Comparative mitochondrial genomics toward understanding genetics and evolution of arbuscular mycorrhizal fungi

Les champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA) sont très répandus dans le sol où ils forment des associations symbiotiques avec la majorité des plantes appelées mycorhizes arbusculaires. Le développement des CMA dépend fortement de la plante hôte, de telle sorte qu'ils ne peuvent vivre à l'état saprotrophique, par conséquent ils sont considérés comme des biotrophes obligatoires. Les CMA forment une lignée évolutive basale des champignons et ils appartiennent au phylum Glomeromycota. Leurs mycélia sont formés d’un réseau d’hyphes cénocytiques dans lesquelles les noyaux et les organites cellulaires peuvent se déplacer librement d’un compartiment à l’autre. Les CMA permettent à la plante hôte de bénéficier d'une meilleure nutrition minérale, grâce au réseau d'hyphes extraradiculaires, qui s'étend au-delà de la zone du sol explorée par les racines. Ces hyphes possèdent une grande capacité d'absorption d’éléments nutritifs qui vont être transportés par ceux-ci jusqu’aux racines. De ce fait, les CMA améliorent la croissance des plantes tout en les protégeant des stresses biotiques et abiotiques. Malgré l’importance des CMA, leurs génétique et évolution demeurent peu connues. Leurs études sont ardues à cause de leur mode de vie qui empêche leur culture en absence des plantes hôtes. En plus leur diversité génétique intra-isolat des génomes nucléaires, complique d’avantage ces études, en particulier le développement des marqueurs moléculaires pour des études biologiques, écologiques ainsi que les fonctions des CMA. C’est pour ces raisons que les génomes mitochondriaux offrent des opportunités et alternatives intéressantes pour étudier les CMA. En effet, les génomes mitochondriaux (mt) publiés à date, ne montrent pas de polymorphismes génétique intra-isolats. Cependant, des exceptions peuvent exister. Pour aller de l’avant avec la génomique mitochondriale, nous avons besoin de générer beaucoup de données de séquençages de l’ADN mitochondrial (ADNmt) afin d’étudier les méchanismes évolutifs, la génétique des population, l’écologie des communautés et la fonction des CMA. Dans ce contexte, l’objectif de mon projet de doctorat consiste à: 1) étudier l’évolution des génomes mt en utilisant l’approche de la génomique comparative au niveau des espèces proches, des isolats ainsi que des espèces phylogénétiquement éloignées chez les CMA; 2) étudier l’hérédité génétique des génomes mt au sein des isolats de l’espèce modèle Rhizophagus irregularis par le biais des anastomoses ; 3) étudier l’organisation des ADNmt et les gènes mt pour le développement des marqueurs moléculaires pour des études phylogénétiques. Nous avons utilisé l’approche dite ‘whole genome shotgun’ en pyroséquençage 454 et Illumina HiSeq pour séquencer plusieurs taxons de CMA sélectionnés selon leur importance et leur disponibilité. Les assemblages de novo, le séquençage conventionnel Sanger, l’annotation et la génomique comparative ont été réalisés pour caractériser des ADNmt complets. Nous avons découvert plusieurs mécanismes évolutifs intéressant chez l’espèce Gigaspora rosea dans laquelle le génome mt est complètement remanié en comparaison avec Rhizophagus irregularis isolat DAOM 197198. En plus nous avons mis en évidence que deux gènes cox1 et rns sont fragmentés en deux morceaux. Nous avons démontré que les ARN transcrits les deux fragments de cox1 se relient entre eux par épissage en trans ‘Trans-splicing’ à l’aide de l’ARN du gene nad5 I3 qui met ensemble les deux ARN cox1.1 et cox1.2 en formant un ARN complet et fonctionnel. Nous avons aussi trouvé une organisation de l’ADNmt très particulière chez l’espèce Rhizophagus sp. Isolat DAOM 213198 dont le génome mt est constitué par deux chromosomes circulaires. En plus nous avons trouvé une quantité considérable des séquences apparentées aux plasmides ‘plasmid-related sequences’ chez les Glomeraceae par rapport aux Gigasporaceae, contribuant ainsi à une évolution rapide des ADNmt chez les Glomeromycota. Nous avons aussi séquencé plusieurs isolats de l’espèces R. irregularis et Rhizophagus sp. pour décortiquer leur position phylogénéque et inférer des relations évolutives entre celles-ci. La comparaison génomique mt nous montré l’existence de plusieurs éléments mobiles comme : des cadres de lecture ‘open reading frames (mORFs)’, des séquences courtes inversées ‘short inverted repeats (SIRs)’, et des séquences apparentées aux plasimdes ‘plasmid-related sequences (dpo)’ qui impactent l’ordre des gènes mt et permettent le remaniement chromosomiques des ADNmt. Tous ces divers mécanismes évolutifs observés au niveau des isolats, nous permettent de développer des marqueurs moléculaires spécifiques à chaque isolat ou espèce de CMA. Les données générées dans mon projet de doctorat ont permis d’avancer les connaissances fondamentales des génomes mitochondriaux non seulement chez les Glomeromycètes, mais aussi de chez le règne des Fungi et les eucaryotes en général. Les trousses moléculaires développées dans ce projet peuvent servir à des études de la génétique des populations, des échanges génétiques et l’écologie des CMA ce qui va contribuer à la compréhension du rôle primorial des CMA en agriculture et environnement.

La génomique évolutive mitochondriale révèle des échanges génétiques et la ségrégation chez les Gloméromycètes

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) sont des organismes microscopiques du sol qui jouent un rôle crucial dans les écosystèmes naturels et que l’on retrouve dans tous les habitats de la planète. Ils vivent en relation symbiotique avec la vaste majorité des plantes terrestres. Ils sont des biotrophes obligatoires, c'est-à-dire qu'ils ne peuvent croître qu'en présence d'une plante hôte. Cette symbiose permet entre autres à la plante d'acquérir des nutriments supplémentaires, en particulier du phosphore et du nitrate. Malgré le fait que cette symbiose apporte des services importants aux écosystèmes, la richesse des espèces, la structure des communautés, ainsi que la diversité fonctionnelle des CMA sont mal connues et l'approfondissement des connaissances dans ces domaines dépend d’outils de diagnostic moléculaire. Cependant, la présence de polymorphisme nucléaire intra-isolat combiné à un manque de données génomiques dans différents groupes phylogénétique de ces champignons complique le développement de marqueurs moléculaires et la détermination de l'affiliation évolutive à hauts niveaux de résolution (c.a.d. entre espèces génétiquement similaires et/ou isolats de la même espèce). . Pour ces raisons, il semble une bonne alternative d’utiliser un système génétique différent en ciblant le génome mitochondrial, qui a été démontré homogène au sein d'un même isolat de CMA. Cependant, étant donné le mode de vie particulier de ces organismes, une meilleure compréhension des processus évolutifs mitochondriaux est nécessaire afin de valoriser l'utilisation de tels marqueurs dans des études de diversité et en génétique des populations. En ce sens, mon projet de doctorat consistait à investiguerétudier: i) les vecteurs de divergences inter-isolats et -espèces génétiquement rapprochéesphylogénétiquement apparentées, ii) la plasticité des génomes mitochondriaux, iii) l'héritabilité mitochondriale et les mécanismes potentiels de ségrégation, ainsi que iv) la diversité mitochondriale intra-isolat in situ. À l'aide de la génomique mitochondriale comparative, en utilisant le séquençage nouvelle génération, on a démontré la présence de variation génétique substantielle inter-isolats et -espèces, engendrées par l'invasion d'éléments mobiles dans les génomes mitochondriaux des CMA, donnant lieu à une évolution moléculaire rapide des régions intergéniques. Cette variation permettait de développer des marqueurs spécifiques à des isolats de la même espèce. Ensuite, à l'aide d'une approche analytique par réseaux de gènes sur des éléments mobiles, on a été en mesure de démontrer des évènements de recombinaisons homologues entre des haplotypes mitochondriaux distincts, menant à des réarrangements génomiques. Cela a permis d'ouvrir les perspectives sur la dynamique mitochondriale et l'hétéroplasmie dans un même isolatsuggère une coexistence de différents haplotypes mitochondriaux dans les populations naturelles et que les cultures monosporales pourraient induirent une sous-estimation de la diversité allélique mitochondriale. Cette apparente contradiction avec l'homogénéité mitochondriale intra-isolat généralement observée, a amené à investiguer étudier les échanges génétiques à l'aide de croisements d'isolats génétiquement distincts. Malgré l'observation de quelques spores filles hétéroplasmiques, l'homoplasmie était le statut par défaut dans toutes les cultures monosporales, avec un biais en faveur de l'un des haplotypes parentaux. Ces résultats suggèrent que la ségrégation opère durant la formation de la spore et/ou le développement de la coloniedu mycélium. De plus, ils supportent la présence d'une machinerie protéique de ségrégation mitochondriale chez les CMAAMF, où l'ensemble des gènes impliqués dans ce mécanisme ont été retrouvé et sont orthologues aux autres champignons. Finalement, on est revenue aux sources avecon a étudié le polymorphisme mitochondrial intra-isolat à l'aide d'une approche conventionnelle de PCR en utilisant une Taq polymérase de haute fidélité, suivie de clonage et de séquençage Sanger, sur deux isolats de R. irregularis. Cela a permis l'observation d'hétéroplasmie in situ, ainsi que la co-expression de variantes de variantes de protéines'ARNm dans une souche in vitro. Les résultats suggèrent que d'autres études basées sur le séquençage nouvelle génération aurait potentiellement ignorée cette variation, offrant ainsi plusieurs nouveaux arguments permettant de considérer les CMA comme des organismes possédant une population de génomes mitochondriaux et nucléaires distincts.

Identification et caractérisation de facteurs impliqués dans la réplication et la stabilité des génomes des organelles de plantes

Comparativement au génome contenu dans le noyau de la cellule de plante, nos connaissances des génomes des deux organelles de cette cellule, soit le plastide et la mitochondrie, sont encore très limitées. En effet, un nombre très restreint de facteurs impliqués dans la réplication et la réparation de l’ADN de ces compartiments ont été identifiés à ce jour. Au cours de notre étude, nous avons démontré l’implication de la famille de protéines Whirly dans le maintien de la stabilité des génomes des organelles. Des plantes mutantes pour des gènes Whirly chez Arabidopsis thaliana et Zea mays montrent en effet une augmentation du nombre de molécules d’ADN réarrangées dans les plastides. Ces nouvelles molécules sont le résultat d’une forme de recombinaison illégitime nommée microhomology-mediated break-induced replication qui, en temps normal, se produit rarement dans le plastide. Chez un mutant d’Arabidopsis ne possédant plus de protéines Whirly dans les plastides, ces molécules d’ADN peuvent même être amplifiées jusqu’à cinquante fois par rapport au niveau de l’ADN sauvage et causer un phénotype de variégation. L’étude des mutants des gènes Whirly a mené à la mise au point d’un test de sensibilité à un antibiotique, la ciprofloxacine, qui cause des bris double brin spécifiquement au niveau de l’ADN des organelles. Le mutant d’Arabidopsis ne contenant plus de protéines Whirly dans les plastides est plus sensible à ce stress que la plante sauvage. L’agent chimique induit en effet une augmentation du nombre de réarrangements dans le génome du plastide. Bien qu’un autre mutant ne possédant plus de protéines Whirly dans les mitochondries ne soit pas plus sensible à la ciprofloxacine, on retrouve néanmoins plus de réarrangements dans son ADN mitochondrial que dans celui de la plante sauvage. Ces résultats suggèrent donc une implication pour les protéines Whirly dans la réparation des bris double brin de l’ADN des organelles de plantes. Notre étude de la stabilité des génomes des organelles a ensuite conduit à la famille des protéines homologues des polymérases de l’ADN de type I bactérienne. Plusieurs groupes ont en effet suggéré que ces enzymes étaient responsables de la synthèse de l’ADN dans les plastides et les mitochondries. Nous avons apporté la preuve génétique de ce lien grâce à des mutants des deux gènes PolI d’Arabidopsis, qui encodent des protéines hautement similaires. La mutation simultanée des deux gènes est létale et les simples mutants possèdent moins d’ADN dans les organelles des plantes en bas âge, confirmant leur implication dans la réplication de l’ADN. De plus, les mutants du gène PolIB, mais non ceux de PolIA, sont hypersensibles à la ciprofloxacine, suggérant une fonction dans la réparation des bris de l’ADN. En accord avec ce résultat, la mutation combinée du gène PolIB et des gènes des protéines Whirly du plastide produit des plantes avec un phénotype très sévère. En définitive, l’identification de deux nouveaux facteurs impliqués dans le métabolisme de l’ADN des organelles nous permet de proposer un modèle simple pour le maintien de ces deux génomes.

Implication des protéines RECA dans le maintien de la stabilité du génome des chloroplastes d’Arabidopsis thaliana.

La stabilité génomique des organelles de plantes suscite un grand intérêt dans le domaine de la biologie végétale. En effet, plusieurs études récentes suggèrent que ce type d’instabilité génomique pourrait mener à l’isolation de traits intéressants en l’agronomie. Plusieurs protéines sont d’ailleurs déjà été identifiés comme étant impliqués dans le maintien de la stabilité de ces génomes, tels que MSH1, la famille des POLI, OSB1, les protéines Whirly et les Recombinases A (RECA). Le génome nucléaire d’Arabidopsis thaliana encode trois protéines s’apparentant à la Recombinase A bactérienne et qui sont ciblées à la mitochondrie et/ou au chloroplaste, soit RECA1, RECA2 et RECA3. Globalement, ces gènes partagent une similarité de séquence de 61% avec leur homologue bactérien chez Escherichia coli. Chez les bactéries ces protéines jouent un rôle essentiel dans la recombinaison homologue et sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Chez Arabidopsis, il a été démontré que RECA2 et RECA3 sont nécessaires au maintien de l’intégrité du génome mitochondriale. Toutefois leur contribution à la stabilité du génome chloroplastique ainsi que le rôle de RECA1 restent obscures. Le but de ce projet est donc de déterminer la contribution éventuelle des protéines RECA d’Arabidopsis dans la réparation de l’ADN chloroplastique et plus précisément le rôle du gène RECA1. Nous énonçons l’hypothèse que les RECA de plantes se comportent effectivement comme leurs orthologues bactériens en étant impliqués dans la recombinaison homologue. Dans le cadre de ce projet, nous avons tenté d’isoler des lignées mutantes pour chacun des gènes RECA d’Arabidopsis. En somme, nous avons pu obtenir des lignées convenables pour notre étude que dans le cas du gène RECA1. Ces lignées ont été utilisées pour évaluer la contribution de ce gène à la stabilité du génome du chloroplaste. Ensuite, pour étudier la relation épistatique des gènes RECA1, WHY1 et WHY3, un croisement des différentes lignées mutantes pour ces gènes a été réalisé. Nous avons ensuite étudié la sensibilité de toutes ces lignées mutantes à la ciprofloxacine, un agent causant des bris double brin exclusivement dans les organelles de plantes. Finalement, iii nous avons testé la présence de réarrangements dans le génome du chloroplaste en condition normal ou en présence de stress génotoxique. Nos résultats démontrent que les protéines Whirly et RECA1 sont impliquées dans deux voies de réparation de l’ADN différentes et que les Whirly sont suffisantes pour s’occuper des bris d’ADN double brin en l’absence de RECA1. Nous démontrons également que l’absence de Whirly et RECA1 entraine une forte augmentation de la quantité de réarrangements dans le génome du chloroplaste. De plus nous proposons que la polymérase POLIB est impliquée dans la même voie de réparation que RECA1. Finalement nous proposons un modèle pour expliquer nos résultats et impliquons RECA1 dans un mécanisme de réparation d’ADN et aussi un rôle potentiel dans la réplication.

Algorithmes pour la reconstruction de génomes ancestraux

L’inférence de génomes ancestraux est une étape essentielle pour l’étude de l’évolution des génomes. Connaissant les génomes d’espèces éteintes, on peut proposer des mécanismes biologiques expliquant les divergences entre les génomes des espèces modernes. Diverses méthodes visant à résoudre ce problème existent, se classant parmis deux grandes catégories : les méthodes de distance et les méthodes de synténie. L’état de l’art des distances génomiques ne permettant qu’un certain répertoire de réarrangements pour le moment, les méthodes de synténie sont donc plus appropriées en pratique. Nous proposons une méthode de synténie pour la reconstruction de génomes ancestraux basée sur une définition relaxée d’adjacences de gènes, permettant un contenu en gène inégal dans les génomes modernes causé par des pertes de gènes de même que des duplications de génomes entiers (DGE). Des simulations sont effectuées, démontrant une capacité de former une solution assemblée en un nombre réduit de régions ancestrales contigües par rapport à d’autres méthodes tout en gardant une bonne fiabilité. Des applications sur des données de levures et de plantes céréalières montrent des résultats en accord avec d’autres publications, notamment la présence de fusion imbriquée de chromosomes pendant l’évolution des céréales.

Étude de l’évolution des génomes par duplications, pertes et réarrangements

La duplication est un des évènements évolutifs les plus importants, car elle peut mener à la création de nouvelles fonctions géniques. Durant leur évolution, les génomes sont aussi affectés par des inversions, des translocations (incluant des fusions et fissions de chromosomes), des transpositions et des délétions. L'étude de l'évolution des génomes est importante, notamment pour mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués, les types d'évènements qui sont les plus fréquents et quels étaient les contenus en gènes des espèces ancestrales. Afin d'analyser ces différents aspects de l'évolution des génomes, des algorithmes efficaces doivent être créés pour inférer des génomes ancestraux, des histoires évolutives, des relations d'homologies et pour calculer les distances entre les génomes. Dans cette thèse, quatre projets reliés à l'étude et à l'analyse de l'évolution des génomes sont présentés : 1) Nous proposons deux algorithmes pour résoudre des problèmes reliés à la duplication de génome entier : un qui généralise le problème du genome halving aux pertes de gènes et un qui permet de calculer la double distance avec pertes. 2) Nous présentons une nouvelle méthode pour l'inférence d'histoires évolutives de groupes de gènes orthologues répétés en tandem. 3) Nous proposons une nouvelle approche basée sur la théorie des graphes pour inférer des gènes in-paralogues qui considère simultanément l'information provenant de différentes espèces afin de faire de meilleures prédictions. 4) Nous présentons une étude de l'histoire évolutive des gènes d'ARN de transfert chez 50 souches de Bacillus.

Impact d'une mitochondrie exogène sur le protéome du cybride Chrosomus eos

On retrouve dans le complexe Chrosomus eos-neogaeus une forme cybride ayant le génome nucléaire de C. eos et le génome mitochondrial de C. neogaeus. Ce modèle particulier fournit une occasion unique d’étudier l’influence d’une mitochondrie exogène sur le métabolisme et la physiologie d'organismes vivant en milieu naturel, et s'étant donc adaptés à cette situation cellulaire atypique. La mitochondrie jouant un rôle fondamental vital, nous nous attendons à ce que la présence d’une mitochondrie exogène chez la forme cybride ait un impact sur l’expression de son génome et du protéome qui en découle. L’objectif de ce projet est d’étudier les différences au niveau protéomique entre des individus C. eos purs (forme sauvage) et des cybrides provenant d'habitats similaires afin de faire ressortir au maximum les différences dues à la présence de mitochondries C. neogaeus chez la forme cybride. Pour ce faire, nous avons comparé les protéomes des formes cybride et sauvage en utilisant l'électrophorèse en deux dimensions. Un sous-groupe de protéines produisant un signal spécifique révélé par l’analyse comparative a été identifié et analysé par spectrométrie de masse (LC/MS). Les résultats indiquent que la présence de mitochondries C. neogaeus chez le cybride influence fortement la régulation génique chez ce dernier. De plus, les protéines identifiées apportent des pistes intéressantes supportant l'hypothèse que la présence de mitochondries C. neogaeus chez le cybride rendrait ce biotype plus résistant au froid que la forme sauvage.

Le maintien de la stabilité génomique du plastide : un petit génome d’une grande importance

Chez les plantes, le génome plastidique est continuellement exposé à divers stress mutagènes, tels l’oxydation des bases et le blocage des fourches de réplication. Étonnamment, malgré ces menaces, le génome du plastide est reconnu pour être très stable, sa stabilité dépassant même celle du génome nucléaire. Néanmoins, les mécanismes de réparation de l’ADN et du maintien de la stabilité du génome plastidique sont encore peu connus. Afin de mieux comprendre ces processus, nous avons développé une approche, basée sur l’emploi de la ciprofloxacine, qui nous permet d’induire des bris d’ADN double-brins (DSBs) spécifiquement dans le génome des organelles. En criblant, à l’aide de ce composé, une collection de mutants d’Arabidopsis thaliana déficients pour des protéines du nucléoïde du plastide, nous avons identifié 16 gènes vraisemblablement impliqués dans le maintien de la stabilité génomique de cette organelle. Parmi ces gènes, ceux de la famille Whirly jouent un rôle primordial dans la protection du génome plastidique face aux réarrangements dépendants de séquences de microhomologie. Deux autres familles de gènes codant pour des protéines plastidiques, soit celle des polymérases de types-I et celle des recombinases, semblent davantage impliquées dans les mécanismes conservateurs de réparation des DSBs. Les relations épistatiques entre ces gènes et ceux des Whirly ont permis de définir les bases moléculaires des mécanismes de la réparation dépendante de microhomologies (MHMR) dans le plastide. Nous proposons également que ce type de mécanismes servirait en quelque sorte de roue de secours pour les mécanismes conservateurs de réparation. Finalement, un criblage non-biaisé, utilisant une collection de plus de 50,000 lignées mutantes d’Arabidopsis, a été réalisé. Ce criblage a permis d’établir un lien entre la stabilité génomique et le métabolisme des espèces réactives oxygénées (ROS). En effet, la plupart des gènes identifiés lors de ce criblage sont impliqués dans la photosynthèse et la détoxification des ROS. Globalement, notre étude a permis d’élargir notre compréhension des mécanismes du maintien de la stabilité génomique dans le plastide et de mieux comprendre l’importance de ces processus.

Three rounds (1R/2R/3R) of genome duplications and the evolution of the glycolytic pathway in vertebrates

Affiliation: Henner Brinkmann : Département de biochimie, Faculté de médecine, Université de Montreal

The evolution of inter-genomic variation in arbuscular mycorrhizal fungi

Contexte: Les champignons mycorhiziens à arbuscules (AMF) établissent des relations symbiotiques avec la plupart des plantes grâce à leurs réseaux d’hyphes qui s’associent avec les racines de leurs hôtes. De précédentes études ont révélé des niveaux de variation génétique extrêmes pour des loci spécifiques permettant de supposer que les AMF peuvent contenir des milliers de noyaux génétiquement divergents dans un même cytoplasme. Si aucun processus de reproduction sexuée n’a jusqu’ici été observé chez ces mycorhizes, on constate cependant que des niveaux élevés de variation génétique peuvent être maintenus à la fois par l’échange de noyaux entre hyphes et par des processus fréquents de recombinaison entre noyaux. Les AMF se propagent par l’intermédiaire de spores qui contiennent chacune un échantillon d’une population initiale de noyaux hétérogènes, directement hérités du mycélium parent. À notre connaissance les AMF sont les seuls organismes qui ne passent jamais par un stade mononucléaire, ce qui permet aux noyaux de diverger génétiquement dans un même cytoplasme. Ces aspects singuliers de la biologie des AMF rendent l’estimation de leur diversité génétique problématique. Ceci constitue un défi majeur pour les écologistes sur le terrain mais également pour les biologistes moléculaires dans leur laboratoire. Au-delà même des problématiques de diversité spécifique, l’amplitude du polymorphisme entre noyaux mycorhiziens est mal connue. Le travail proposé dans ce manuscrit de thèse explore donc les différents aspects de l’architecture génomique singulière des AMF. Résultats L’ampleur du polymorphisme intra-isolat a été déjà observée pour la grande sous-unité d’ARN ribosomal de l’isolat Glomus irregulare DAOM-197198 (précédemment identifié comme G. intraradices) et pour le gène de la polymerase1-like (PLS) de Glomus etunicatum isolat NPI. Dans un premier temps, nous avons pu confirmer ces résultats et nous avons également pu constater que ces variations étaient transcrites. Nous avons ensuite pu mettre en évidence la présence d’un goulot d’étranglement génétique au moment de la sporulation pour le locus PLS chez l’espèce G. etunicatum illustrant les importants effets d’échantillonnage qui se produisaient entre chaque génération de spore. Enfin, nous avons estimé la différentiation génétique des AMF en utilisant à la fois les réseaux de gènes appliqués aux données de séquençage haut-débit ainsi que cinq nouveaux marqueurs génomiques en copie unique. Ces analyses révèlent que la différenciation génomique est présente de manière systématique dans deux espèces (G. irregulare et G. diaphanum). Conclusions Les résultats de cette thèse fournissent des preuves supplémentaires en faveur du scénario d’une différenciation génomique entre noyaux au sein du même isolat mycorhizien. Ainsi, au moins trois membres du genre Glomus, G. irregulare, G. diaphanum and G. etunicatum, apparaissent comme des organismes dont l’organisation des génomes ne peut pas être décrit d’après un modèle Mendélien strict, ce qui corrobore l’hypothèse que les noyaux mycorhiziens génétiquement différenciés forment un pangenome.

A phylogenomics approach to resolving fungal evolution, and phylogenetic method development

Bien que les champignons soient régulièrement utilisés comme modèle d'étude des systèmes eucaryotes, leurs relations phylogénétiques soulèvent encore des questions controversées. Parmi celles-ci, la classification des zygomycètes reste inconsistante. Ils sont potentiellement paraphylétiques, i.e. regroupent de lignées fongiques non directement affiliées. La position phylogénétique du genre Schizosaccharomyces est aussi controversée: appartient-il aux Taphrinomycotina (précédemment connus comme archiascomycetes) comme prédit par l'analyse de gènes nucléaires, ou est-il plutôt relié aux Saccharomycotina (levures bourgeonnantes) tel que le suggère la phylogénie mitochondriale? Une autre question concerne la position phylogénétique des nucléariides, un groupe d'eucaryotes amiboïdes que l'on suppose étroitement relié aux champignons. Des analyses multi-gènes réalisées antérieurement n'ont pu conclure, étant donné le choix d'un nombre réduit de taxons et l'utilisation de six gènes nucléaires seulement. Nous avons abordé ces questions par le biais d'inférences phylogénétiques et tests statistiques appliqués à des assemblages de données phylogénomiques nucléaires et mitochondriales. D'après nos résultats, les zygomycètes sont paraphylétiques (Chapitre 2) bien que le signal phylogénétique issu du jeu de données mitochondriales disponibles est insuffisant pour résoudre l'ordre de cet embranchement avec une confiance statistique significative. Dans le Chapitre 3, nous montrons à l'aide d'un jeu de données nucléaires important (plus de cent protéines) et avec supports statistiques concluants, que le genre Schizosaccharomyces appartient aux Taphrinomycotina. De plus, nous démontrons que le regroupement conflictuel des Schizosaccharomyces avec les Saccharomycotina, venant des données mitochondriales, est le résultat d'un type d'erreur phylogénétique connu: l'attraction des longues branches (ALB), un artéfact menant au regroupement d'espèces dont le taux d'évolution rapide n'est pas représentatif de leur véritable position dans l'arbre phylogénétique. Dans le Chapitre 4, en utilisant encore un important jeu de données nucléaires, nous démontrons avec support statistique significatif que les nucleariides constituent le groupe lié de plus près aux champignons. Nous confirmons aussi la paraphylie des zygomycètes traditionnels tel que suggéré précédemment, avec support statistique significatif, bien que ne pouvant placer tous les membres du groupe avec confiance. Nos résultats remettent en cause des aspects d'une récente reclassification taxonomique des zygomycètes et de leurs voisins, les chytridiomycètes. Contrer ou minimiser les artéfacts phylogénétiques telle l'attraction des longues branches (ALB) constitue une question récurrente majeure. Dans ce sens, nous avons développé une nouvelle méthode (Chapitre 5) qui identifie et élimine dans une séquence les sites présentant une grande variation du taux d'évolution (sites fortement hétérotaches - sites HH); ces sites sont connus comme contribuant significativement au phénomène d'ALB. Notre méthode est basée sur un test de rapport de vraisemblance (likelihood ratio test, LRT). Deux jeux de données publiés précédemment sont utilisés pour démontrer que le retrait graduel des sites HH chez les espèces à évolution accélérée (sensibles à l'ALB) augmente significativement le support pour la topologie « vraie » attendue, et ce, de façon plus efficace comparée à d'autres méthodes publiées de retrait de sites de séquences. Néanmoins, et de façon générale, la manipulation de données préalable à l'analyse est loin d’être idéale. Les développements futurs devront viser l'intégration de l'identification et la pondération des sites HH au processus d'inférence phylogénétique lui-même.

Functional Analysis of Nuclear beta-Adrenergic Receptors in the Myocardium

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques.

Interpretation of the centromere epigenetic mark to maintain genome stability

Le centromère est la région chromosomique où le kinétochore s'assemble en mitose. Contrairement à certaines caractéristiques géniques, la séquence centromérique n'est ni conservée entre les espèces ni suffisante à la fonction centromérique. Il est donc bien accepté dans la littérature que le centromère est régulé épigénétiquement par une variante de l'histone H3, CENP-A. KNL-2, aussi connu sous le nom de M18BP1, ainsi que ces partenaires Mis18α et Mis18β sont des protéines essentielles pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères. Des évidences expérimentales démontrent que KNL-2, ayant un domaine de liaison à l'ADN nommé Myb, est la protéine la plus en amont pour l'incorporation de CENP-A aux centromères en phase G1. Par contre, sa fonction dans le processus d'incorporation de CENP-A aux centromères n'est pas bien comprise et ces partenaires de liaison ne sont pas tous connus. De nouveaux partenaires de liaison de KNL-2 ont été identifiés par des expériences d'immunoprécipitation suivies d'une analyse en spectrométrie de masse. Un rôle dans l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères a été attribué à MgcRacGAP, une des 60 protéines identifiées par l'essai. MgcRacGAP ainsi que les protéines ECT-2 (GEF) et la petite GTPase Cdc42 ont été démontrées comme étant requises pour la stabilité de CENP-A incorporé aux centromères. Ces différentes observations ont mené à l'identification d'une troisième étape au niveau moléculaire pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé en phase G1, celle de la stabilité de CENP-A nouvellement incorporé aux centromères. Cette étape est importante pour le maintien de l'identité centromérique à chaque division cellulaire. Pour caractériser la fonction de KNL-2 lors de l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères, une technique de microscopie à haute résolution couplée à une quantification d'image a été utilisée. Les résultats générés démontrent que le recrutement de KNL-2 au centromère est rapide, environ 5 minutes après la sortie de la mitose. De plus, la structure du domaine Myb de KNL-2 provenant du nématode C. elegans a été résolue par RMN et celle-ci démontre un motif hélice-tour-hélice, une structure connue pour les domaines de liaison à l'ADN de la famille Myb. De plus, les domaines humain (HsMyb) et C. elegans (CeMyb) Myb lient l'ADN in vitro, mais aucune séquence n'est reconnue spécifiquement par ces domaines. Cependant, il a été possible de démontrer que ces deux domaines lient préférentiellement la chromatine CENP-A-YFP comparativement à la chromatine H2B-GFP par un essai modifié de SIMPull sous le microscope TIRF. Donc, le domaine Myb de KNL-2 est suffisant pour reconnaître de façon spécifique la chromatine centromérique. Finalement, l'élément reconnu par les domaines Myb in vitro a potentiellement été identifié. En effet, il a été démontré que les domaines HsMyb et CeMyb lient l'ADN simple brin in vitro. De plus, les domaines HsMyb et CeMyb ne colocalisent pas avec CENP-A lorsqu'exprimés dans les cellules HeLa, mais plutôt avec les corps nucléaires PML, des structures nucléaires composées d'ARN. Donc, en liant potentiellement les transcrits centromériques, les domaines Myb de KNL-2 pourraient spécifier l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé uniquement aux régions centromériques.