelial dysfunction

Le vieillissement vasculaire est caractérisé par une dysfonction de l’endothélium. De nombreux facteurs de risque cardiovasculaire tels que l’obésité et l’hypertension prédisposent l’endothélium à un stress oxydant élevé aboutissant à une dysfonction endothéliale, celle-ci étant communément accompagnée d’une diminution de la biodisponibilité du monoxyde d’azote. Bien que la fonction endothéliale soit un déterminant majeur de la prédiction du risque cardiovasculaire des patients, son évaluation individuelle reste très limitée. En conséquence, il existe un intérêt scientifique grandissant pour la recherche de meilleurs biomarqueurs. L’Angiopoiétine like-2 (angptl2), une protéine identifiée récemment, joue un rôle pro-inflammatoire et pro-oxydant dans plusieurs désordres causés par une inflammation chronique allant de l’obésité à l’athérosclérose. L’inflammation et un stress oxydant accru ont été établis comme des mécanismes sous-jacents à l’apparition d’une dysfonction endothéliale, c’est pourquoi ce travail met l’accent sur le rôle de l’angptl2 dans la dysfonction endothéliale. Plus précisément, ce travail vise à: 1) déterminer les effets aigus de l’angptl2 sur la fonction endothéliale, 2) caractériser la fonction endothéliale et la contribution des différents facteurs relaxants dérivés de l'endothélium (EDRF) dans plusieurs lits vasculaires, et ce, dans un modèle de souris réprimant l’expression de l’angptl2 (knock-down, KD), et 3) examiner si l'absence d'expression angptl2 protège contre la dysfonction endothéliale induite par un régime riche en graisses (HFD) ou par perfusion d'angiotensine II (angII) chez la souris. Dans la première étude, l’incubation aigue avec de l’angptl2 recombinante induit une dysfonction endothéliale dans les artères fémorales isolées de souris de type sauvage (WT), probablement en raison d’une production accrue d'espèces réactives oxygénées. Les artères fémorales de souris angptl2 KD présentent une meilleure fonction endothéliale en comparaison aux souris WT, vraisemblablement par une plus grande contribution de la prostacycline dans la vasodilatation. Après 3 mois d’une diète HFD, les principaux EDRF respectifs des artères fémorales et mésentériques sont conservés uniquement dans les souris angptl2 KD. Cette préservation est associée à un meilleur profil métabolique, une moindre accumulation de triglycérides dans le foie et des adipocytes de plus petite taille. De plus, l’expression de gènes inflammatoires dans ces tissus adipeux n’est augmentée que chez les souris WT. Dans la seconde étude, l’absence d’angptl2 résulte en une production accrue de monoxyde d’azote dans les artères cérébrales isolées par rapport à celles des souris WT. La perfusion chronique d’angII provoque, seulement chez les souris WT, une dysfonction endothéliale cérébrale probablement par le biais d’une augmentation de la production d’espèces réactives oxygénées, probablement dérivé des NADPH oxydase 1 et 2, ainsi que l'augmentation des facteurs constricteurs dérivés de l’endothélium issus de la cyclo-oxygénase. En revanche, l’apocynine réduit la dilatation cérébrale chez les souris KD traitées à l’angII, ce qui suggère le recrutement potentiel d’une voie de signalisation compensatoire impliquant les NADPH oxydases et qui aurait un effet vaso-dilatateur. Ces études suggèrent fortement que l’angptl2 peut avoir un impact direct sur la fonction endothéliale par ses propriétés pro-inflammatoire et pro-oxydante. Dans une optique d’application à la pratique clinique, les niveaux sanguins d’angptl2 pourraient être un bon indicateur de la fonction endothéliale.

Modalities of exercise training on liver fat accretion and inflammatory markers in ovariectomized rats

Les facteurs de risque des maladies cardiovasculaires, telle, que la détérioration du profil lipidique, deviennent plus prononcés après la ménopause, ce qui fait de la maladie coronarienne, l’une des principales causes de décès chez les femmes ménopausées. Une proportion importante de femmes prennent du poids après la ménopause en particulier dans la région abdominale entraînant par conséquent des perturbations métaboliques. Des données récentes suggèrent également que l’absence des œstrogènes observée à la ménopause favorise le développement de la stéatose hépatique. Cette dernière a été incriminée pour incriminée dans le développement de la résistance à l'insuline, et est de ce fait considérée comme une composante hépatique du syndrome métabolique. Il est impératif d'établir des stratégies visant à contrecarrer l'accumulation de graisse dans le foie et l’accroissement du tissu adipeux chez les femmes ménopausées, en tenant compte que l'utilisation de l'hormonothérapie substitutive est de nos jours moins soutenue. Les quatre études de la présente thèse ont été conduites pour tenter de fournir des informations sur le traitement et la prévention de l’augmentation de la masse graisseuse et de la stéatose hépatique qu’entraîne la suppression des œstrogènes, à travers les modifications du mode de vie (diète et exercice physique) chez la rate ovariectomizée (Ovx); un modèle animal de la ménopause. Dans les deux premières études nous nous sommes concentrés sur l’augmentation de la masse graisseuse et sa reprise suite à une perte de poids. Dans la première étude, nous avons montré que les rates Ovx qui ont suivi un programme de restriction alimentaire (FR) ont diminué significativement (P < 0.01) leur poids corporel, leur contenu en graisses intra-abdominales ainsi que leurs triacylglycérols (TAG) hépatiques, comparativement aux rates Ovx nourries à la diète normale. De plus, l’entraînement en résistance (RT) a prévenu la reprise de poids corporel ainsi que l’accroissement du tissu adipeux et l’accumulation de lipides dans le foie des rates Ovx, après l’arrêt du régime amaigrissant. Les résultats de la deuxième étude ont confirmé l'efficacité de la restriction alimentaire associée à l’entraînement en résistance (FR + RT) dans la réduction du poids corporel, des lipides dans le foie et le tissu adipeux chez les rates Ovx. Tenant compte des résultats de notre première étude, l’entraînement en résistance seulement a constitué un atout pour atténuer le poids corporel et la masse grasse reprise par les rates Ovx suite à un programme de perte de poids (FR + RT); bien que l'impact ait été moindre comparé au maintien seul de la restriction alimentaire. De la même manière que la supplémentation en œstrogènes, les résultats de la troisième étude indiquent que l'entraînement en endurance mené concurremment avec l’ovariectomie a significativement atténué l'accumulation de lipides dans le foie ainsi que dans le tissu adipeux. Toutefois, l’entraînement en endurance effectué avant l'ovariectomie n'a pas protégé contre l'accumulation des graisses qu’entraîne l'ovariectomie, si celui-ci est interrompu après l'ovariectomie. Enfin, pour compléter les résultats antérieurs, nous avons montré dans la quatrième étude que l’expression des gènes impliqués dans la synthèse de lipide; SREBP-1c, SCD-1, ChREBP, et ACC dans le foie a augmenté après le retrait des œstrogènes, tandis qu’une diminution (P < 0.01) des niveaux d'ARNm de PPAR-α a été observée. De plus, l'expression hépatique des gènes des cytokines pro-inflammatoires incluant IKKβ, IL-6 ainsi que le contenu protéinique de NF-кB étaient augmentés (P < 0.01) chez les rates Ovx par rapport aux rates ayant subi une Ovx simulée (Sham). Toutes ces perturbations ont été améliorées avec la supplémentation en œstrogènes seulement, ainsi qu'avec l'entraînement en endurance seulement. Dans l'ensemble, nos résultats indiquent que l'exercice physique (en résistance ou en endurance) a un impact significatif sur la réduction de l'accumulation des lipides dans le foie et dans le tissu adipeux des rates Ovx. De plus, chez les rates Ovx, l’entraînement en endurance mimerait les effets des œstrogènes sur l'expression des gènes impliqués dans l'accumulation de lipides et l’inflammation préclinique dans le foie.

Studies on the exaggerated inflammatory response caused by streptococcus suis at systemic and central nervous system levels

Streptococcus suis de type 2 est un microorganisme pathogène d’importance chez le porc. Il est la cause de différentes pathologies ayant comme caractéristique commune la méningite. C’est également un agent émergeant de zoonose : des cas cliniques humains ont récemment été rapportés en Asie. Cependant, la pathogénèse de S. suis n’est pas encore complètement élucidée. Jusqu’à présent, la réponse pro-inflammatoire initiée par S. suis n’a été étudiée qu’in vitro. L’étude du choc septique et de la méningite requiert toujours des modèles expérimentaux appropriés. Au cours de cette étude, nous avons développé un modèle in vivo d’infection chez la souris qui utilise la voie d’inoculation intra-péritonéale. Ce modèle a servi à l’étude de la réponse pro-inflammatoire associée à ce pathogène, tant au niveau systémique qu’au niveau du système nerveux central (SNC). Il nous a également permis de déterminer si la sensibilité aux infections à S. suis pouvait être influencée par des prédispositions génétiques de l’hôte. Le modèle d’infection par S. suis a été mis au point sur des souris de lignée CD1. Les résultats ont démontré une bactériémie élevée pendant les trois jours suivant l’infection. Celle-ci était accompagnée d’une libération rapide et importante de différentes cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-12p40/p70, IFN-ɣ) et de chémokines (KC, MCP-1 and RANTES), qui ont entraîné un choc septique et la mort de 20 % des animaux. Ensuite, pour confirmer le rôle de l’inflammation sur la mortalité et pour déterminer si les caractéristiques génétiques de l’hôte pouvaient influencer la réponse inflammatoire et l’issue de la maladie, le modèle d’infection a été étendu à deux lignées murines consanguines différentes considérées comme résistante : la lignée C57BL/6 (B6), et sensible : la lignée A/J. Les résultats ont démontré une importante différence de sensibilité entre les souris A/J et les souris B6, avec un taux de mortalité atteignant 100 % à 20 h post-infection (p.i.) pour la première lignée et de seulement 16 % à 36 h p.i. pour la seconde. La quantité de bactéries dans le sang et dans les organes internes était similaire pour les deux lignées. Donc, tout comme dans la lignée CD1, la bactériémie ne semblait pas être liée à la mort des souris. La différence entre les taux de mortalité a été attribuée à un choc septique non contrôlé chez les souris A/J infectées par S. suis. Les souris A/J présentaient des taux exceptionnellement élevés de TNF-α, IL-12p40/p70, IL-1β and IFN- γ, significativement supérieurs à ceux retrouvés dans la lignée B6. Par contre, les niveaux de chémokines étaient similaires entre les lignées, ce qui suggère que leur influence est limitée dans le développement du choc septique dû à S. suis. Les souris B6 avaient une production plus élevée d’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, ce qui suppose que la cascade cytokinaire pro-inflammatoire était mieux contrôlée, entraînant un meilleur taux de survie. Le rôle bénéfique potentiel de l’IL-10 chez les souris infectées par S. suis a été confirmé par deux approches : d’une part en bloquant chez les souris B6 le récepteur cellulaire à l’IL-10 (IL-10R) par un anticorps monoclonal anti-IL-10R de souris et d’autre part en complémentant les souris A/J avec de l’IL-10 de souris recombinante. Les souris B6 ayant reçu le anticorps monoclonal anti-IL-10R avant d’être infectées par S. suis ont développé des signes cliniques aigus similaires à ceux observés chez les souris A/J, avec une mortalité rapide et élevée et des taux de TNF-α plus élevés que les souris infectées non traitées. Chez les souris A/J infectées par S. suis, le traitement avec l’IL-10 de souris recombinante a significativement retardé l’apparition du choc septique. Ces résultats montrent que la survie au choc septique dû à S. suis implique un contrôle très précis des mécanismes pro- et anti-inflammatoires et que la réponse anti-inflammatoire doit être activée simultanément ou très rapidement après le début de la réponse pro-inflammatoire. Grâce à ces expériences, nous avons donc fait un premier pas dans l’identification de gènes associés à la résistance envers S. suis chez l’hôte. Une des réussites les plus importantes du modèle d’infection de la souris décrit dans ce projet est le fait que les souris CD1 ayant survécu à la septicémie présentaient dès 4 jours p.i. des signes cliniques neurologiques clairs et un syndrome vestibulaire relativement similaires à ceux observés lors de méningite à S. suis chez le porc et chez l’homme. L’analyse par hybridation in situ combinée à de l’immunohistochimie des cerveaux des souris CD1 infectées a montré que la réponse inflammatoire du SNC débutait avec une augmentation significative de la transcription du Toll-like receptor (TLR)2 et du CD14 dans les microvaisseaux cérébraux et dans les plexus choroïdes, ce qui suggère que S. suis pourrait se servir de ces structures comme portes d’entrée vers le cerveau. Aussi, le NF-κB (suivi par le système rapporteur de l’activation transcriptionnelle de IκBα), le TNF-α, l’IL-1β et le MCP-1 ont été activés, principalement dans des cellules identifiées comme de la microglie et dans une moindre mesure comme des astrocytes. Cette activation a également été observée dans différentes structures du cerveau, principalement le cortex cérébral, le corps calleux, l’hippocampe, les plexus choroïdes, le thalamus, l’hypothalamus et les méninges. Partout, cette réaction pro-inflammatoire était accompagnée de zones extensives d’inflammation et de nécrose, de démyélinisation sévère et de la présence d’antigènes de S. suis dans la microglie. Nous avons mené ensuite des études in vitro pour mieux comprendre l’interaction entre S. suis et la microglie. Pour cela, nous avons infecté des cellules microgliales de souris avec la souche sauvage virulente (WT) de S. suis, ainsi qu’avec deux mutants isogéniques, un pour la capsule (CPS) et un autre pour la production d’hémolysine (suilysine). Nos résultats ont montré que la capsule était un important mécanisme de résistance à la phagocytose pour S. suis et qu’elle modulait la réponse inflammatoire, en dissimulant les composants pro-inflammatoires de la paroi bactérienne. Par contre, l’absence d’hémolysine, qui est un facteur cytotoxique potentiel, n’a pas eu d’impact majeur sur l’interaction de S. suis avec la microglie. Ces études sur les cellules microgliales ont permis de confirmer les résultats obtenus précédemment in vivo. La souche WT a induit une régulation à la hausse du TLR2 ainsi que la production de plusieurs médiateurs pro-inflammatoires, dont le TNF-α et le MCP-1. S. suis a induit la translocation du NF-kB. Cet effet était plus rapide dans les cellules stimulées par le mutant déficient en CPS, ce qui suggère que les composants de la paroi cellulaire représentent de puissants inducteurs du NF-kB. De plus, la souche S. suis WT a stimulé l’expression de la phosphotyrosine, de la PKC et de différentes cascades liées à l’enzyme mitogen-activated protein kinase (MAPK). Cependant, les cellules microgliales infectées par le mutant déficient en CPS ont montré des profils de phosphorylation plus forts et plus soutenus que celles infectées par le WT. Finalement, la capsule a aussi modulé l’expression de l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) induite par S. suis et par la production subséquente d’oxyde nitrique par la microglie. Ceci pourrait être lié in vivo à la neurotoxicité et à la vasodilatation. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant l’induction de l’inflammation par S. suis, ce qui devrait permettre, d’établir éventuellement des stratégies plus efficaces de lutte contre la septicémie et la méningite. Enfin, nous pensons que ce modèle expérimental d’infection chez la souris pourra être utilisé dans l’étude de la pathogénèse d’autres bactéries ayant le SNC pour cible.

Angiopoietine-like 2 : un facteur circulant pro-oxydant et pro-inflammatoire qui contribue au développement de l’athérosclérose

L’athérosclérose est une maladie vasculaire inflammatoire chronique qui se développe progressivement au cours de la vie. Les mécanismes impliqués sont complexes et la recherche de nouveaux candidats impliqués dans l'athérogénèse est toujours d'actualité. L’Angiopoietine-like 2 (Angptl2) est une protéine relativement peu connue, aux propriétés pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, qui appartient par homologie à la grande famille des angiopoietines, mais dont le récepteur n'est pas encore clairement identifié. Les situations pathologiques dans lesquelles l’Angptl2 jouerait un rôle crucial sont diverses, mais sa contribution moléculaire dans le développement de l’athérosclérose est inconnue. Par differential display, nous avons initialement identifié l'Angptl2 comme étant surexprimée dans des cellules endothéliales sénescentes, isolées et cultivées à partir d'artères mammaires internes de patients athérosclérotiques ayant subi un pontage coronarien. Cette découverte a été la à base de mon projet, et mes objectifs ont été 1) de déterminer l'implication de l’Angptl2 vasculaire en présence de facteurs de risques tels que le tabagisme et la dyslipidémie, 2) de produire et de purifier une protéine recombinante fonctionnelle de l’Angptl2 afin d'identifier in vitro de nouvelles propriétés cellulaires de l'Angptl2 et 3) d'étudier in vivo le potentiel pro-athérogénique de l'Angptl2 recombinante dans un modèle murin de dyslipidémie sévère. Nous avons montré que l’Angptl2 est sécrétée préférentiellement dans des conditions pro-oxydantes et pro-inflammatoires, avec une augmentation de son expression endothéliale de l’ordre de 6 fois chez des patients coronariens fumeurs atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’Angptl2, en plus de ses fonctions pro-inflammatoires connues, possède des propriétés pro-oxydantes. Nous avons démontré que l’Angptl2 recombinante stimule en effet la production de radicaux libres dans des HUVEC en culture, via l’inhibition partielle de la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2/HO-1 et potentiellement via l'activation de kinase intracellulaire de type p38. A l'aide de souris dyslipidémiques LDLr-/-; hApoB-100+/+, nous avons démontré que le niveau d’Angptl2 plasmatique, vasculaire et dans les plaques athéromateuses, augmente parallèlement avec le développement de l’athérosclérose. De plus, une stimulation avec l’Angptl2 recombinante engendre chez ces souris une réponse inflammatoire évaluée par l’expression endothéliale de cytokines et de molécules d'adhésion et par l’infiltration de leucocytes sur l’endothélium vasculaire. Finalement, l’administration intraveineuse de la protéine recombinante d’Angptl2 pendant quatre semaines à des souris LDLr-/-; hApoB-100+/+ augmente de 10 fois l'expansion de la plaque athérosclérotique et double leur taux de cholestérol circulant. Nous avons aussi montré que chez des patients athérosclérotiques, l'Angptl2 plasmatique est 6 fois plus élevée que chez des sujets sains du même âge. Nos études semblent donc définir l’Angptl2 comme un facteur contribuant directement au développement de l'athérosclérose en favorisant la sénescence, l’inflammation et l’oxydation des cellules endothéliales. Ces propriétés pourraient globalement définir l'Angptl2, non seulement comme un nouveau biomarqueur circulant de l’athérosclérose, mais également comme l'un de ses promoteurs.

Transcriptional analysis of PRRSV-infected porcine dendritic cell response to Streptococcus suis infection reveals up-regulation of inflammatory-related genes expression

The porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is one of the most important swine pathogens and often serves as an entry door for other viral or bacterial pathogens, of which Streptococcus suis is one of the most common. Pre-infection with PRRSV leads to exacerbated disease caused by S. suis infection. Very few studies have assessed the immunological mechanisms underlying this higher susceptibility. Since antigen presenting cells play a major role in the initiation of the immune response, the in vitro transcriptional response of bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) and monocytes in the context of PRRSV and S. suis co-infection was investigated. BMDCs were found to be more permissive than monocytes to PRRSV infection; S. suis phagocytosis by PRRSV-infected BMDCs was found to be impaired, whereas no effect was found on bacterial intracellular survival. Transcription profile analysis, with a major focus on inflammatory genes, following S. suis infection, with and without pre-infection with PRRSV, was then performed. While PRRSV pre-infection had little effect on monocytes response to S. suis infection, a significant expression of several pro-inflammatory molecules was observed in BMDCs pre-infected with PRRSV after a subsequent infection with S. suis. While an additive effect could be observed for CCL4, CCL14, CCL20, and IL-15, a distinct synergistic up-regulatory effect was observed for IL-6, CCL5 and TNF-α after co-infection. This increased pro-inflammatory response by DCs could participate in the exacerbation of the disease observed during PRRSV and S. suis co-infection.

Le récepteur B1 des kinines : cible thérapeutique pour le choc septique dans le diabète.

Les décès attribués à un choc septique à la suite d’une infection sévère augmentent chez les diabétiques et surviennent assez fréquemment dans les unités de soins intensifs. Le diabète sucré et le choc septique augmentent la production d’espèces réactives oxygénées et de cytokines pro-inflammatoires, lesquelles activent le facteur de transcription nucléaire Kappa B conduisant à l’induction du récepteur B1 (RB1) des kinines. Le diabète induit par la streptozotocine (STZ) augmente l’expression du RB1 dans divers tissus périphériques, le cerveau et la moelle épinière. Les lipopolysaccharides bactériens (LPS), souvent utilisés pour induire le choc septique, induisent aussi le RB1. L’objectif de ce travail vise à démontrer la contribution du RB1 des kinines dans l’exacerbation du choc septique pendant le diabète. Des rats Sprague-Dawley (225-250 gr) traités à la STZ (65 mg/kg, i.p.) ou le véhicule ont reçu quatre jours plus tard les LPS (2 mg/kg, i.v.) ou le véhicule en présence ou pas d’un antagoniste du RB1 (SSR240612, 10 mg/kg) administré par gavage. La température corporelle a été mesurée pendant 24h après le traitement. Le SSR240612 a aussi été administré à 9h AM et 9h PM et les rats sacrifiés à 9h AM le jour suivant après un jeûne de 16 h. Les effets de ces traitements ont été mesurés sur les taux plasmatiques d’insuline et de glucose, l’œdème et la perméabilité vasculaire (dans divers tissus avec la technique du Bleu d’Evans) ainsi que sur l’expression du RB1 (PCR en temps réel) dans le cœur et le rein. L’augmentation de la température corporelle après traitement au LPS chez les rats traités ou pas à la STZ a été bloquée par le SSR240612. L’antagoniste a normalisé l’hyperglycémie et amélioré la déficience en insuline chez les rats STZ. Le SSR240612 a inhibé l’œdème et réduit la perméabilité vasculaire dans les tissus des rats diabétiques traités ou pas avec les LPS. La surexpression du RB1 chez les rats traités au STZ et/ou LPS était renversée par le SSR240612. Cet antagoniste a prévenu la mortalité causée par les LPS et LPS plus STZ. Les effets anti-pyrétique, anti-inflammatoire et anti-diabétique du SSR240612 suggèrent que le RB1 puisse représenter une cible thérapeutique valable pour le traitement de la co-morbidité associée au choc septique dans le diabète.

Rôles physiopathologiques du complément dans le syndrome coronarien aigu et implications thérapeutiques

Les efforts investis pour diminuer les risques de développer un infarctus du myocarde sont nombreux. Aujourd’hui les médecins prennent connaissance des divers facteurs de risque connus prédisposant aux syndromes coronariens aigus (SCA) dans le but de prendre en charge les patients «à risque» [1]. Bien que le suivi rigoureux et le contrôle de certains facteurs de risque modifiables aient permis une meilleure gestion des cas de SCA, les cas d’infarctus persistent de manière encore trop fréquente dans le monde. Puisque d’importantes études ont démontré que les SCA pouvaient survenir sans même la présence des facteurs de risque conventionnels [2, 3], les chercheurs se sont penchés sur un autre mécanisme potentiellement responsable de l’avènement des SCA : l’inflammation. L’inflammation joue un rôle prépondérant dans l’initiation, la progression et les complications de l’athérosclérose [4, 5] mais aussi dans les situations post-infarctus [6, 7]. Au cours des dernières années, le contrôle du processus inflammatoire est devenu une cible de choix dans la prévention et le traitement des SCA. Cependant, malgré les efforts investis, aucun de ces traitements ne s’est avéré pleinement efficace dans l’atteinte du but ultime visé par une diminution de l’inflammation : la diminution de la mortalité. Le complément est un système complexe reconnu principalement pour son rôle primordial dans l’immunité [2]. Cependant, lorsqu’il est activé de manière inappropriée ou excessive, il peut être à l’origine de nombreux dommages cellulaires caractéristiques de plusieurs pathologies inflammatoires dont font partie les complications de l’athérosclérose et des événements post-infarctus. Le travail effectué dans le cadre de mon doctorat vise à établir les rôles physiopathologiques du complément dans les interactions de l’axe thrombose-inflammation caractéristiques des SCA dans le but ultime d’identifier des cibles thérapeutiques permettant le développement de nouvelles approches pour la prévention et le traitement de ces pathologies. Les principaux résultats obtenus durant mon cursus suggèrent d’abord que la voie alterne du complément peut représenter une cible thérapeutique de choix dans les maladies coronariennes aiguës puisque l’activation terminale du complément semble y être principalement causée par l’activation du cette voie. De faibles niveaux sériques de MBL (mannan-binding lectin) et une activation terminale négligeable du complément caractérisent plutôt la maladie coronarienne stable. En comparant l’activité relative de chacune des voies du complément chez des cohortes de patients traités ou non par un anticorps spécifique à la protéine C5 du complément (pexelizumab), un second volet démontre quant à lui qu’une inhibition de l’activation du C5 n’a pas d’effet bénéfique majeur sur l’inhibition de la formation du complexe sC5b-9 ou sur les événements cliniques subséquents. Par conséquent, nous avons exploré, à l’aide d’un modèle in vitro, les raisons de l’inefficacité du traitement. Les résultats révèlent que le blocage du C5 avec le pexelizumab inhibe la production de l’anaphylatoxine pro-inflammatoire C5a et du complexe terminal du complément sans toutefois avoir d’effet sur l’apoptose des cellules endothéliales produites induite par le sérum des patients atteints de STEMI. Finalement, une autre section stipule que l’atorvastatine diminue l’activation du complément induite par les plaquettes sanguines chez des patients hypercholestérolémiques, mettant en évidence l’importance du rôle de cette statine dans la réduction des effets délétères de l’activation du système du complément médié par les plaquettes. Ensemble, l’étude du rôle spécifique des différentes voies d’activation du complément dans des contextes pathologiques variés, l’analyse des effets d’une inhibition spécifique de la protéine C5 du complément dans la progression des SCA et la mise en évidence des interactions entre l’activation du complément et les plaquettes activées ont contribué au développement d’une meilleure connaissance des rôles physiopathologiques du complément dans la progression de la maladie coronarienne.

Nanoparticules Chitosane-PEG-FA-ADN pour la thérapie génique non virale et application du gène de l’IL-1Ra dans un modèle expérimental d’arthrite rhumatoïde

La thérapie génique représente l'un des défis de la médecine des prochaines décennies dont la réussite dépend de la capacité d'acheminer l'ADN thérapeutique jusqu'à sa cible. Des structures non virales ont été envisagées, dont le chitosane, polymère cationique qui se combine facilement à l’ADN. Une fois le complexe formé, l’ADN est protégé des nucléases qui le dégradent. Le premier objectif de l'étude est de synthétiser et ensuite évaluer différentes nanoparticules de chitosane et choisir la mieux adaptée pour une efficacité de transfection sélective in vitro dans les cellules carcinomes épidermoïdes (KB). Le deuxième objectif de l'étude est d'examiner in vivo les effets protecteurs du gène de l'IL-1Ra (bloqueur naturel de la cytokine inflammatoire, l’Interleukine-1β) complexé aux nanoparticules de chitosane sélectionnées dans un modèle d'arthrite induite par un adjuvant (AIA) chez le rat. Les nanoparticules varient par le poids moléculaire du chitosane (5, 25 et 50 kDa), et la présence ou l’absence de l’acide folique (FA). Des mesures macroscopiques de l’inflammation seront évaluées ainsi que des mesures de concentrations de l’Interleukine-1β, Prostaglandine E2 et IL-1Ra humaine secrétés dans le sérum. Les nanoparticules Chitosane-ADN en présence de l’acide folique et avec du chitosane de poids moléculaire de 25 kDa, permettent une meilleure transfection in vitro. Les effets protecteurs des nanoparticules contenant le gène thérapeutique étaient évidents suite à la détection de l’IL-1Ra dans le sérum, la baisse d'expressions des facteurs inflammatoires, l’Interleukine-1 et la Prostaglandine-E2 ainsi que la diminution macroscopique de l’inflammation. Le but de cette étude est de développer notre méthode de thérapie génique non virale pour des applications cliniques pour traiter l’arthrite rhumatoïde et d’autres maladies humaines.

Syndrome inflammatoire chez les schizophrènes toxicomanes

La schizophrénie est une maladie mentale grave qui présente une comorbidité fréquente avec la toxicomanie et avec divers troubles immunitaires. Une méta-analyse réalisée récemment dans notre laboratoire a montré une augmentation d’IL-6 (une cytokine pro-inflammatoire), du récepteur soluble d’IL-2 (un marqueur d’activation du système immunitaire), et d’IL-1RA (une cytokine anti-inflammatoire) dans la schizophrénie, suggérant l’existence d’un syndrome inflammatoire dans cette maladie. La toxicomanie aussi est associée au dérèglement du réseau des cytokines inflammatoires, mais les effets dépendent du type de drogues et ils sont parfois diamétralement opposés. On dispose encore de peu d’informations sur le statut immunitaire et inflammatoire des patients qui ont un double diagnostic de schizophrénie et de toxicomanie. Le but de ce travail était d’explorer l’existence d’un état inflammatoire systémique chez les patients schizophrènes et toxicomanes, et l’influence du traitement avec un médicament antipsychotique atypique, la quétiapine. Les objectifs spécifiques étaient : 1) Mesurer les concentrations plasmatiques des cytokines inflammatoires chez les schizophrènes et toxicomanes avant, pendant et après traitement avec la quétiapine ; et 2) Faire des études de corrélations entre les taux de cytokines, les symptômes cliniques, et la consommation de drogues. Les résultats montrent que comparativement aux contrôles normaux, les patients avec un double diagnostic présentent une augmentation d’IL-6, d’IL-1RA, du sIL-2R et d’IL-8 avant traitement à la quétiapine. Les augmentations des concentrations plasmatiques d’IL-1RA sont particulièrement importantes chez les patients avec double diagnostic, si on les compare à celles publiées chez les schizophrènes sans toxicomanie. Le traitement à la quétiapine n’influence pas les concentrations plasmatiques de ces cytokines, sauf sIL-2R qui augmente davantage au cours du traitement. Des corrélations positives de puissance modérée sont retrouvées entre IL-6 et dépression, IL-6 et alcool, IL-1RA et cognition, IL-8 et dépression, IL-8 et alcool, sIL-2R et cannabis. Notre étude révèle que la réponse inflammatoire est activée chez les schizophrènes et toxicomanes. De plus, la toxicomanie semble jouer un rôle facilitant ou potentialisateur dans les augmentations des taux circulants d’IL-1RA. Les études en cours sur différentes populations de schizophrènes avec ou sans toxicomanie, et chez des toxicomanes non schizophrènes permettront de préciser le rôle des différentes drogues d’abus dans le syndrome inflammatoire chez les schizophrènes, ainsi que les implications de ce syndrome sur le plan clinique et thérapeutique.

Lactobacillus helveticus R0052 et Bifidobacterium longum R0175 en combinaison réduisent l’apoptose dans le système limbique après ischémie myocardique transitoire chez le rat

Nous avons démontré la présence d'apoptose dans le système limbique suivant un infarctus du myocarde. Cette mort cellulaire serait partiellement reliée à l'augmentation de cytokines pro-inflammatoires. Des études démontrent que certains probiotiques ont des effets bénéfiques en diminuant le ratio de cytokines pro/anti-inflammatoires. La prise de probiotiques en prévention, avant l’occlusion d’une artère coronarienne, pourrait-elle diminuer l’apoptose dans le système limbique? Méthodes : La combinaison de probiotiques Lactobacillus helveticus R0052 et Bifidobacterium longum R0175 ou son véhicule fut additionné dans l’eau des rats pendant 28 jours consécutifs. Un infarctus du myocarde fut provoqué par l’occlusion de l’artère coronaire gauche. Après 40 minutes d'occlusion, les régions ischémiques ont été reperfusées pour 72 heures. Les animaux furent sacrifiés et la taille de l'infarctus mesurée. L'amygdale et l'hippocampe furent prélevés pour déterminer l'activité de la caspase-3 (pro-apoptotique), le ratio Bax/Bcl2(proapoptotique/ anti-apoptotique) et l'activité d'Akt (survie cellulaire). Résultats : La taille de l’infarctus n'est pas diminuée dans le groupe probiotique (45% de la région à risque)comparé au groupe placebo. Nos marqueurs d’apoptose démontrent une diminution dans les régions du gyrus denté, de l’amygdale latérale et médiane dans le groupe probiotique par rapport au placebo. L’activité de la caspase-3 et le ratio Bax:Bcl2 furent réduits dans le groupe probiotique de 50% et 40% respectivement (p < 0.05) et phosphorylation d’Akt fut augmentée de 35% (p<0.05). Aucune différence fut observée pour les régions Ca1 et Ca3. Conclusion : La combinaison de probiotiques utilisée réduit l’apoptose dans différentes régions du système limbique 72 heures après un IM.

The importance of the Hedgehog signaling pathway at the level of the blood-brain barrier

La barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le système nerveux central (SNC) en contrôlant le passage des substances sanguines et des cellules immunitaires. La BHE est formée de cellules endothéliales liées ensemble par des jonctions serrées et ses fonctions sont maintenues par des astrocytes, celles ci sécrétant un nombre de facteurs essentiels. Une analyse protéomique de radeaux lipidiques de cellules endothéliales de la BHE humaine a identifié la présence de la voie de signalisation Hedgehog (Hh), une voie souvent liées à des processus de développement embryologique ainsi qu’au niveau des tissus adultes. Suite à nos expériences, j’ai déterminé que les astrocytes produisent et secrètent le ligand Sonic Hh (Shh) et que les cellules endothéliales humaines en cultures primaires expriment le récepteur Patched (Ptch)-1, le co-récepteur Smoothened (Smo) et le facteur de transcription Gli-1. De plus, l’activation de la voie Hh augmente l’étanchéité des cellules endothéliales de la BHE in vitro. Le blocage de l’activation de la voie Hh en utilisant l’antagoniste cyclopamine ainsi qu’en utilisant des souris Shh déficientes (-/-) diminue l’expression des protéines de jonctions serrées, claudin-5, occcludin, et ZO-1. La voie de signalisation s’est aussi montrée comme étant immunomodulatoire, puisque l’activation de la voie dans les cellules endothéliales de la BHE diminue l’expression de surface des molécules d’adhésion ICAM-1 et VCAM-1, ainsi que la sécrétion des chimiokines pro-inflammatoires IL-8/CXCL8 et MCP-1/CCL2, créant une diminution de la migration des lymphocytes CD4+ à travers une monocouche de cellules endothéliales de la BHE. Des traitements avec des cytokines pro-inflammatoires TNF-α and IFN-γ in vitro, augmente la production de Shh par les astrocytes ainsi que l’expression de surface de Ptch-1 et de Smo. Dans des lésions actives de la sclérose en plaques (SEP), où la BHE est plus perméable, les astrocytes hypertrophiques augmentent leur expression de Shh. Par contre, les cellules endothéliales de la BHE n’augmentent pas leur expression de Ptch-1 ou Smo, suggérant une dysfonction dans la voie de signalisation Hh. Ces résultats montrent que la voie de signalisation Hh promeut les propriétés de la BHE, et qu’un environnement d’inflammation pourrait potentiellement dérégler la BHE en affectant la voie de signalisation Hh des cellules endothéliales.

Caractérisation de l’apoptose observée dans le système limbique après une ischémie myocardique transitoire chez le rat

Au niveau clinique, il a été observé que de 15 à 30 % des patients qui ont subi un infarctus du myocarde développent une dépression majeure. De plus, la population atteinte de dépression post-infarctus présente un risque de mortalité de trois à quatre fois plus élevé, et ce, en comparaison avec la population non dépressive post-infarctus. Dans un modèle de rat développé pour étudier la dépression post-infarctus, des cellules apoptotiques ont été retrouvées au niveau du système limbique. Il apparaît que les cytokines seraient en partie responsables de cette mort cellulaire qui relie le cœur en ischémie et le système nerveux central. Donc, les objectifs de cette thèse sont : 1) de caractériser spatialement et temporellement la survenue de la mort cellulaire par apoptose dans les structures du système limbique du rat, à la suite d’un infarctus du myocarde ; 2) de déterminer l’effet de l’anti-inflammatoire celecoxib sur cette apoptose observée au niveau de l’amygdale et de déterminer l’implication de l’enzyme COX-2 ; 3) de déterminer l’implication de la cytokine pro-inflammatoire TNF-α dans l’apoptose observée au niveau des structures du système limbique du rat, à la suite d’un infarctus du myocarde. Afin d’atteindre ces objectifs, les rats ont subi une ischémie de 40 minutes, suivi d’une période de reperfusion qui varie d’un protocole à l’autre (15 minutes, 24, 48, 72 heures ou 7 jours). De plus, en fonction du protocole, ces rats ont été traités avec soit du célécoxib (inhibiteur sélectif de la COX-2), soit avec du PEG sTNF-R1 (inhibiteur du TNF-α). À la suite de ces protocoles, les rats ont été sacrifiés, la taille de l’infarctus a été déterminée et les différentes structures cérébrales du système limbique prélevées. Des tests biochimiques propres à chaque protocole ont été réalisés afin de documenter l'apoptose. Il a alors été observé qu’aucun des deux traitements ne présentait d’effet sur la taille de l’infarctus. L’étude de l’apoptose dans le système limbique a révélé que : 1) le processus apoptotique se mettait en place dans l’hippocampe dès les 15 premières minutes de reperfusion suivant l’infarctus du myocarde et que ce processus était spatialement dynamique dans le système limbique jusqu’au septième jour postreperfusion ; 2) il est apparu que la COX-2 était impliquée dans l'apoptose du système limbique ; 3) il a été observé que le TNF-α périphérique était impliqué dans ce processus apoptotique après 72 heures de reperfusion en activant la voie extrinsèque de l'apoptose. Ces résultats ont permis de caractériser la survenue de l’apoptose au niveau du système limbique chez le rat à la suite d’un infarctus du myocarde et de documenter l'implication de la COX-2 et du TNF-α dans ce processus. Bien que ces résultats n’apportent pas de schémas thérapeutiques clairs ou de mécanismes physiopathologiques globaux ces derniers permettent une meilleure compréhension de la relation existante entre le cœur et le système nerveux central dans le cadre de l’infarctus du myocarde. De manière moins spécifique ils précisent la relation entre le système inflammatoire et le système nerveux central.

Le VEGF induit la synthèse du PAF par l’entremise de l’activation du VEGFR-2 : identification des phosphotyrosines impliquées

Notre laboratoire a démontré que la capacité proinflammatoire du vascular endothelial growth factor (VEGF-A165) implique la synthèse endothéliale du facteur d’activation plaquettaire (PAF) via l’activation du récepteur tyrosine kinase homodimérique VEGFR-2/R-2. La synthèse du PAF requiert l’activation de la p38 MAPK et p42/44 MAPK qui activent la phospholipase A2 secrétée de type V (sPLA2-V). Nous avons découvert que la synthèse aigue de prostacycline (PGI2) induite par le VEGF-A165 requiert l’activation des récepteurs hétérodimériques VEGFR-1/R-2. L’activation sélective des récepteurs du VEGF peut donc agir comme balance dans la synthèse de facteurs pro-(PAF) et anti-(PGI2) inflammatoire. Cependant, les tyrosines impliquées dans la transphosphorylation de VEGFR-2/R-2 menant à la synthèse du PAF sont inconnues. Par mutagenèse dirigée, nous avons effectué des transfections transitoires de cellules endothéliales avec des plasmides codant pour le VEGFR-2 dont les tyrosines ciblées ont été remplacées de façon séquentielle par une phénylalanine. Un vecteur vide pcDNA a été utilisé comme contrôle négatif. La stimulation des cellules endothéliales de l’aorte bovine (BAEC) transfectées avec le VEGF-A165 (1nM) pendant 15 minutes augmente la synthèse du PAF de 300%, laquelle était similaire dans les BAEC non transfectées. Dans les BAEC transfectées avec les vecteurs pcDNA codant pour les mutations Y801F, Y1059F, Y1175F et Y1214F, nous avons observé une réduction de 54, 73, 68, et 57% respectivement de la synthèse du PAF induite par le VEGF par rapport au pcDNA témoin. Nos résultats apportent un nouvel aperçu sur le mécanisme par lequel le VEGF induit la synthèse du PAF qui est connu pour sa contribution dans l’activité pro-inflammatoire du VEGF.