Tachykinins Processing is Significantly Impaired in PC1 and PC2 Mutant Mouse Spinal Cord S9 Fractions

Substance P (SP) play a central role in nociceptive transmission and it is an agonist of the Neurokinin-1 receptor located in the lamina I of the spinal cord. SP is a major proteolytic product of the protachykinin-1 primarily synthesized in neurons. Proprotein convertases (PCs) are extensively expressed in the central nervous system (CNS) and specifically cleave at C-terminal of either a pair of basic amino acids, or a single basic residue. The proteolysis control of endogenous protachykinins has a profound impact on pain perception and the role of PCs remain unclear. The objective of this study was to decipher the role of PC1 and PC2 in the proteolysis surrogate protachykinins (i.e. Tachykinin 20-68 and Tachykinin 58-78) using cellular fractions of spinal cords from wild type (WT), PC1-/+ and PC2-/+ animals and mass spectrometry. Full-length Tachykinin 20-68 and Tachykinin 58-78 was incubated for 30 minutes in WT, PC1-/+ and PC2-/+ mouse spinal cord S9 fractions and specific C-terminal peptide fragments were identified and quantified by mass spectrometry. The results clearly demonstrate that both PC1 and PC2 mediate the formation of SP and Tachykinin 58-71, an important SP precursor, with over 50% reduction of the rate of formation in mutant PC 1 and PC2 mouse S9 spinal cord fractions. The results obtained revealed that PC1 and PC2 are involved in the C-terminal processing of protachykinin peptides and suggest a major role in the maturation of the protachykinin-1 protein.

Characterization of polycystin-1 in ADPKD pathogenetic mechanism : biogenesis and functional implications by genetic approaches in mouse

La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) est une des maladies génétiques les plus communes. ADPKD se manifeste le plus souvent au stade adulte par la présence de kystes rénaux, et bien souvent de kystes hépatiques, avec une progression très variable. ADPKD mène à une insuffisance rénale: les seuls recours sont la dialyse puis la transplantation rénale. Les mutations dispersées sur les gènes PKD1 (majoritairement; la protéine polycystine-1, PC1) et PKD2 (la protéine polycystine-2, PC2) sont responsables de l’ADPKD. Le mécanisme pathogénétique de perte de fonction (LOF) et donc d’un effet récessif cellulaire est évoqué comme causatif de l’ADPKD. LOF est en effet supporté par les modèles murins d’inactivation de gènes PKD1/PKD2, qui développent de kystes, quoique in utéro et avec une rapidité impressionnante dans les reins mais pas dans le foie. Malgré de nombreuses études in vitro, le rôle de PC1/PC2 membranaire/ciliaire reste plutôt hypothétique et contexte-dépendant. Ces études ont associé PC1/PC2 à une panoplie de voies de signalisation et ont souligné une complexité structurelle et fonctionnelle exceptionnelle, dont l’implication a été testée notamment chez les modèles de LOF. Toutefois, les observations patho-cellulaires chez l’humain dont une expression soutenue, voire augmentée, de PKD1/PC1 et l’absence de phénotypes extrarénaux particuliers remet en question l’exclusivité du mécanisme de LOF. Il était donc primordial 1) d’éclaircir le mécanisme pathogénétique, 2) de générer des outils in vivo authentiques d’ADPKD en terme d’initiation et de progression de la maladie et 3) de mieux connaitre les fonctions des PC1/PC2 indispensables pour une translation clinique adéquate. Cette thèse aborde tous ces points. Tout d’abord, nous avons démontré qu’une augmentation de PKD1 endogène sauvage, tout comme chez l’humain, est pathogénétique en générant et caractérisant en détail un modèle murin transgénique de Pkd1 (Pkd1TAG). Ce modèle reproduit non seulement les caractéristiques humaines rénales, associées aux défauts du cil primaire, mais aussi extrarénales comme les kystes hépatiques. La sévérité du phénotype corrèle avec le niveau d’expression de Pkd1 ce qui supporte fortement un modèle de dosage. Dans un deuxième temps, nous avons démontré par les études de complémentations génétiques que ces deux organes reposent sur une balance du clivage GPS de Pc1, une modification post-traductionelle typique des aGPCR, et dont l’activité et l’abondance semblent strictement contrôlées. De plus, nous avons caractérisé extensivement la biogénèse de Pc1 et de ses dérivés in vivo générés suite au clivage GPS. Nous avons identifié une toute nouvelle forme et prédominante à la membrane, la forme Pc1deN, en plus de confirmer deux fragments N- et C-terminal de Pc1 (NTF et CTF, respectivement) qui eux s’associent de manière non-covalente. Nous avons démontré de façon importante que le trafic de Pc1deN i.e., une forme NTF détachée du CTF, est toutefois dépendant de l’intégrité du fragment CTF in vivo. Par la suite, nous avons généré un premier modèle humanisant une mutation PKD1 non-sens tronquée au niveau du domaine NTF(E3043X) en la reproduisant chez une souris transgénique (Pkd1extra). Structurellement, cette mutation, qui mimique la forme Pc1deN, s’est également avérée causative de PKD. Le modèle Pkd1extra a permis entre autre de postuler l’existence d’une cross-interaction entre différentes formes de Pc1. De plus, nos deux modèles murins sont tous les deux associés à des niveaux altérés de c-Myc et Pc2, et soutiennent une implication réelle de ces derniers dans l’ADPKD tou comme une interaction fonctionnelle entre les polycystines. Finalement, nous avons démontré un chevauchement significatif entre l’ADPKD et le dommage rénal aigüe (ischémie/AKI) dont une expression augmentée de Pc1 et Pc2 mais aussi une stimulation de plusieurs facteurs cystogéniques tel que la tubérine, la β-caténine et l’oncogène c-Myc. Nos études ont donc apporté des évidences cruciales sur la contribution du gène dosage dans l’ADPKD. Nous avons développé deux modèles murins qui serviront d’outil pour l’analyse de la pathologie humaine ainsi que pour la validation préclinique ADPKD. L’identification d’une nouvelle forme de Pc1 ajoute un niveau de complexité supplémentaire expliquant en partie une capacité de régulation de plusieurs voies de signalisation par Pc1. Nos résultats nous amènent à proposer de nouvelles approches thérapeutiques: d’une part, le ciblage de CTF i.e., de style chaperonne, et d’autre part le ciblage de modulateurs intracellulaires (c-Myc, Pc2, Hif1α). Ensemble, nos travaux sont d’une importance primordiale du point de vue informatif et pratique pour un avancement vers une thérapie contre l’ADPKD. Le partage de voies communes entre AKI et ADPKD ouvre la voie aux approches thérapeutiques parallèles pour un traitement assurément beaucoup plus rapide.

The role of protein convertases in bigdynorphin and dynorphin A metabolic pathway

Les dynorphines sont des neuropeptides importants avec un rôle central dans la nociception et l’atténuation de la douleur. De nombreux mécanismes régulent les concentrations de dynorphine endogènes, y compris la protéolyse. Les Proprotéines convertases (PC) sont largement exprimées dans le système nerveux central et clivent spécifiquement le C-terminale de couple acides aminés basiques, ou un résidu basique unique. Le contrôle protéolytique des concentrations endogènes de Big Dynorphine (BDyn) et dynorphine A (Dyn A) a un effet important sur la perception de la douleur et le rôle de PC reste à être déterminée. L'objectif de cette étude était de décrypter le rôle de PC1 et PC2 dans le contrôle protéolytique de BDyn et Dyn A avec l'aide de fractions cellulaires de la moelle épinière de type sauvage (WT), PC1 -/+ et PC2 -/+ de souris et par la spectrométrie de masse. Nos résultats démontrent clairement que PC1 et PC2 sont impliquées dans la protéolyse de BDyn et Dyn A avec un rôle plus significatif pour PC1. Le traitement en C-terminal de BDyn génère des fragments peptidiques spécifiques incluant dynorphine 1-19, dynorphine 1-13, dynorphine 1-11 et dynorphine 1-7 et Dyn A génère les fragments dynorphine 1-13, dynorphine 1-11 et dynorphine 1-7. Ils sont tous des fragments de peptides associés à PC1 ou PC2. En plus, la protéolyse de BDyn conduit à la formation de Dyn A et Leu-Enk, deux peptides opioïdes importants. La vitesse de formation des deux est réduite de manière significative dans les fractions cellulaires de la moelle épinière de souris mutantes. En conséquence, l'inhibition même partielle de PC1 ou PC2 peut altérer le système opioïde endogène.

Characterization of Endoproteolytic Processing of Dynorphins by Proprotein Convertases using Mouse Spinal Cord S9 Fractions and Mass Spectrometry

Dynorphins are important neuropeptides with a central role in nociception and pain alleviation. Many mechanisms regulate endogenous dynorphin concentrations, including proteolysis. Proprotein convertases (PCs) are widely expressed in the central nervous system and specifically cleave at C-terminal of either a pair of basic amino acids, or a single basic residue. The proteolysis control of endogenous Big Dynorphin (BDyn) and Dynorphin A (Dyn A) levels has a profound impact on pain perception and the role of PCs remain unclear. The objective of this study was to decipher the role of PC1 and PC2 in the proteolysis control of BDyn and Dyn A levels using cellular fractions of spinal cords from wild type (WT), PC1-/+ and PC2-/+ animals and mass spectrometry. Our results clearly demonstrate that both PC1 and PC2 are involved in the proteolysis regulation of BDyn and Dyn A with a more important role for PC1. C-terminal processing of BDyn generates specific peptide fragments Dynorphin 1-19, Dynorphin 1-13, Dynorphin 1-11 and Dynorphin 1-7 and C-terminal processing of Dyn A generates Dynorphin 1-13, Dynorphin 1-11 and Dynorphin 1-7, all these peptide fragments are associated with PC1 or PC2 processing. Moreover, proteolysis of BDyn leads to the formation of Dyn A and Leu-Enk, two important opioid peptides. The rate of formation of both is significantly reduced in cellular fractions of spinal cord mutant mice. As a consequence, even partial inhibition of PC1 or PC2 may impair the endogenous opioid system.

Inhibition cellulaire de la proprotéine convertase 1 et activité des proprotéines convertases dans le réticulum endoplasmique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.