Interaction d'Escherichia coli entérohémorragique (EHEC) avec Acanthamoeba castellanii et rôle du régulon Pho chez les EHEC

Les EHEC de sérotype O157:H7 sont des agents zoonotiques d’origine alimentaire ou hydrique. Ce sont des pathogènes émergeants qui causent chez l’humain des épidémies de gastro-entérite aiguë et parfois un syndrome hémolytique-urémique. Les EHEC réussissent leur transmission à l’humain à partir de leur portage commensal chez l’animal en passant par l’étape de survie dans l’environnement. L’endosymbiose microbienne est une des stratégies utilisées par les bactéries pathogènes pour survivre dans les environnements aquatiques. Les amibes sont des protozoaires vivants dans divers écosystèmes et connus pour abriter plusieurs agents pathogènes. Ainsi, les amibes contribueraient à transmettre les EHEC à l'humain. La première partie de mon projet de thèse est centrée sur l'interaction de l’amibe Acanthamoeba castellanii avec les EHEC. Les résultats montrent que la présence de cette amibe prolonge la persistance des EHEC, et ces dernières survivent à leur phagocytose par les amibes. Ces résultats démontrent le potentiel réel des amibes à héberger les EHEC et à contribuer à leur transmission. Cependant, l’absence de Shiga toxines améliore leur taux de survie intra-amibe. Par ailleurs, les Shiga toxines sont partiellement responsables de l’intoxication des amibes par les EHEC. Cette implication des Shiga toxines dans le taux de survie intracellulaire et dans la mortalité des amibes démontre l’intérêt d’utiliser les amibes comme modèle d'interaction hôte/pathogène pour étudier la pathogénicité des EHEC. Durant leur cycle de transmission, les EHEC rencontrent des carences en phosphate inorganique (Pi) dans l’environnement. En utilisant conjointement le système à deux composantes (TCS) PhoB-R et le système Pst (transport spécifique de Pi), les EHEC détectent et répondent à cette variation en Pi en activant le régulon Pho. La relation entre la virulence des EHEC, le PhoB-R-Pst et/ou le Pi environnemental demeure inconnue. La seconde partie de mon projet explore le rôle du régulon Pho (répondant à un stress nutritif de limitation en Pi) dans la virulence des EHEC. L’analyse transcriptomique montre que les EHEC répondent à la carence de Pi par une réaction complexe impliquant non seulement un remodelage du métabolisme général, qui est critique pour sa survie, mais aussi en coordonnant sa réponse de virulence. Dans ces conditions le régulateur PhoB contrôle directement l’expression des gènes du LEE et de l’opéron stx2AB. Ceci est confirmé par l’augmentation de la sécrétion de l’effecteur EspB et de la production et sécrétion de Stx2 en carence en Pi. Par ailleurs, l’activation du régulon Pho augmente la formation de biofilm et réduit la motilité chez les EHEC. Ceci corrèle avec l’induction des gènes régulant la production de curli et la répression de la voie de production d’indole et de biosynthèse du flagelle et du PGA (Polymère β-1,6-N-acétyle-D-glucosamine).

The plant ovule omics : an integrative approach for pollen−pistil interactions and pollen tube guidance studies in solanaceous species

Chez les plantes à fleurs, l’ovaire est l’organe reproducteur femelle et il interagit de façon importante avec les gamètes mâles durant la croissance, le guidage, la réception et la rupture du tube pollinique ainsi que la fusion des gamètes. Le processus débute lorsque de nombreux gènes de l’ovule sont activés à longue distance lors de la réception du pollen sur le stigmate. Afin d’explorer les signaux provenant de l’ovule ayant un impact important sur les interactions pollen–pistil, particulièrement les molécules sécrétées impliquées dans la signalisation espècespécifique, l’expression génique des ovules sous forme d’ARNm ainsi et la sécrétion protéique ont été étudiées chez Solanum chacoense, une espèce diploïde de pomme de terre sauvage. S. chacoense a subi beaucoup d’hybridation interspécifique avec d’autres espèces sympathiques de solanacées, facilitant ainsi grandement l’étude des interactions pollen–ovule de façon espècespécifique ainsi que leur évolution. Dans ce projet, des ovules provenant de trois conditions différentes ont été comparés: des ovules matures de type sauvage, des ovules légèrement immatures, récoltés deux jours avant l’anthèse et des ovules provenant du mutant frk1 pour lesquels le sac embryonnaire est absent. Un séquençage d’ARN à haut débit a d’abord été effectué sur les ovules de type sauvage de S. chacoense afin de générer un assemblage de référence comprenant 33852 séquences codantes. D’autres séquençages ont été effectués sur les trois conditions d’ovules et sur les feuilles afin de faire une analyse d’expression différentielle des gènes. En comparaison avec les ovules de type sauvage, 818 gènes sont réprimés dans les ovules du mutant frk1. Un sous-groupe de 284 gènes, étaient également sous-exprimés dans les ovules légèrement immatures, suggérant un rôle spécifique dans les stades tardifs de la maturation du sac embryonnaire (stade de développent FG6 à FG7) ainsi que du guidage du tube pollinique, puisque ni les ovules du mutant frk1 ni ceux légèrement immatures ne sont capables d’attirer les tubes polliniques lors d’essais de croissance semi in vivo. De plus, 21% de ces gènes sont des peptides riches en cystéines (CRPs). En utilisant un transcriptome assemblé de novo provenant de deux proches parents de S. chacoense, S. gandarillasii et S. tarijense, une analyse d’orthologie a été effectuée sur ces CRPs, révélant une grande variabilité et une évolution rapide chez les solanacées. De nouveaux motifs de cystéine uniques à cette famille ont également été découverts. En comparant avec des études similaires chez Arabidopsis, le sac embryonnaire de S. chacoense montre un transcriptome fortement divergent, particulièrement en en ce qui a trait à la catégorisation fonctionnelle des gènes et de la similarité entre les gènes orthologues. De plus,même si la glycosylation n’est pas requise lors du guidage mycropylaire du tube pollinique chez Arabidopsis, Torenia ou le maïs, des extraits d’ovules glycosylés de S. chacoense sont capables d’augmenter la capacité de guidage de 18%. Cette étude est donc la première à montrer une corrélation entre glycosylation et le guidage du tube pollinique par l’ovule. En complément à l’approche transcriptomique, une approche protéomique portant sur les protéine sécrétées par l’ovule (le secrétome) a été utilisée afin d’identifier des protéines impliquées dans l’interaction entre ovule et tube pollinique. Des exsudats d’ovules matures (capables d’attirer le tube pollinique) et d’ovules immatures (incapables d’attirer le tube pollinique) ont été récoltés en utilisant une nouvelle méthode d’extraction par gravité permettant de réduire efficacement les contaminants cytosoliques à moins de 1% de l’échantillon. Un total de 305 protéines sécrétées par les ovules (OSPs) ont été identifiées par spectrométrie de masse, parmi lesquelles 58% étaient spécifiques aux ovules lorsque comparées avec des données de protéines sécrétées par des tissus végétatifs. De plus, la sécrétion de 128 OSPs est augmentée dans les ovules matures par rapport aux ovules immatures. Ces 128 protéines sont donc considérées en tant que candidates potentiellement impliquées dans la maturation tardive de l’ovule et dans le guidage du tube pollinique. Cette étude a également montré que la maturation du sac embryonnaire du stade FG6 au stade FG7 influence le niveau de sécrétion de 44% du sécrétome total de l’ovule. De façon surprenante, la grande majorité (83%) de ces protéines n’est pas régulée au niveau de l’ARN, soulignant ainsi l’importance de cette approche dans l’étude du guidage du tube pollinique comme complément essentiel aux études transcriptomiques. Parmi tous les signaux sécrétés par l’ovule et reliés au guidage, obtenus à partir des approches transcriptomiques et protéomiques décrites ci-haut, nous avons spécifiquement évalué l’implication des CRPs dans le guidage du tube pollinique par l’ovule chez S. chacoense, vu l’implication de ce type de protéine dans les interactions pollen-pistil et le guidage du tube pollinique chez d’autres espèces. Au total, 28 CRPs étaient présentes dans les ovules capables d’attirer le tube pollinique tout en étant absentes dans les ovules incapables de l’attirer, et ce, soit au niveau de l’ARNm et/ou au niveau du sécrétome. De celles-ci, 17 CRPs ont été exprimées dans un système bactérien et purifiées en quantité suffisante pour tester le guidage. Alors que des exsudats d’ovules ont été utilisés avec succès pour attirer par chimiotactisme le tube pollinique, les candidats exprimés dans les bactéries n’ont quant à eux pas été capables d’attirer les tubes polliniques. Comme l’utilisation de systèmes d’expression hétérologue eucaryote peut permettre un meilleur repliement et une plus grande activité des protéines, les candidats restants seront de nouveau exprimés, cette fois dans un système de levure ainsi que dans un système végétal pour produire les peptides sécrétés. Ceux-ci seront ensuite utilisés lors d’essais fonctionnels pour évaluer leur capacité à guider les tubes polliniques et ainsi isoler les attractants chimiques responsable du guidage du tube pollinique chez les solanacées comme S. chacoense.