Développement d'un biosenseur BRET permettant le criblage de drogues qui causent l'activation de canaux Kir3 via les récepteurs couplés aux protéines G

Les récepteurs couplés aux protéines G forment des complexes multimériques comprenant protéines G et effecteurs. Nous cherchons à caractériser de tels complexes comprenant les récepteurs opioïdes delta (DOR) et les canaux Kir3, qui nous sont d’intérêt vu leur implication dans l’analgésie des opioïdes. Des expériences d’immunopurification, de BRET et de liaison GTPgS ont été réalisées à l’intérieur de cellules HEK293 transfectées. Les canaux Kir3 ont été co-immunopurifiés avec les DOR, suggérant une interaction spontanée entre récepteur et effecteur. Des essais BRET ont corroboré que l’interaction était présente dans des cellules vivantes et nous ont permis d’identifier une interaction spontanée et spécifique entre DOR/Gg et Gg/Kir3, indiquant leur coexistence en un même complexe. Puisque l’activation du récepteur implique la présence de changements conformationnels à l’intérieur de celui-ci, nous étions intéressés à vérifier si l’information conformationnelle circule à partir du récepteur lié au ligand jusqu’à l’effecteur en aval. Ainsi, nous avons déterminé l’effet de différents ligands sur le signal BRET généré par les paires suivantes : DOR/Gbg, DOR/Kir3 et Kir3/Gbg. Nous avons constaté une modulation de l’interaction DOR/Gbg et Gbg/Kir3 suivant l’ordre d’efficacité des ligands à stimuler la protéine G, ce que nous n’avons pas observé entre DOR et Kir3. Donc, nous concluons que l’information conformationnelle circule du récepteur au canal Kir3 via la protéine Gbg. Ces résultats nous ont permis de développer un biosenseur BRET (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc) qui pourrait être utilisé dans le criblage à haut débit afin de détecter de nouvelles molécules ayant une grande efficacité à activer les canaux Kir3.

The rising prevalence of prescription opioid injection and its association with hepatitis C incidence among street-drug users

Ce manuscrit est une pré-publication d'un article paru dans Addiction 2012; 107(7): 1318-1327 url: http://www.addictionjournal.org/

Étude du trafic du récepteur delta-opiacé suite à sa stimulation par différents agonistes

Les opiacés figurent parmi les analgésiques les plus puissants pour le traitement des douleurs sévères. Les agonistes du DOR (récepteur delta opiacé) induisent moins d'effets secondaires que ceux du mu, ce qui les rend une cible d'intérêt pour le traitement des douleurs chroniques. Cependant, ils induisent la tolérance à l'analgésie. Des hypothèses récentes proposent que le potentiel des drogues à induire la tolérance soit la conséquence de la stabilisation de différentes conformations du récepteur induites par la liaison avec différents ligands, chacune ayant différentes propriétés de trafic. Dans ce contexte, nous avons déterminé si différents ligands du DOR différaient dans leur capacité à induire la signalisation et le trafic du récepteur. Nos résultats indiquent que DPDPE et SNC-80 sont les drogues les plus efficaces à inhiber la production d’AMPc, suivis par UFP-512, morphine et TIPP. DPDPE et SNC-80 induisent à eux seuls l’internalisation du DOR dans les cellules HEK-293 de façon dépendante de la β-arrestine mais pas de la GRK2 ni PKC. Ces deux drogues induisent également l’internalisation du DOR dans les neurones corticaux et c’est seulement le DPDPE qui permet au DOR de regagner la membrane des cellules HEK-293 et des neurones après récupération. Cette capacité de recyclage était suggérée comme un mécanisme protégeant contre la survenue de la tolérance. Ces observations indiquent que le DOR peut subir différentes régulations en fonction du ligand lui étant associé. Cette propriété de sélectivité fonctionnelle des ligands pourrait être utile pour le développement de nouveaux opiacés ayant une activité analgésique plus durable.

Rôle et implication du système cannabinoïde dans la modulation périphérique de la douleur inflammatoire et neuropathique

Les dérivés de l’opium (opioïdes) et du cannabis (cannabinoïdes) présentent de nombreuses propriétés intéressantes. Suite à l’identification de leurs récepteurs respectifs, diverses stratégies pharmacologiques ont tenté d’exploiter leurs propriétés analgésiques. Le clonage des récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 a favorisé la découverte de composés endogènes pour ces récepteurs, les endocannabinoïdes, dont les deux plus étudiés sont l’anandamide et le 2-arachidonyl glycérol (2-AG). Cette découverte a également mené à l’identification d’enzymes qui catalysent l’inactivation de ces cannabinoïdes endogènes : une amidohydrolase des acides gras ou FAAH ainsi qu’une monoacylglycérol lipase ou MAGL. Le système cannabinoïde endogène est régulé à la hausse dans une variété de processus pathologiques, tels que les douleurs inflammatoire et neuropathique. Cette augmentation est habituellement interprétée comme une réaction physiologique visant à rétablir l’homéostasie et elle a notamment été observée en périphérie. Les endocannabinoïdes semblent donc agir de façon spécifique à des moments clés dans certains tissus ciblés afin de minimiser les conséquences reliées au déclenchement de ces douleurs. Cette observation est très intéressante d’un point de vue thérapeutique puisqu’elle suggère la possibilité de cibler les enzymes de dégradation des endocannabinoïdes dans le but d’augmenter leurs concentrations locales et d’ainsi prolonger leur action neuromodulatrice. En périphérie, l’activation des récepteurs cannabinoïdes induit des effets antinociceptifs bénéfiques tout en minimisant les effets indésirables souvent associés à leur activation centrale. Nous avons orienté nos travaux vers la modulation périphérique de ce système endogène à l’aide d’inhibiteurs des enzymes de dégradation des endocannabinoïdes afin d’évaluer leur potentiel thérapeutique et d’élucider les mécanismes d’action qui sous-tendent leurs effets dans des modèles animaux de douleurs inflammatoire et neuropathique. Nous avons démontré que cette approche permet de soulager les symptômes associés à ces deux types de douleurs, et ce via les récepteurs CB1 et CB2. Les systèmes cannabinoïde et opioïde présentent des similitudes, dont des localisations similaires le long des voies de la douleur, des mécanismes d’action relayés par des récepteurs couplés aux protéines G et des propriétés pharmacologiques communes telles que l’analgésie. Le système opioïde est impliqué dans les effets antinociceptifs induits par les cannabinoïdes. À l’inverse, le rôle joué par le système cannabinoïde dans ceux induits par la morphine demeure incertain. Nous avons démontré que les effets antinociceptifs périphériques et spinaux produits par la morphine sont diminués chez les souris génétiquement modifiées chez lesquelles l’expression des récepteurs CB1 ou CB2 a été éliminée, laissant supposer un rôle pour ces récepteurs dans les effets de la morphine. Nous avons de plus démontré que la diminution de l'analgésie produite par la morphine dans ces souris n'est pas causée par un dysfonctionnement des récepteurs opioïdes mu (MOP) ni par une régulation à la baisse de ces récepteurs. Nos résultats confirment l'existence d'interactions fonctionnelles entre les systèmes cannabinoïde et opioïde au niveau périphérique et spinal. Ces observations sont prometteuses d’un point de vue thérapeutique puisqu’une modulation périphérique ciblée des niveaux d’endocannabinoïdes et d’opioïdes endogènes permettrait de produire des effets analgésiques bénéfiques potentiellement synergiques tout en minimisant les effets indésirables associés à l’activation centrale de ces systèmes.

Liquid Chromatography-Electrospray Linear Ion Trap Mass Spectrometry Analysis of Targeted Neuropeptides in Tac1-/- Mouse Spinal Cords Reveal Significant Lower Concentration of Opioid Peptides.

Tachykinin and opioid peptides play a central role in pain transmission, modulation and inhibition. The treatment of pain is very important in medicine and many studies using NK1 receptor antagonists failed to show significant analgesic effects in humans. Recent investigations suggest that both pronociceptive tachykinins and the analgesic opioid systems are important for normal pain sensation. The analysis of opioid peptides in Tac1-/- spinal cord tissues offers a great opportunity to verify the influence of the tachykinin system on specific opioid peptides. The objectives of this study were to develop a HPLC–MS/MRM assay to quantify targeted peptides in spinal cord tissues. Secondly, we wanted to verify if the Tac1-/- mouse endogenous opioid system is hampered and therefore affect significantly the pain modulatory pathways. Targeted neuropeptides were analyzed by high performance liquid chromatography linear ion trap mass spectrometry. Our results reveal that EM-2, Leu-Enk and Dyn A were down-regulated in Tac1-/- spinal cord tissues. Interestingly, Dyn A was almost 3 fold down-regulated (p < 0.0001). No significant concentration differences were observed in mouse Tac1-/- spinal cords for Met-Enk and CGRP. The analysis of Tac1-/- mouse spinal cords revealed noteworthy decreases of EM-2, Leu-Enk and Dyn A concentrations which strongly suggest a significant impact on the endogenous pain-relieving mechanisms. These observations may have insightful impact on future analgesic drug developments and therapeutic strategies.

Régulation du complexe constitutif formé par le récepteur opioïde delta et le canal potassique de la famille Kir3

Les opioïdes sont les analgésiques les plus efficaces dans le traitement des douleurs sévères. Ils produisent leurs effets en ciblant spécifiquement les récepteurs opioïdes localisés tout le long de la voie de perception de la douleur où ils modulent la transmission de l'information douloureuse. La plupart des études dans ce domaine essaient de caractériser les récepteurs opioïdes à l'état isolé de tout partenaire de signalisation. Cette thèse, par contre, montre que le récepteur opioïde delta (DOR) peut former un complexe avec sa protéine G et l'un de ses effecteurs impliqués dans la production de l'effet analgésique, le canal potassique à rectification entrante activée par les protéines G (Kir3 ou GIRK). Après avoir établi la présence de ce complexe constitutif, on a ensuite caractérisé sa stabilité, modulation et régulation suite à une stimulation avec des agonistes opioïdes. En premier lieu, on a caractérisé la transmission de l'information du récepteur DOR, suite à son activation par un agoniste, vers le canal Kir3. On a remarqué que cette transmission ne suit pas le modèle de collision, généralement accepté, mais nécessite plutôt un simple changement dans la conformation du complexe préformé. Ensuite, on a déterminé que même suite à l'activation prolongée du récepteur DOR par un agoniste complet, le complexe DOR/Kir3 maintenait son intégrité et a été reconnu par la βarrestine (βarr) comme une seule unité signalétique provoquant ainsi l'internalisation de DOR et Kir3 par un mécanisme clathrine et dynamine-dépendant. Ainsi, prises ensemble, ces données montrent que l'activation du récepteur DOR déclenche non seulement l'activation de l'effecteur Kir3 mais également un mécanisme de régulation qui élimine cet effecteur de la membrane plasmique.

Étude du rôle de la tyrosine kinase Src dans la régulation de la signalisation des récepteurs opioïdes delta (∆OR)

Les opioïdes sont les analgésiques les plus efficaces mais leur utilisation est limitée par la tolérance, un processus lié en partie à la désensibilisation des récepteurs. Le rôle de la présente étude était de mieux caractériser le processus de désensibilisation des récepteurs et plus particulièrement, d’étudier le rôle de la tyrosine kinase Src sur la régulation de la signalisation des récepteurs delta opioïdes. Nos résultats démontrent que l’inhibition pharmacologique avec PP2 (à faible concentration : 20- 40µM) ou encore l’inhibition moléculaire de la kinase avec de faibles concentrations d’ADN d’un mutant dominant inactif de Src (0,2µg/ml) potentialise l’amplitude et la durée de l’activation de la cascade ERK lorsqu’un agoniste, DPDPE (1µM; 5 min), se lie aux récepteurs. Nous avons également démontré que de fortes concentrations d’inhibiteurs de Src (80 et 100µM de PP2 ou 1µg/ml d’ADN du mutant dominant négatif) bloquent la cascade des MAPK suivant la stimulation de DOR par l’agoniste DPDPE. Ces observations indiquent que Src a un effet biphasique sur l’activité de ERK : l’inhibition complète de Src inhibe l’activité de la cascade MAPK alors qu’une inhibition modérée potentialise cette même cascade. Nous pensons aussi que de fortes concentrations des bloqueurs de Src interfèrent avec l’activation de ERK alors que de faibles concentrations interfèrent avec la désensibilisation des récepteurs. Cette possibilité a été testée à l’aide d’essais d’accumulation d’AMPc qui visaient à évaluer l’effet des bloqueurs de Src (PP2, 20 µM; 1h) sur la désensibilisation induite par un agoniste. L'activation de DOR par DPDPE inhibe la production d’AMPc, préalablement stimulée par du forskolin, de façon dose-dépendante. Le maximum d'inhibition observé est de 61%, mais lors d’un prétraitement au DPDPE (1 µM, 30 min) l’inhibition maximale est réduite à 72% de l’inhibition initiale observée. Cependant, un prétraitement des cellules au PP2 (20µM pendant 1 heure) avant d’effectuer la désensibilisation protège contre cette désensibilisation. L’effet protecteur des bloqueurs de Src n’entraîne pas de changement au niveau de l’internalisation des DOR mais l’altération de leur internalisation via un mutant tronqué du DOR ou via un milieu sucré hypertonique (0.4M de saccharose) réduit cette protection. Ces données suggèrent alors que l’internalisation optimale du récepteur est nécessaire pour que l’effet protecteur prenne place. Nous concluons donc que Src contribue à la désensibilisation de DOR après que l’internalisation du DOR soit survenue.

Mécanisme de référence en orthopédie pour mono-traumatisme dans un centre de traumatologie niveau 1

Les patients atteints de mono-traumatisme à un membre doivent consulter un médecin de première ligne qui assurera la prise en charge initiale et référera au besoin le patient vers un orthopédiste. L‟objectif principal de cette étude est de décrire ce mécanisme de référence envers un Service d‟orthopédie affilié à un Centre de traumatologie Niveau 1. La collecte de données concernant l‟accès aux soins spécialisés et la qualité des soins primaires a été faite lors de la visite en orthopédie. Nous avons étudié 166 patients consécutifs référés en orthopédie sur une période de 4 mois. Avant leur référence en orthopédie, 23 % des patients ont dû consulter 2 médecins de première ligne ou plus pour leur blessure. Le temps entre la consultation en première ligne et la visite en orthopédie (68 heures) dépasse le temps compris entre le traumatisme et l‟accès au généraliste (21 heures). Parmi les cas jugés urgents, 36 % n‟ont pas été vus dans les temps recommandés. La qualité des soins de première ligne fut sous-optimale chez 49 % des patients concernant l‟analgésie, l‟immobilisation et/ou l‟aide à la marche. Les facteurs associés à une diminution d‟accès en orthopédie et/ou une qualité de soins inférieure sont : tabagisme, jeune âge, habiter loin de l‟hôpital, consulter initialement une clinique privée, avoir une blessure au membre inférieur ou des tissus mous et une faible sévérité de la blessure selon le patient. Ces résultats démontrent qu‟il faut mieux cibler l‟enseignement relié aux mono-traumatismes envers les médecins de première ligne afin d‟améliorer le système de référence.

Les mécanismes endogènes de modulation de la douleur et leur dysfonction dans le syndrome de l'intestin irritable

La douleur est une expérience subjective multidimensionnelle accompagnée de réponses physiologiques. Ces dernières sont régulées par des processus cérébraux qui jouent un rôle important dans la modulation spinale et cérébrale de la douleur. Cependant, les mécanismes de cette régulation sont encore mal définis et il est essentiel de bien les comprendre pour mieux traiter la douleur. Les quatre études de cette thèse avaient donc comme objectif de préciser les mécanismes endogènes de modulation de la douleur par la contreirritation (inhibition de la douleur par une autre douleur) et d’investiguer la dysfonction de ces mécanismes chez des femmes souffrant du syndrome de l’intestin irritable (Sii). Dans un premier temps, un modèle expérimental a été développé pour mesurer l’activité cérébrale en imagerie par résonance magnétique fonctionnelle concurremment à l’enregistrement du réflexe nociceptif de flexion (RIII : index de nociception spinale) et des réponses de conductance électrodermale (SCR : index d’activation sympathique) évoqués par des stimulations électriques douloureuses. La première étude indique que les différences individuelles d’activité cérébrale évoquée par les stimulations électriques dans les cortex orbitofrontal (OFC) et cingulaire sont associées aux différences individuelles de sensibilité à la douleur, de réactivité motrice (RIII) et de réactivité autonomique (SCR) chez des sujets sains. La deuxième étude montre que l’analgésie par contreirritation produite chez des sujets sains est accompagnée de l’inhibition de l’amygdale par OFC et d’une modulation du réflexe RIII par la substance grise périaqueducale (PAG) et le cortex somesthésique primaire (SI). Dans les troisième et quatrième études, il est montré que la contreirritation ne produit pas d’inhibition significative de la douleur et du réflexe RIII chez les patientes Sii en comparaison aux contrôles. De plus, les résultats indiquent que la sévérité des symptômes psychologiques est associée au déficit de modulation de la douleur et à une hypersensibilité diffuse chez les patientes Sii. Dans l’ensemble, cette thèse précise le rôle de certaines structures cérébrales dans les multiples composantes de la douleur et dans l’analgésie par contreirritation et montre que les patientes Sii présentent une dysfonction des mécanismes spinaux et cérébraux impliqués dans la perception et la modulation de la douleur.

Cardiovascular effects of a medetomidine constant rate infusion at different dose levels in anaesthetized dogs

Les effets cardiovasculaires des alpha-2 agonistes, particulièrement importants chez les chiens, limitent leur utilisation en pratique vétérinaire. La perfusion à débit constant (PDC) de ces drogues, comme la médétomidine (MED) permettrait un contrôle plus précis de ces effets. Les effets hémodynamiques de plusieurs doses de MED en PDC ont été évalués chez le chien. Lors de cette étude prospective, réalisée en double aveugle, 24 chiens en santé, ont reçu de façon aléatoire une des 6 doses de MED PDC (4 chiens par groupe). Les chiens ont été ventilés mécaniquement pendant une anesthésie minimale standardisée avec de l’isoflurane dans de l’oxygène. Une dose de charge (DC) de médétomidine a été administrée aux doses de 0.2, 0.5, 1.0, 1.7, 4.0 ou 12.0 µg/kg pendant 10 minutes, après laquelle la MED PDC a été injectée à une dose identique à celle de la DC pendant 60 minutes. L’isoflurane a été administré seul pendant une heure après l’administration d’une combinaison d’ISO et de MED PDC pendant 70 minutes. La fréquence cardiaque (FC), la pression artérielle moyenne (PAM) et l’index du débit cardiaque (IC) ont été mesurés. Des prélèvements sanguins ont permis d’évaluer le profil pharmacocinétique. D’après ces études, les effets hémodynamiques de la MED PDC pendant une anesthésie à l’isoflurane ont été doses-dépendants. L’IC a diminué progressivement alors que la dose de MED augmentait avec: 14.9 (12.7), 21.7 (17.9), 27.1 (13.2), 44.2 (9.7), 47.9 (8.1), and 61.2 (14.1) % respectivement. Les quatre doses les plus basses n’ont provoqué que des changements minimes et transitoires de la FC, de la PAM et de l’IC. La pharmacocinétique apparaît clairement dose-dépendante. De nouvelles expériences seront nécessaires afin d’étudier l’utilisation clinique de la MED PDC.

Propriétés anesthésiques et analgésiques de l’eugénol chez la grenouille (Xenopus laevis), le poisson (Oncorhynchus mykiss) et le rat (Rattus norvegicus)

L'eugénol (2-methoxy-4-(2-propenyl) phénol), produit dérivé du clou de girofle (Eugenia aromatica), fut tout d’abord utilisé en application topique à des fins d’analgésie dentaire. Il produit également une anesthésie chirurgicale lorsque administré en immersion chez les poissons. L’eugénol agit sur les récepteurs vanilloïdes, sensibles à la chaleur, aux protons et à certaines molécules lipidiques. Ces récepteurs jouent un rôle important dans le mécanisme de l’inflammation et de l’hyperalgésie. L’eugénol pourrait également produire ses effets par antagonisme des récepteurs glutamaergiques (NMDA) et par son activation des récepteurs GABAergiques. Considérant que l’eugénol produit des effets analgésiques et anesthésiques, des études de pharmacocinétique et de pharmacodynamie furent réalisées chez la grenouille (Xenopus laevis), le poisson (Oncorhynchus mykiss) et le rat (Rattus norvegicus). Les résultats démontrent que l’eugénol administré par immersion à une dose efficace permet d’atteindre une anesthésie chirurgicale chez les grenouilles (350 mg/L) et les poissons (75 mg/L). Suite à des analyses plasmatiques par LC/MS/MS, la pharmacocinétique des grenouilles, des poissons et des rats montre que la drogue est éliminée et qu’il pourrait y avoir une recirculation entérohépathique plus importante chez la grenouille et le rat. La longue demi-vie chez le rat suggère aussi une accumulation dans les tissus après des administrations répétées. Suite à l’administration intraveineuse d’une dose de 20 mg/kg chez le rat, l’eugénol induit une anesthésie chirurgicale pour une très courte période de temps variant autour de 167 s. Les résultats de sensibilité thermique confirment l’efficacité de l’eugénol pour réduire l’hyperalgésie induite chez des rats neuropathiques. L’effet pharmacologique de l’eugénol a démontré une augmentation progressive constante de l’analgésie sur une période de cinq jours de traitements journaliers. En conclusion, l’eugénol possède des propriétés analgésiques et anesthésiques chez la grenouille africaine à griffes (Xenopus laevis), le poisson (Oncorhynchus mykiss) et le rat (Rattus norvegicus).

Recherche sur les effets de l'analgésie périopératoire optimale (RAPO) sur la douleur et la fonction après chirurgie de la main

Essai cinique randomisé

Evaluation des effets analgésiques du meloxicam après des chirurgies orthopédiques chez le pigeon (Columba livia)

L’évaluation de la douleur chez les oiseaux est difficile, puisque la plupart se comportent comme des proies et ont tendance à masquer tout signe extérieur de douleur. Les doses et les drogues utilisées pour traiter la douleur des oiseaux sont la plupart du temps basées sur une extrapolation d’autres espèces, ainsi que sur l’expérience clinique. Peu d’études de pharmacocinétique, d’efficacité et de toxicité sont disponibles dans la littérature. La plupart des études rapportées utilisent des stimuli nociceptifs éloignés des douleurs cliniques, comme les stimuli électriques ou thermiques, qui sont difficilement extrapolables à des situations rencontrées en pratique. L’objectif de notre projet était d’évaluer les effets analgésiques de deux doses de meloxicam chez le pigeon à l’aide d‘un modèle de fracture du fémur. La douleur post-opératoire a été évaluée pendant les quatre premiers jours suivant la chirurgie par trois méthodes : le suivi du poids porté sur la patte opérée comparativement à l’autre patte, quatre différentes échelles descriptives de douleur et la réalisation d’éthogrammes à l’aide d’enregistrements vidéo. L’administration de 0,5 mg/kg PO q12h de meloxicam n’a pas permis de réduire significativement les indicateurs de douleur mesurés comparativement à un groupe témoin recevant de la saline. Les pigeons ayant reçu 2 mg/kg PO q12h de meloxicam ont montré une réduction significative des indicateurs de douleur mesurés par les différentes méthodes. Nos résultats suggèrent que l’administration de 2 mg/kg PO q12h aux pigeons suite à une chirurgie orthopédique procure une analgésie supérieure aux doses actuellement recommandées dans la littérature.

Étude moléculaire de la formation de complexes protéiques impliqués dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G

La communication cellulaire est un phénomène important pour le maintien de l’homéostasie des cellules. Au court des dernières années, cette sphère de recherche sur la signalisation cellulaire a connue des avancées importantes au niveau de l’identification des acteurs principaux impliqués dans la reconnaissance extracellulaire des signaux, ainsi que la compréhension des voies de signalisation engagées par les cellules pour répondre aux facteurs extracellulaires. Malgré ces nouvelles informations, les diverses interrelations moléculaires entre les acteurs ainsi que les voies de signalisation cellulaire, demeurent mal comprises. Le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) permet la mesure d’interactions protéiques et peut être utilisé dans deux configurations, le BRET480-YFP (connu aussi comme le BRET1) et le BRET400-GFP (connu aussi en tant que BRET2). Suite à l’oxydation de son substrat, la luciférase de renilla peut transférer son énergie à une protéine fluorescente, uniquement si elles sont à proximité l’une de l’autre (≤100Å). La combinaison dans un seul essai des BRET480-YFP et BRET400-GFP, a permis de suivre trois paires d’interactions, sur une même population cellulaire. Par contre, l’utilisation de deux substrats pour la réaction de bioluminescence rend impossible la mesure simultanée des différents signaux de BRET, pour ce trois nouvelles configurations de BRET ont été mises au point en utilisant des nouvelles protéines fluorescentes. Ainsi deux des nouvelles couleurs de BRET ayant des émissions résolues, le BRET400-BFP et le BRET400mAmetrine ont pu être combinées pour mesurer l’engagement par un RCPG d’une protéine G, ainsi que l’accumulation du second messager. La combinaison de ces BRET a également permis de révéler la formation d’un complexe entre le récepteur α2A adrénergique (α2AAR), Gαi1, le dimère Gβγ ainsi que la kinase des récepteurs couplés aux protéines G (GRK2), suite à l’activation du récepteur. De plus, seule l’entrée de GRK2 semble être en mesure de causer la désensibilisation du α2AAR, en s’intercalant entre Gαi1 et Gβγ. Par contre, la stabilisation de l’interaction entre α2AAR et la β-arrestine2 semble nécessiter l’activité kinase de GRK2. Une autre étude a révélé l’importance de différentes Gα pour la mobilisation du calcium, suite à l’activation du récepteur aux opioïdes de type delta (DOR). Suite à la surexpression de Gα de la famille Gαq, il a été possible de mesurer une influence de ces Gα sur la mobilisation du calcium. Toutefois, cette réponse calcique mesurée en présence des Gαq demeure sensible aux prétraitements à la toxine de Bordetella pertussis, qui inhibe sélectivement l’activité des Gαi. De plus, la co-expression de Gαi et Gαq permet de potentialiser la mobilisation de calcium, démontrant une interrelation entre ces deux familles de protéine Gα, pour la signalisation du DOR. Afin de démontrer l’interrelation directe, des expériences de BRET ont été réalisées entre différentes Gα. En plus de montrer la formation de complexes sélectifs entre les Gα, les expériences de BRET réalisées en parallèle d’analyses de séquences de Gα, ont également mis à jour un site de sélectivité d’interaction entre les Gα, l’hélice α4. Suite à la transposition de cette hélice α4 de Gα12 sur Gαi1, qui normalement n’interagissent pas, il a été possible de forcer l’interaction entre Gα12 et Gαi1, confirmant ainsi que cette hélice α contient l’information permettant une sélectivité d’interaction. Au cours de cette thèse, il a été possible de générer de nouvelles méthodes de mesure d’interactions protéiques qui permettent de multiplexer différents signaux, ce qui a permis de mettre à jour de nouvelles interactions entre divers effecteurs de la signalisation de RCGP

Influence du sommeil sur l'analgésie placebo

La douleur est une expérience subjective multidimensionnelle pouvant être modulée par plusieurs facteurs cognitifs. L’impact des attentes liées à une expérience douloureuse imminente a été largement étudié dans un contexte d’analgésie placebo et il a été suggéré que la présence d’attentes conscientes de soulagement est nécessaire à la production d’une réduction de douleur. Par ailleurs, certaines études cliniques ont observé une amélioration thérapeutique après l’administration d’un placebo, même lors du sommeil, ce qui suggère qu’un effet placebo peut être rencontré même en absence d’attentes explicites de soulagement. La première étude de cette thèse vise donc à examiner si une réduction de douleur, ainsi qu’une diminution des perturbations du sommeil associées à des stimulations nociceptives expérimentales, peuvent être rencontrées suite à l’induction d’attentes de soulagement nocturne. Les résultats démontrent qu’une réduction de douleur et des perturbations du sommeil a effectivement été rapportée rétrospectivement suite à l’application d’un placebo, De plus, le traitement placebo semble moduler la réactivité à la douleur expérimentale durant le sommeil, en fonction des stades de sommeil dans lesquelles les stimulations sont présentées. Bien que le développement d’une analgésie placebo repose sur la génération d’attentes de soulagement, il semble que l’exposition préalable à un traitement efficace augmente l’ampleur de l’effet, ce qui suggère que des phénomènes d’apprentissage associatif puissent également être impliqués dans la genèse de ces effets. Comme un rôle du sommeil à été montré dans l’apprentissage et la mémorisation de plusieurs aptitudes, l’objectif de la seconde étude était d’examiner la possibilité que la présence d’un épisode de sommeil entre l’induction et l’évaluation d’un effet placebo puisse renforcer l’intégration des attentes et par conséquent, favoriser la production d’effets dépendants des attentes. Les résultats ont effectivement montré que le sommeil augmente l’association entre les attentes et le soulagement, et que celles-ci semblent liées à la durée relative de sommeil REM mesurée suite à l’induction. Dans l’ensemble cette thèse démontre que le sommeil peut influencer la production d’une analgésie placebo, et ce, à plusieurs niveaux.