Identification et caractérisation des protéines responsables de l’entrée en phase M chez Lingulodinium polyedrum

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires qui composent une grande partie du phytoplancton et qui jouent un rôle important au niveau de la photosynthèse, de la production primaire et de la conservation des écosystèmes marins. Les dinoflagellés se distinguent des autres eucaryotes par leur biologie et leur organisation nucléaire unique. Lors de la mitose, leur membrane nucléaire demeure intacte et la ségrégation des chromosomes se fait à partir de fuseaux mitotiques formés dans le cytoplasme et qui traversent le noyau au travers de canaux spécialisés Aussi, leurs chromosomes sont condensés en permanence et le processus utilisé pour y arriver est encore très mal compris puisque les dinoflagellés ne possèdent aucunes histones détectables. Lingulodinium polyedrum est un dinoflagellé photosynthétique marin utilisé comme organisme modèle en ce qui concerne l’étude des rythmes circadiens (bioluminescence, migration verticale, mitose et photosynthèse). La découverte et l’étude des éléments régulateurs du cycle cellulaire peuvent nous amener à comprendre le mécanisme, l’influence et la portée du contrôle circadien sur le cycle cellulaire. De plus, l’étude du cycle cellulaire pourrait permettre de révéler des indices quant aux caractéristiques singulières des dinoflagellés qui sont pour le moment énigmatiques. Par le passé, une étude chez Lingulodinium polyedrum a permis d’identifier la cycline impliquée dans la mitose, LpCyc1, le premier régulateur du cycle cellulaire a être découvert chez les dinoflagellés. La présente étude s’attarde sur la caractérisation de la LpCyc1, soit son expression, sa localisation, sa phosphorylation. Ces trois éléments concordent de façon à synchroniser l’activité de la LpCyc1 (et ainsi la mitose) de façon circadienne. Cette étude présente aussi la création et le développement d’un outil majeur pour l’étude future de Lingulodinium polyedrum, le transcriptome des ARNm à partir d’un iv séquençage Illumina. C’est d’ailleurs avec cet outil que nous avons découvert la CDK responsable du contrôle de la phase M, LpCdk1. Cette CDK possède tous les domaines d’une CDK classique, un site de liaison des substrats, un site de liaison à l’ATP, une boucle activatrice, et une interface de liaison avec la cycline. Le transcriptome de Lingulodinium polyedrum a aussi permis de recenser toutes les protéines conservées normalement retrouvées dans le contrôle du cycle cellulaire, qui nous a permis de faire une ébauche préliminaire du cycle cellulaire de L. polyedrum. Cette analyse est une première chez Lingulodinium polyedrum et peut s’étendre pour l’étude d’une multitude d’autres processus métaboliques.

The orphan nuclear receptor, liver receptor homolog-1 (LRH-1, NR5A2) regulates decidualization

La période de réceptivité endométriale chez l’humain coïncide avec la différentiation des cellules stromales de l’endomètre en cellules hautement spécifiques, les cellules déciduales, durant le processus dit de décidualisation. Or, on sait qu’une transformation anormale des cellules endométriales peut être à l’origine de pertes récurrentes de grossesses. LRH-1 est un récepteur nucléaire orphelin et un facteur de transcription régulant de nombreux évènements relatif à la reproduction et comme tout récepteur, son activation promouvoit l’activité transcriptionnelle de ses gènes cibles. Nous avons déjà montré que LRH-1 et son activité sont essentiels pour la décidualisation au niveau de l’utérus chez la souris et nous savons qu’il est présent dans l’utérus chez l’humain au moment de la phase de prolifération mais aussi de sécrétion du cycle menstruel, et que son expression augmente dans des conditions de décidualisation in vitro. Notre hypothèse est alors la suivante : LRH-1 est indispensable à la décidualisation du stroma endométrial, agissant par le biais de la régulation transcriptionnelle de gènes requis pour la transformation de cellules stromales en cellules déciduales. Afin d’explorer le mécanisme moléculaire impliqué dans la régulation transcriptionnelle effectuée par l’intermédiaire de ce récepteur, nous avons mis en place un modèle de décidualisation in vitro utilisant une lignée de cellules stromales de l’endomètre, cellules humaines et immortelles (hESC). Notre modèle de surexpression développé en transfectant les dites cellules avec un plasmide exprimant LRH-1, résulte en l’augmentation, d’un facteur 5, de l’abondance du transcriptome de gènes marqueurs de la décidualisation que sont la prolactine (PRL) et l’insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). En outre, la sous-régulation de ce récepteur par l’intermédiaire de petits ARN interférents (shRNA) abolit la réaction déciduale, d’un point de vue morphologique mais aussi en terme d’expression des deux gènes marqueurs cités ci-dessus. Une analyse par Chromatin ImmunoPrécipitation (ou ChIP) a démontré que LRH-1 se lie à des régions génomiques se trouvant en aval de certains gènes importants pour la décidualisation comme PRL, WNT 4, WNT 5, CDKN1A ou encore IL-24, et dans chacun de ces cas cités, cette capacité de liaison augmente dans le cadre de la décidualisation in vitro. Par ailleurs, des études structurelles ont identifié les phospholipides comme des ligands potentiels pour LRH-1. Nous avons donc choisi d’orienter notre travail de façon à explorer les effets sur les ligands liés à LRH-1 de traitements impliquant des agonistes et antagonistes à notre récepteur nucléaire. Les analyses par q-PCR et Western blot ont montré que la modulation de l’activité de LRH-1 par ses ligands influait aussi sur la réaction déciduale. Enfin, des études récentes de Salker et al (Salker, Teklenburg et al. 2010) ont mis en évidence que les cellules stromales humaines décidualisées sont de véritables biocapteurs de la qualité embryonnaire et qu’elles ont la capacité de migrer en direction de l’embryon. La série d’expériences que nous avons réalisée à l’aide de cellules hESC placées en co-culture avec des embryons de souris confirme que la migration cellulaire est bien dirigée vers les embryons. Cette propriété quant à l’orientation de la migration cellulaire est notoirement diminuée dans le cas où l’expression de LRH-1 est déplétée par shRNA dans les hESC. Nos données prouvent donc que LRH-1 régule non seulement la transcription d’un ensemble de gènes impliqués dans le processus de décidualisation mais agit aussi sur la motilité directionnelle de ces cellules hESC décidualisées in vitro.

Role of Nuclear Angiotensin-II Receptor Mediated Signalling in Cardiovascular Remodelling

Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en réponse à un déséquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolongée ou une modification de l'équilibre hormonal. Le système rénine-angiotensine (SRA) est un système hormonal largement étudié et il est impliqué dans de nombreuses activités associées au remodelage cardiovasculaire. L’existence d'un système circulatoire couplé à un système de tissus locaux est une représentation classique, cependant de nouvelles données suggèrent un SRA indépendant et fonctionnellement actif à l'échelle cellulaire. La compréhension de l'activité intracellulaire du SRA pourrait mener à de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourraient prévenir un remodelage cardiovasculaire défavorable. L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Récemment, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les protéines G et leurs effecteurs ont été détectés sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nucléaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'être acceptés comme une réalité. Nous avons dès lors fait l'hypothèse que la signalisation du SRA délimitant le noyau était impliquée dans le contrôle de l'expression des gènes cardiaques. Nous avons démontré la présence de récepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nucléaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nucléaire purifiée de tissu cardiaque. Des quantités d'Ang II ont été détectées dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donné lieu à des liaisons préférentielles aux sites nucléaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthèse d'ARN de novo dans des noyaux isolés stimulés à l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-κB étaient beaucoup plus importants lorsque les noyaux étaient exposés à de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nucléaires a engendré une mobilisation de Ca2+ via les récepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminué la réponse transcriptionnelle. Les méthodes disponibles actuellement pour l'étude de la signalisation intracrine sont limitées aux méthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thèse était de synthétiser et caractériser des analogues d'Ang-II cellule-perméants afin d’étudier spécifiquement dans les cellules intactes l'activité intracellulaire du SRA. Nous avons synthétisé et caractérisé pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsulée en incorporant un groupement 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifiés du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsulée synthétisés et purifiés: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montré une réduction par un facteur deux ou trois de l'affinité de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison compétitive et une activité réduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augmenté la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isolés elle générait une augmentation de Ca2+ nucléoplasmique et initiait la synthèse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-κB. Les fibroblastes sont les principaux générateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus réactifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons émis l'hypothèse que l’Ang-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nucléaires associés contrôlaient les profils d'expression des gènes des fibroblastes via des systèmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rôle majeur dans le développement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqué que les fibroblastes auriculaires expriment l’AT1R et l’AT2R nucléaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. L’expression d'AT1R nucléaire a été régulés positivement dans les cas d’insuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nucléaire a été glycosylé post-traductionnellement. La machinerie protéique des protéines G, y compris Gαq/11, Gαi/3, et Gβ, a été observée dans des noyaux isolés de fibroblastes. AT1R et AT2R régulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire déclenche la libération de Ca2+ nucléoplasmique, la prolifération, et la synthèse et sécrétion de collagène qui ne sont pas inhibées par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires.