Study of cox1 trans-splicing in Diplonema papillatum mitochondria

Diplonema papillatum est un organisme unicellulaire qui vit dans l’océan. Son génome mitochondrial possède une caractéristique spéciale: tous les gènes sont brisés en de multiples fragments qui s’appellent modules. Chaque module est codé par un chromosome différent. L’expression d’un gène exige des épissages-en-trans qui assemblent un ARN messager complet à partir de tous les modules du gène. Nous avons précédemment montré que le gène cox1 est encodé dans neuf modules avec six Us non encodés entre le module 4 et le module 5 de l’ARN messager mature [1]. Nous n’avons identifié aucune séquence consensus connue de site d’épissage près des modules. Nous spéculons qu’un ARN guide (gRNA) a dirigé l’épissage-en-trans du gène cox1 par un mécanisme qui est semblable à l’édition d’ARN par l’insertion/la suppression des Us chez les kinétoplastides, le groupe sœur des diplonémides. Nous avons trouvé que les six Us sont ajoutés au bout 3’ de l’ARN d’une façon semblable à ceux ajoutés par le TUTase lors de l’édition de l’insertion des Us chez les kinétoplastides. Nous avons construit des profils de gRNA de l’épissage-en-trans avec les expressions régulières basé sur notre connaissance des gRNAs dans l’édition d’ARN chez les kinétoplastides. Selon la complémentarité partielle entre le gRNA et les deux modules adjacents, nous avons généré des amorces pour RT-PCR visant à détecter des séquences qui sont assorties à un des profils de gRNA. Une expérience pilote in vitro n’a pas permis de reconstituer l’épissage-en-trans des modules 3, 4, et 5, suggérant que nous devons améliorer nos techniques.

Analyse génétique moléculaire du gène de la voie non-canonique Frizzled/Dishevelled PRICKLE1 dans les anomalies du tube neural chez l’humain

La voie de la polarité planaire cellulaire (PCP), aussi connue sous le nom de la voie non-canonique du Frizzled/Dishevelled, contrôle le processus morphogénétique de l'extension convergente (CE) qui est essentiel pour la gastrulation et la formation du tube neural pendant l'embryogenèse. La signalisation du PCP a été récemment associée avec des anomalies du tube neural (ATN) dans des modèles animaux et chez l'humain. Prickle1 est une protéine centrale de la voie PCP, exprimée dans la ligne primitive et le mésoderme pendant l'embryogenèse de la souris. La perte ou le gain de fonction de Prickle1 mène à des mouvements de CE fautifs chez le poisson zèbre et la grenouille. PRICKLE1 interagit directement avec deux autres membres de la voie PCP, Dishevelled et Strabismus/Vang. Dans notre étude, nous avons investigué le rôle de PRICKLE1 dans l'étiologie des ATN dans une cohorte de 810 patients par le re-séquençage de son cadre de lecture et des jonctions exon-intron. Le potentiel pathogénique des mutations ainsi identifiées a été évalué par des méthodes bioinformatiques, suivi par une validation fonctionnelle in vivo dans un système poisson zèbre. Nous avons identifié dans notre cohorte un total de 9 nouvelles mutations dont sept: p.Ile69Thr, p.Asn81His, p.Thr275Met, p.Arg682Cys et p.Ser739Phe, p.Val550Met et p.Asp771Asn qui affectent des acides aminés conservés. Ces mutations ont été prédites in silico d’affecter la fonction de la protéine et sont absentes dans une large cohorte de contrôles de même origine ethnique. La co-injection de ces variantes avec le gène prickle1a de type sauvage chez l’embryon de poisson zèbre a démontré qu’une mutation, p.Arg682Cys, modifie dans un sens négatif le phénotype du défaut de la CE produit par pk1 de type sauvage. Notre étude démontre que PK1 peut agir comme facteur prédisposant pour les ATN chez l’humain et élargit encore plus nos connaissances sur le rôle des gènes de la PCP dans la pathogenèse de ces malformations.

Voies de signalisation non-canoniques du récepteur V2 de la vasopressine

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs.

Rôle de la signalisation Wnt non-canonique dans l’étiologie de l’ostéoarthrose chez l’humain

Les études cliniques et in vitro suggèrent que la sclérose de l’os sous-chondral due aux ostéoblastes (Ob) anormaux est impliquée dans la progression de l’ostéoarthrose (OA). Les Ob OA humains isolés à partir d’os sous-chondral sclérosé montrent un phénotype altéré, un niveau réduit de signalisation Wnt/β-caténine canonique et une minéralisation in vitro réduite. Il existe également deux voies non-canoniques, Wnt/PKC et Wnt/PCP qui ont étés décrites dans la littérature. Cependant, il n’existe aucune étude qui traite de ces deux voies dans les Ob OA. Ces voies sont activées après qu’un ligand Wnt non-canonique tel que Wnt-5a se lie à un récepteur Wnt couplé à des corécepteurs de la voie non-canonique. Ceci enclenche, respectivement pour la voie Wnt/PKC-Ca2+ et Wnt/PCP, la phosphorylation de PKC (p-PKC) et la phosphorylation de JNK (p-JNK) et agit sur les cibles en aval. Nous avons voulu déterminer s’il était possible de constater des altérations dans les voies Wnt non-canoniques dans les Ob OA. Nous avons préparé des cultures primaires d’ostéoblastes sous-chondral humains à partir de plateaux tibiaux de patients OA subissant une arthroplastie totale du genou, ainsi qu’à partir de plateaux tibiaux recueillis à l’autopsie de patients « normaux ». L’expression des gènes impliqués dans les voies Wnt/PKC et Wnt/PCP a été évaluée par RT-qPCR et la production par Western Blot des protéines, ainsi que celle de p-PKC et p-JNK et que l’activité des facteurs NFAT et AP-1 utilisés par ces deux voies. L’activité phosphatase alcaline (ALPase) et la quantité d’ostéocalcine (OC) ont étés évaluées respectivement à l’aide d’hydrolyse de substrat et d’ELISA. Le niveau de minéralisation a été évalué par la coloration au rouge Alizarine. Nos résultats montrent que l’expression et la production de Wnt-5a étaient augmentées dans les Ob OA comparées aux Ob N et LGR5 était significativement plus élevée. De plus, l’expression de LGR5 est directement régulée via la stimulation ou la diminution de Wnt-5a, à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines. Par ailleurs, Wnt-5a a stimulé la phosphorylation de JNK et de PKC ainsi que l’activité NFAT et AP-1. Les niveaux de minéralisation ainsi que d’activité ALPase et de sécrétion d’OC ont aussi été affectés par les changements du niveau de Wnt-5a. Ces résultats suggèrent que Wnt-5a, qui est augmentée dans les OA Ob, peut stimuler les voies Wnt non-canoniques et affecter le phénotype et la minéralisation des OA Ob humains.

A new paradigm for the folding of ribonucleic acids

De récentes découvertes montrent le rôle important que joue l’acide ribonucléique (ARN) au sein des cellules, que ce soit le contrôle de l’expression génétique, la régulation de plusieurs processus homéostasiques, en plus de la transcription et la traduction de l’acide désoxyribonucléique (ADN) en protéine. Si l’on veut comprendre comment la cellule fonctionne, nous devons d’abords comprendre ses composantes et comment ils interagissent, et en particulier chez l’ARN. La fonction d’une molécule est tributaire de sa structure tridimensionnelle (3D). Or, déterminer expérimentalement la structure 3D d’un ARN s’avère fort coûteux. Les méthodes courantes de prédiction par ordinateur de la structure d’un ARN ne tiennent compte que des appariements classiques ou canoniques, similaires à ceux de la fameuse structure en double-hélice de l’ADN. Ici, nous avons amélioré la prédiction de structures d’ARN en tenant compte de tous les types possibles d’appariements, dont ceux dits non-canoniques. Cela est rendu possible dans le contexte d’un nouveau paradigme pour le repliement des ARN, basé sur les motifs cycliques de nucléotides ; des blocs de bases pour la construction des ARN. De plus, nous avons dévelopées de nouvelles métriques pour quantifier la précision des méthodes de prédiction des structures 3D des ARN, vue l’introduction récente de plusieurs de ces méthodes. Enfin, nous avons évalué le pouvoir prédictif des nouvelles techniques de sondage de basse résolution des structures d’ARN.

Études génétiques moléculaires du gène de la polarité planaire SCRIBBLE1 chez les anomalies du tube neural

Les anomalies du tube neural (ATN), incluant l'anencéphalie et le spina-bifida, représentent un groupe de malformations congénitales très fréquentes chez l'homme. Ces anomalies sont causées par un défaut partiel ou complet de la fermeture du tube neurale au cours de l'embryogenèse. Les ATN ont une étiologie complexe et multifactorielle impliquant des facteurs environnementaux et génétiques. La voie de signalisation non-canonique du Frizzled (Fz)/Dishevelled (Dvl) contrôle la polarité cellulaire planaire (PCP) et le processus morphogénétique appelé l’extension convergente qui est essentiel pour la gastrulation et la fermeture du tube neural. Très important, des mutations des gènes de cette voie étaient fortement associées aux ATN chez la souris et l’humain. Scribble est un gène de la voie PCP qui cause une sévère ATN chez la souris Circletail. Notre étude vise à analyser le rôle de SCRIBBLE1 dans les ATN humains par des analyses de séquence de son cadre de lecture et ses jonctions exon-introns. Notre étude comporte 396 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Gaslini en Gènes, Italie et 83 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Sainte Justine. Les patients sont affectés par plusieurs formes d’ATN. Nous avons identifié neuf mutations rares et non synonymes chez 10 patients, p.Asp93Ala (c. 435G>A), p.Gly145Arg (c. 278A>C), p.Gly263Ser (c. 786C>A), p.Gly469Ser (c. 1405G>A), p.Pro649His (c. 1946C>A), p.Gln808His (c. 2424G>T), p.Val1066Met (c. 3196G>A), p.Arg1150Gln (c. 3480G>A) et p.Thr1422Met (c. 4266C>T). Cinque mutations, p.Gly263Ser, p.Pro649His, p.Gln808His, p.Arg1150Gln, p.Thr1422Met, étaient absentes dans les contrôles analysés et prédites d’être pathogéniques in silico. Cette étude montre que des mutations rares dans SCRIB1 pourraient augmenter le risque des ATN dans une fraction des patients. L’identification des gènes prédisposant aux ATN nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogéniques impliqués dans ces maladies.

Régulation de la fonction ovarienne par la voie de signalisation des WNTs

Les WNTs sont des glycoprotéines sécrétées impliquées dans plusieurs processus tels que la spécification cellulaire, la prolifération, la différenciation, et beaucoup d’autres. Pour transmettre leur signal, les WNTs se lient aux récepteurs Frizzled (FZD) et au co-récepteur « Low-density-lipoprotein receptor Related Protein » (LRP) 6 ou 5, activant ainsi l’une des trois principales voies de signalisation: la voie de signalisation WNT/β-caténine (voie canonique), la voie « Planar Cell Polarity » (PCP) et la voie WNT/Ca2+ (voies non-canoniques). Des antagonistes de cette voie, les « Secreted Frizzled Related Protein » (SFRPs), peuvent aussi se lier aux WNTs pour empêcher leur liaison aux récepteurs FZDs. Bien que des rôles importants aient été associés à plusieurs composants de la voie des WNTs lors de la régulation de l’ovaire adulte, le fonctionnement exact de cette signalisation reste nébuleux. L’objectif global de cette thèse visait donc à mieux comprendre la voie de signalisation des WNTs au niveau de l’ovaire adulte de souris, par la caractérisation de deux autres composants de cette voie, FZD1 et SFRP4. La création et l’analyse de souris Fzd1 et Sfrp4 KO ont démontré que FZD1 est nécessaire pour la régulation des gènes associés à l’expansion du cumulus, dans le complexe ovocyte-cumulus (COC). Nous avons aussi constaté que SFRP4 avait un rôle à jouer lors de la régulation des gènes associés à l’expansion du cumulus mais cette fois, au niveau des cellules de la granulosa. Finalement, les résultats in vivo et in vitro de cette étude ont suggéré que la voie PCP, contrairement à la voie canonique, pourrait être modulée dans les cellules de la granulosa des souris Sfrp4 KO, possiblement grâce au signal induit par WNT4 et WNT5a. Ces données ont permis de créer un modèle hypothétique représentant la régulation de la signalisation ovarienne par les WNTs. Ce modèle servira de base pour l’élaboration de futurs projets de recherche visant à comprendre davantage la signalisation ovarienne et les possibles effets de sa dérégulation lors de processus pathologiques. Ces connaissances pourront ensuite être appliquées chez l’humain afin de traiter plusieurs maladies ou dérèglements ovariens.

Identification et caractérisation d’une souris mutante Skam26Jus comme un nouveau modèle des anomalies du tube neural

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales très fréquentes chez l’humain en touchant 1-2 nouveau-nés sur 1000 naissances. Elles résultent d’une fermeture incomplète du tube neural lors de l’embryogenèse. L’étiologie des ATN est complexe impliquant des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. La souris représente un outil puissant afin de mieux comprendre la génétique des ATN. Particulièrement, la souris modèle a impliqué fortement la voie de la polarité cellulaire planaire (PCP) dans ces malformations. Dans cette étude, nous avons identifié et caractérisé une nouvelle souris mutante, Skam26Jus dans le but d’identifier un nouveau gène causant les ATN. Skam26Jus a été générée par l’agent mutagène N-Ethyl-N-Nitrosuera. Cette souris est caractérisée par une queue en forme de boucle ou de crochet, soit un phénotype associé aux ATN. La complémentation génétique de la souris Skam26Jus avec une souris mutante d’un gène de la voie PCP Vangl2 (Looptail) a montré une interaction génétique entre le gène muté chez Skam26Jus et Vangl2, suggérant que ces deux gènes fonctionnent dans des voies de signalisation semblables ou parallèles. Un total de 50% des embryons doubles hétérozygotes avec un phénotype de la queue présentent un spina bifida. La cartographie par homozygotie du génome entier suivie par un clonage positionnel a permis d’identifier Lrp6 comme le gène muté chez Skam26Jus. Une mutation homozygote, p.Ile681Arg, a été identifiée dans Lrp6 chez les souris ayant une queue en boucle/crochet. Cette mutation était absente dans 30 souches génétiques pures indiquant que cette mutation est spécifique au phénotype observé. Une étude de phénotype-génotype évalue la pénétrance à 53 % de la mutation Ile681Arg. Lrp6 est connu pour activer la voie canonique Wnt/β-caténine et inhiber la voie non canonique Wnt/PCP. Le séquençage de la région codante et de la jonction exon-intron de LRP6 chez 268 patients a mené à l’identification de quatre nouvelles rares mutations faux sens absentes chez 272 contrôles et de toutes les bases de données publiques. Ces mutations sont p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys ; p.Val1386Ile; p.Tyr1541Cys et leur pathogénicité prédite in silico indiquent que p.Val1386Ile est bénigne, et que p.Tyr306Hiset p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys sont i possiblement dommageables. Les mutations p.Tyr306His, p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys ont affecté l’habilité de LRP6 d’activer la voie Wnt/β-caténine en utilisant le système rapporteur luciférase de pTOPflash. Nos résultats suggèrent que LRP6 joue un rôle dans le développement des ATN chez une petite fraction de patients ayant une ATN. Cette étude présente aussi Skam26Jus comme un nouveau modèle pour étudier les ATN chez l’humain et fournit un outil important pour comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des A TN.

Études génétiques moléculaires des gènes de la polarité planaire cellulaire dans les anomalies du tube neural chez l’Homme

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales parmi les plus fréquentes chez l’humain en touchant 1-2 nouveau-nés par 1000 naissances. Elles résultent d’un défaut de fermeture du tube neural pendant l’embryogenèse. Les formes les plus courantes d'ATN chez l'homme sont l'anencéphalie et le spina-bifida. Leur étiologie est complexe impliquant à la fois des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. Un dérèglement dans la signalisation Wnt, incluant la signalisation canonique Wnt/β-caténine et non-canonique de la polarité planaire cellulaire (PCP), peut causer respectivement le cancer ou les anomalies du tube neural (ATN). Les deux voies semblent s’antagoniser mutuellement. Dans cette étude, nous investiguons les rôles de Lrp6 et deANKRD6, entant qu’interrupteurs moléculaires entre les deux voies de signalisation Wnt, et CELSR1, en tant que membre de la PCP, chez la souris mutante Skax26m1Jus, générée par l’agent mutagène N-Ethyl-N-Nitrosuera, et dans une cohorte de patients humains ATN. Pour Lrp6, nous avons démontré que Skax26m1Jus représente un allèle hypermorphe de Lrp6 avec une augmentation de l’activité de la signalisation Wnt/canonique et une diminution de l’activité JNK induite par la voie PCP. Nous avons également montré que Lrp6Skax26m1Jus interagit génétiquement avec un mutant PCP (Vangl2Lp) où les doubles hétérozygotes ont montré une fréquence élevée d’ATN et des défauts dans la polarité des cellules ciliées de la cochlée. Particulièrement, notre étude démontre l'association des nouvelles et rares mutations faux-sens dans LRP6 avec les ATN humaines. Nous montrons que trois mutations de LRP6 causent une activité canonique réduite et non-canonique élevée. Pour ANKRD6, nous avons identifié quatre nouvelles et rares mutations faux-sens chez 0,8% des patients ATN et deux chez 1,3% des contrôles. Notamment, seulement deux, des six mutations validées (p.Pro548Leu et p.Arg632His) ont démontré un effet significatif sur l’activité de ANKRD6 selon un mode hypomorphique. Pour CELSR1, nous avons identifié une mutation non-sens dans l'exon 1 qui supprime la majeure partie de la protéine et une délétionde 12 pb. Cette perte de nucléotides ne change pas le cadre de lecture et élimine un motif putatif de phosphorylation par la PKC " SSR ". Nous avons également détecté un total de 13 nouveaux et rares variants faux-sens qui avaient été prédits comme étant pathogènes in silico. Nos données confirment le rôle inhibiteur de Lrp6 dans la signalisation PCP pendant la neurulation et indiquent aussi que les mutations faux-sens identifiées chez LRP6 et ANKRD6 pourraient affecter un équilibre réciproque et un antagonisme très sensible à un dosage précis entre les deux voies Wnt. Ces variants peuvent aussi agir comme facteurs prédisposants aux ATN. En outre, nos résultats impliquent aussi CELSR1 comme un facteur de risque pour les anomalies du tube neural ou l’agénésie caudale. Nos résultats fournissent des preuves supplémentaires que la voie de signalisation PCP a un rôle pathogène dans ces malformations congénitales et un outil important pour mieux comprendre leurs mécanismes moléculaires.

Role of the Protein Tyrosine Kinase 7 gene in human neural tube defects

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des anomalies développementales où le tube neural reste ouvert (1-2/1000 naissances). Afin de prévenir cette maladie, une connaissance accrue des processus moléculaires est nécessaire. L’étiologie des ATN est complexe et implique des facteurs génétiques et environnementaux. La supplémentation en acide folique est reconnue pour diminuer les risques de développer une ATN de 50-70% et cette diminution varie en fonction du début de la supplémentation et de l’origine démographique. Les gènes impliqués dans les ATN sont largement inconnus. Les études génétiques sur les ATN chez l’humain se sont concentrées sur les gènes de la voie métabolique des folates du à leur rôle protecteur dans les ATN et les gènes candidats inférés des souris modèles. Ces derniers ont montré une forte association entre la voie non-canonique Wnt/polarité cellulaire planaire (PCP) et les ATN. Le gène Protein Tyrosine Kinase 7 est un membre de cette voie qui cause l’ATN sévère de la craniorachischisis chez les souris mutantes. Ptk7 interagit génétiquement avec Vangl2 (un autre gène de la voie PCP), où les doubles hétérozygotes montrent une spina bifida. Ces données font de PTK7 comme un excellent candidat pour les ATN chez l’humain. Nous avons re-séquencé la région codante et les jonctions intron-exon de ce gène dans une cohorte de 473 patients atteints de plusieurs types d’ATN. Nous avons identifié 6 mutations rares (fréquence allélique <1%) faux-sens présentes chez 1.1% de notre cohorte, dont 3 sont absentes dans les bases de données publiques. Une variante, p.Gly348Ser, a agi comme un allèle hypermorphique lorsqu'elle est surexprimée dans le modèle de poisson zèbre. Nos résultats impliquent la mutation de PTK7 comme un facteur de risque pour les ATN et supporte l'idée d'un rôle pathogène de la signalisation PCP dans ces malformations.

Elucidation of the biological roles of Wnt5a signaling in follicle development

La santé folliculaire est déterminée par un nombre de facteurs endocriniens, paracrines et autocrines. Les gonadotrophines hypophysaires sont les principaux moteurs du développement du follicule, mais leurs actions sont modulées localement par les hormones et des facteurs de croissance. Les glycoprotéines de la famille des WNTs représentent une grande famille de molécules impliquées dans différentes voies de signalisation. Ils sont sécrétés dans le but de moduler et coordonner la réponse des follicules aux gonadotrophines, et leurs activités sont indispensables à la fonction ovarienne et à la fertilité féminine. Les WNTs sont généralement classés en fonction de la (des) voie(s) qu’ils activent. Le rôle des membres de la voie canonique WNT et de ses composants tels que CTNNB1, WNT4, WNT2, FZD1 et FZD4 est bien établi au cours du développement du follicule chez les rongeurs. Un rôle similaire des WNTs dans les espèces mono-ovulatoires demeure essentiellement inconnu. De plus, le rôle des WNT non canoniques dans l'ovaire de rongeurs est méconnu. Les objectifs de cette thèse sont (1) d'élucider la régulation hormonale de l'expression de WNT5A et le rôle physiologique de WNT5A dans les cellules de la granulosa bovine in vitro et (2) d'identifier les rôles physiologiques de WNT5A dans l'ovaire de souris par inactivation génique conditionnelle. Chacun de ces objectifs a mené à la publication d’un article à partir des résultats obtenus au cours de cette thèse. Dans le premier article, le rôle de WNT5A dans les cellules de la granulosa bovine a été étudié in vitro. Nous avons constaté que WNT5A est un régulateur négatif de la stéroïdogenèse stimulée par la FSH issue des cellules de la granulosa, et qu'il agit en supprimant l'activité de signalisation des WNTs canoniques tout en induisant la voie de signalisation MAPK8/JUN. le deuxième article, afin d’examiner le rôle de deux WNTs non-canoniques, WNT5A et WNT11, à différents stades de développement folliculaire, nous avons généré des modèles de souris knock-out conditionnels ciblant les cellules de la granulosa pour chacun de ces WNTs. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence que WNT5A est nécessaire pour assurer la fertilité normale chez la femelle, le développement folliculaire et la stéroïdogenèse ovarienne. Il est aussi un antagoniste de la réponse aux gonadotrophines, agissant par l’intermédiaire de la suppression de la signalisation canonique des WNTs. Chez les souris knock-out pour WNT11, nous ne constatons aucun défaut important dans la fertilité des femelles. L’ensemble de notre travail met en évidence que WNT5A est essentiel pour le développement normal du follicule et qu’il agit pour inhiber la différenciation des cellules de la granulosa. En résumé, nous avons fourni une étude novatrice et approfondie, utilisant plusieurs modèles et techniques pour déterminer les mécanismes par lesquels WNT5A régule le développement des follicules.

Évolution à fine échelle des sites d'épissage des introns dans les gènes des oomycètes

Les introns sont des portions de gènes transcrites dans l’ARN messager, mais retirées pendant l’épissage avant la synthèse des produits du gène. Chez les eucaryotes, on rencontre les introns splicéosomaux, qui sont retirés de l’ARN messager par des splicéosomes. Les introns permettent plusieurs processus importants, tels que l'épissage alternatif, la dégradation des ARNs messagers non-sens, et l'encodage d'ARNs fonctionnels. Leurs rôles nous interrogent sur l'influence de la sélection naturelle sur leur évolution. Nous nous intéressons aux mutations qui peuvent modifier les produits d'un gène en changeant les sites d'épissage des introns. Ces mutations peuvent influencer le fonctionnement d'un organisme, et constituent donc un sujet d'étude intéressant, mais il n'existe actuellement pas de logiciels permettant de les étudier convenablement. Le but de notre projet était donc de concevoir une méthode pour détecter et analyser les changements des sites d'épissage des introns splicéosomaux. Nous avons finalement développé une méthode qui repère les évènements évolutifs qui affectent les introns splicéosomaux dans un jeu d'espèces données. La méthode a été exécutée sur un ensemble d'espèces d'oomycètes. Plusieurs évènements détectés ont changé les sites d’épissage et les protéines, mais de nombreux évènements trouvés ont modifié les introns sans affecter les produits des gènes. Il manque à notre méthode une étape finale d'analyse approfondie des données récoltées. Cependant, la méthode actuelle est facilement reproductible et automatise l'analyse des génomes pour la détection des évènements. Les fichiers produits peuvent ensuite être analysés dans chaque étude pour répondre à des questions spécifiques.

Encapsulation de Dehalococcoides: avantage pour la déhalogénation des solvants chlorés en sites contaminés

Le tétrachloroéthène (PCE) et les éthènes chlorés qui lui sont apparentés ont été abondamment utilisés pour plusieurs applications en industrie dès le début du 20e siècle. Ils sont cependant comptés parmi les polluants les plus communs des sols et de l’eau et beaucoup d’efforts sont déployés afin de les éliminer. Nous croyons que la conversion des éthènes chlorés en éthènes par des microorganismes est une solution prometteuse. Le premier aspect du projet visait donc à établir les conditions pour lesquelles un consortium enrichi en Dehalococcoides ethenogenes permettrait la conversion complète de PCE en éthène. Les expériences réalisées nous ont permis de souligner le rôle de l’acide lactique ajouté aux cultures comme source de carbone et source indirecte d’électrons pour la déhalorespiration. Nous avons également pu établir l’effet de la concentration initiale de biomasse dans les cultures sur le profil de déhalogénation du PCE. Le deuxième aspect du projet visait à développer un protocole d’encapsulation du consortium dans une matrice polymérique afin de profiter des nombreux avantages potentiels de l’encapsulation. Nous avons testé trois montages d’encapsulation différents : atomisation avec jet d’air, atomisation avec vibrations ultrasoniques et « drop-wise ». Le dernier montage prévoyait l’encapsulation des cultures dans des billes d’alginate enrobées de chitosane gélifié par du lignosulfonate. C’est le seul montage qui nous a permis d’encapsuler le consortium de façon efficace sans effet significatifs négatifs sur son activité de déchlorination. Aussi, la comparaison des profils de déhalogénation du PCE de cellules encapsulées et cellules libres a montré une plus faible accumulation de TCE, 1,2-DCE et VC dans les échantillons de cellules encapsulée et, par conséquent, une conversion plus rapide et plus complète du PCE en éthène. Finalement, nous avons observé une tendance favorable à l’idée que les microorganismes encapsulés bénéficient d’un effet de protection contre de faibles concentrations d’oxygène.

La caractérisation chimique de cherts du Bas-Saint-Laurent et de la Gaspésie : vers le développement d’une méthode d’analyse non destructrice

En raison de la grande résolution des photographies des échantillons, celles-ci se trouvent dans un fichier complémentaire, puisque les conditions de forme imposées ne permettaient pas l'affichage intégral de ces images au sein du mémoire.

N-acétyltransférase lysosomale : organisation, fonctionnement et défauts moléculaires chez les patients atteints du syndrome de Sanfilippo type C

L’acétylation des résidus de glucosamine terminaux par la N-acétyltransférase lysosomale (HGSNAT) est une étape essentielle de la dégradation catabolique de l’héparan sulfate. Des défauts dans cette réaction causent une maladie de surcharge lysosomale autosomale récessive rare : le désordre de Sanfilippo type C (SFC). À ce jour, 54 mutations ont été rapportées chez des patients SFC, incluant 13 mutations des sites d’épissage, 11 insertions et délétions, 8 mutations non-sens, 18 mutations faux-sens et 4 polymorphismes, avec différentes manifestations phénotypiques. Nous avons identifié 10 d’entre elles et effectué une étude exhaustive portant sur l’éventail des mutations SFC, leur distribution dans la population de patients, ainsi que leur impact potentiel sur la structure de la HGSNAT. Les erreurs d’épissage, les mutations non-sens, les insertions et les délétions devraient toutes entraîner un ARN non fonctionnel qui est rapidement dégradé par des mécanismes de contrôle qualité cellulaire. Les 4 polymorphismes identifiés sont des changements d'acides aminés qui ne modifient pas l'activité enzymatique, la glycosylation ou la localisation et n'ont donc pas de signification au niveau clinique. Au niveau des enzymes, les polymorphismes sont des changements d’acides aminés qui n’affectent pas la fonction, mais dans un contexte d’acides nucléiques ils peuvent être considérés comme des mutations faux-sens. Les dix-huit mutations faux-sens qui ont été exprimées ont produit des protéines inactives, en raison d'erreurs dans leur repliement. Ceci expliquerait donc la progression sévère de la maladie chez les personnes porteuses de ces mutations. Les protéines mutantes mal repliées sont anormalement glycosylées et conservées dans le réticulum endoplasmique. La thérapie par amélioration de l’activité enzymatique par des chaperonnes est une option thérapeutique potentielle, spécifiquement conçue pour exploiter l'activité enzymatique résiduelle de mutants mal repliés, afin d’éliminer les substrats stockés. Nous avons démontré que le traitement de plusieurs lignées de fibroblastes de patients SFC avec le chlorhydrate de glucosamine, un inhibiteur spécifique de la HGSNAT, a partiellement restauré l’activité de l'enzyme mutante, fournissant une preuve de l’utilité future de la thérapie par des chaperonnes dans le traitement de la maladie de SFC.