Étude du mécanisme impliqué dans la protection des spermatozoïdes de mammifères par le jaune d'oeuf

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude de l’efficacité de la vaccination à Salmonella Enteritidis chez la poule pondeuse et de la protection contre l’infection

Les infections à Salmonella Enteritidis chez les humains sont associées à la consommation d’œufs ou d’ovoproduits contaminés. La vaccination est un outil utilisé pour diminuer les risques d’infection à SE chez la volaille, mais avec des résultats variables. Au Canada deux bactérines, MBL SE4C et Layermune, sont couramment utilisées pour lutter contre SE. Cependant, leur efficacité n’a pas été complètement déterminée chez les poules pondeuses plus âgées. Par ailleurs, la capacité de ces vaccins à prévenir la transmission verticale et horizontale n’a pas encore été étudiée. L’objectif principal de cette étude était d’évaluer l’effet des deux bactérines sur la réponse immunitaire chez les poules pondeuses, de vérifier la protection conférée par ces vaccins contre l’infection expérimentale à SE, et d’identifier des protéines immunogènes afin de développer un vaccin sous-unitaire. Les oiseaux ont été vaccinés avec deux protocoles d’immunisation en cours d’élevage (soit à 12 et 18, ou à 16 semaines d’âge). Le groupe contrôle a été injecté avec la solution saline. Les oiseaux ont été inoculés per os avec 2 x 109 CFU de la souche SE lysotype 4 à 55 ou à 65 semaines d’âge. Les anticorps (IgG et IgA) ont été mesurés à différents temps avec un ELISA maison en utilisant l’antigène entier de SE. La phagocytose, flambée oxydative, les populations des splénocytes B et T ont été analysées en utilisant la cytométrie en flux. Les signes cliniques, l’excrétion fécale, la contamination des jaunes d’œufs et l’invasion des salmonelles dans les organes ont été étudiés pour évaluer l’efficacité de protection. La transmission horizontale a aussi été étudiée en évaluant l’infection à SE chez les oiseaux mis en contact avec les oiseaux inoculés. Les protéines immunogènes ont été identifiées par SDS-PAGE et Western blot à l’aide d’antisérums prélevés suite à la vaccination et/ou à l’infection expérimentale/naturelle, puis caractérisées par la spectrométrie de masse. Le protocole de vaccination avec deux immunisations a généré un niveau élevé de séroconversion à partir de 3 jusqu’à 32-34 semaines post-vaccination par rapport à celui avec une seule immunisation (p < 0.02), mais il n’y avait plus de différence entre les groupes à 54 et 64 semaines d’âge. Il n’y a pas eu de corrélation entre les niveaux d’IgG et les taux d’isolement des salmonelles dans les organes et des jaunes d’œuf. La production des IgA n’a été observée que chez les oiseaux vaccinés avec 2 injections de MBL SE4C (p ≤ 0.04). Après l’infection expérimentale, la production des IgA a été significativement plus élevée aux jours 1 et 7 p.i dans l’oviducte des oiseaux vaccinés (sauf pour le groupe vacciné avec 2 injections de Layermune) par comparaison avec le groupe contrôle (p ≤ 0.03). Seule la bactérine MBL SE4C a eu un effet protecteur contre la contamination des jaunes d’œuf chez les oiseaux infectés. Ce vaccin réduit partiellement en utilisant deux immunisations, le taux d’excrétion fécale des salmonelles chez les oiseaux inoculés et les oiseaux horizontalement infectés (p ≤ 0.02). Cinq des protéines identifiées par la spectrométrie de masse sont considérées comme des protéines potentiellement candidates pour une étude plus approfondie de leur immonogénicité: Lipoamide dehydrogenase, Enolase (2-phosphoglycerate dehydratase) (2-phospho-D-glycerate hydro-lyase), Elongation factor Tu (EF-Tu), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) et DNA protection during starvation protein. En général, les bactérines ont induit une immunité humorale (IgG et IgA) chez les poules pondeuses. Cette réponse immunitaire a protégé partiellement les oiseaux quant à l’élimination des salmonelles, la contamination des jaunes d’œuf, ainsi que la transmission horizontale. Dans cette étude, la bactérine MBL SE4C (avec deux immunisations) s’est montrée plus efficace pour protéger les oiseaux que la bactérine Layermune. Nos résultats apportent des informations objectives et complémentaires sur le potentiel de deux bactérines pour lutter contre SE chez les poules pondeuses. Étant donné la protection partielle obtenue en utilisant ces vaccins, l’identification des antigènes immunogènes a permis de sélectionner des protéines spécifiques pour l’élaboration éventuelle d’un vaccin plus efficace contre SE chez les volailles.

Étude du mécanisme de protection des spermatozoïdes de mammifères par le lait

Le lait écrémé est utilisé depuis plus d’un demi-siècle comme diluant protecteur des spermatozoïdes de mammifères. Depuis quelques années, il existe une demande grandissante pour des diluants exempts de produits d’origine animale. Toutefois, le mécanisme par lequel le lait protège les spermatozoïdes n’est pas connu, ce qui rend difficile de lui trouver un substitut. Les protéines majeures du plasma séminal de taureau, les protéines « Binder of SPerm » (BSP), sont néfastes lors de la conservation de la semence. Les spermatozoïdes sont en contact avec une grande concentration de protéines BSP qui stimulent une extraction continuelle de cholestérol/phospholipides de leur membrane plasmique. Les lipoprotéines de faible densité (LDL) du jaune d’oeuf, un autre composé utilisé dans les diluants, empêcheraient les protéines BSP de se lier à la membrane des spermatozoïdes de taureaux et de stimuler un efflux des lipides membranaires, ce qui les protégerait durant la conservation. Notre hypothèse était que les protéines du lait protègent les spermatozoïdes durant la conservation en séquestrant les protéines BSP. Premièrement, nous avons démontré par filtration sur gel qu’il y a une interaction entre les protéines BSP bovines et les protéines du lait. Le lait écrémé a été fractionné en trois fractions : F1 (alpha-lactalbumine, bêta-lactoglobuline et caséine kappa), F2 (toutes les protéines du lait) et F3 (sels, sucres et petits peptides). Les protéines BSP1 et BSP5 ont une affinité plus grande pour F1 que BSP3, tandis que toutes les protéines BSP ont une affinité pour F2. Le titrage calorimétrique isotherme a permis de confirmer l’interaction entre les protéines BSP et les protéines du lait. L’association entre la protéine BSP1 bovine et les micelles de caséines est caractérisée par une constante d’affinité (Ka) de 3.5 × 10^5 M-1 et un paramètre stoichiométrique (n) de 4,5 BSP1 pour une caséine. L’association entre la protéine BSP1 bovine et l’alpha-lactalbumine (une protéine du sérum principale), est caractérisée par un Ka de 2.4 × 10^5 M-1 et une valeur “n” de 0,8. Ces résultats indiquent que le lait protège les spermatozoïdes bovins en séquestrant les protéines BSP grâce à une interaction protéine : protéine, tandis que le jaune d’oeuf les protège grâce à une interaction protéine : lipoprotéine. Deuxièmement, nous avons démontré par filtration sur gel que les protéines homologues aux BSP bovines retrouvées dans le plasma séminal de porc, d’étalon et de bélier ont une affinité avec les protéines du lait, ce qui suggère que le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait pourrait être le même chez ces espèces. Troisièmement, nous avons caractérisé l’interaction entre BSP1 bovine et les LDL du jaune d’oeuf qui a un Ka de 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 et une valeur de « n » de 104 BSP1 pour une particule de LDL, indiquant qu’il existe des différences entre le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait et le jaune d’oeuf. Nous croyons que les résultats présentés dans cette thèse aideront à créer de nouveaux diluants ne contenant pas de produits d’origine animale afin de cryoconserver les spermatozoïdes des mammifères.

Production and immunogenicity of selected proteins of Salmonella Enteritidis

Au cours des dernières années, Salmonella Enteritidis est devenus les sérotypes les plus souvent isolés chez les patients canadiens, les cas étant liés à la consommation de viande de poulet et d’œufs crus. Les vaccins tués commercialement disponibles pour la volaille, stimulent mal l'immunité mucosale, tandis que l'utilisation de vaccins vivants reste controversée. Par conséquent, un vaccin sous-unitaire par voie orale peut être une solution. Cinq protéines bactériennes ont été choisies comme candidates potentielles et identifiées, soit Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Enolase, Lipoamide dehydrogenase, DNA protection during starvation protein et Elongation factor-Tu. Notre objectif a été de produire et de purifier ces protéines et de démontrer leur immunogénicité. Les gènes des protéines ont été amplifiés et clonés dans le vecteur pQE-30 pour expression dans Escherichia coli M15. La purification a été effectuée par FPLC. Des poules pondeuses SPF ont été séparées en 6 groupes et injectées par voie intramusculaire à different âges avec une des 5 protéines, ou le PBS chez le groupe témoin. Les œufs ont été ramassés pendant l'expérience et du sang a été prélevé à 36 semaines d'âge. Les anticorps IgY ont été extraits à partir du jaune d'oeuf et du sérum, et les IgA à partir du blanc d'oeuf. Des immunodots, westernblots et ELISA ont évalué l'immunogénicité des protéines et les niveaux d'anticorps induits . Nous avons constaté que ces cinq protéines pourraient stimuler la production d'anticorps spécifiques in vivo. GAPDH, Enolase et DPS ont induit des titres d'anticorps plus élevés que LpdA et EF-Tu.