Mise au point d'un modèle de leucémie chez la Drosophile

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les oncogènes NUP98-PHF23 et NUP98-HOXD13 confèrent un potentiel aberrant d’auto-renouvellement aux progéniteurs thymiques.

L’initiation de la leucémogénèse dans la leucémie aigue lymphoblastique (LAL)-T résulte de l’activation aberrante de facteurs de transcription de la lignée lymphocytaire T. Nous démontrons que les gènes de fusion NUP98-PHF23 (NP23) et NUP98-HOXD13 (NHD13) reprogramment les thymocytes normaux en cellules souches pré-leucémiques (CS-préL) possédant un potentiel aberrant d’auto-renouvellement. Basé sur des essais de clonalité performés sur des thymocytes transplantés en série, nous avons découvert que cette population est hiérarchisée similairement aux cellules souches hématopoïétiques normales. Ces CS-préL dévoilent un enrichissement du compartiment de précurseurs thymiques immatures KIT+ où les deux oncogènes, NP23 et NHD13, activent des gènes impliqués dans l’autorenouvellement, incluant Hoxa9, Hoxa10, Lyl1 et Hhex. De plus, l’activité d’autorenouvellement est abrogée par les ARN interférents contre Lyl1 et Hhex, indiquant leur implication fonctionnelle en aval de NP23 et NHD13. Puisque ces gènes sont aussi activés en aval de trois autres oncogènes dans la LAL-T, SCL/TAL1, LMO1 et LMO2, nous concluons que les niveaux d’activation de Lyl1 et Hhex fixent le seuil de reprogrammation des thymocytes normaux en CS-préL. Malgré l'efficacité des traitements de chimiothérapie actuels à diminuer la masse tumorale, les CS-préL sont épargnées, pouvant mener à des rechutes. Nos résultats répondent à ce besoin et proposent de nouvelles avenues permettant de cibler les CS-préL du compartiment de thymocytes immatures dans la LAL-T.

La collaboration entre l'oncogène E2A-PBX1 et Hoxa9 lors de l'induction de B-ALL implique l'activation de Flt3

La protéine de fusion E2A-PBX1 induit une leucémie lymphoblastique aigüe des cellules B pédiatrique chez l’humain. E2A-PBX1 possède de puissantes propriétés de trans-activation et peut se lier à l’ADN ainsi qu’aux protéines homéotiques (HOX) via des domaines conservés dans sa portion PBX1, ce qui suggère qu’une dérégulation des gènes cibles de HOX/PBX1 contribue à la leucémogénèse. Précédemment, Bijl et al. (2008) ont démontré que certains gènes Hox collaborent de manière oncogénique avec E2A-PBX1, et que ces interactions sont cellules-spécifiques et varient en fonction du gène Hox impliqué. Une mutagénèse d’insertion provirale suggère et supporte la collaboration des gènes Hoxa et E2A-PBX1 lors de la leucémogénèse des cellules B. La présence de ces interactions dans les cellules B et leur implication dans l’induction des B-ALL est pertinente pour la compréhension de la maladie humaine, et reste encore mal comprise. Notre étude démontre qu’Hoxa9 confère un avantage prolifératif aux cellules B E2A-PBX1. Des expériences de transplantation à l’aide de cellules B E2A-PBX1/Hoxa9 positives isolées de chimères de moelle osseuse démontrent qu’Hoxa9 collabore avec E2A-PBX1 en contribuant à la transformation oncogénique des cellules, et qu’Hoxa9 seul n’induit aucune transformation. Une analyse par Q-RT-PCR nous a permis de démontrer une forte inhibition de gènes spécifiques aux cellules B dans les leucémies co-exprimant Hoxa9 et E2A-PBX1, en plus d’une activation de Flt3, suggérant une inhibition de la différenciation des cellules B accompagnée d’une augmentation de la prolifération. De plus, la surexpression de Hoxa9 dans des cellules leucémiques de souris transgéniques E2A-PBX1, confère aussi un avantage prolifératif aux cellules in vitro, qui semblent être influencé par une augmentation de l’expression de Flt3 et Pdgfδ. En conclusion, nous démontrons pour la première fois à l’aide d’un modèle murin qu’Hoxa9 collabore avec E2A-PBX1 lors de la transformation oncogénique des cellules B et que la signalisation via Flt3 est impliquée, ce qui est potentiellement pertinent pour la maladie humaine.

Les rôles des gènes Hoxa9 et Meis1 dans l'hématopoïèse normale et leucémique

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caractérisation cytogénétique et moléculaire des translocations chromosomiques dans la phase blastique de la leucémie myéloïde chronique

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un modèle d’évolution tumorale dans les cancers humains. Le processus d’évolution de la LMC de la phase chronique (PC) à la phase blastique (PB) est caractérisé par un arrêt de différenciation et l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement incontrôlé d’une cellule souche ou d’un progéniteur hématopoïétique. La LMC en PB est associée à la présence d’anomalies génétiques additionnelles à la fusion BCR-ABL1 qui résulte de la translocation chromosomique t(9;22). Contrairement aux patients en PC, les patients en PB de la LMC n’obtiennent pas une réponse moléculaire complète à long terme avec 1’Imatinib mesylate, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) BCR-ABL1. De plus, les ITKs de deuxième et troisième générations sont moins efficaces en PB de la LMC lorsque les cellules leucémiques ont acquis une résistance au traitement indépendante des mutations de BCR-ABL1. Les mécanismes moléculaires des voies de signalisation impliquées dans la progression de la LMC en PB ne sont pas entièrement élucidés. Le but de notre travail est de caractériser de nouvelles anomalies génétiques dans la PB de la LMC. Nous avons identifié en cytogénétique, quatre nouvelles translocations chromosomiques : t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) et t(2;12)(q31;p13) dans les cellules leucémiques de patients en PB de la LMC résistants au traitement. En utilisant des techniques d'hybridation in situ en fluorescence, de RT-PCR et de séquençage, nous avons délimité les régions à investiguer au niveau des points de cassure et identifié un réarrangement de plusieurs gènes codant pour des facteurs de transcription importants lors de l’hématopoïèse tels que RUNX1, ETV6, PRDM16 et HOXA. L’altération de ces gènes pourrait expliquer l’arrêt de différenciation et/ou l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement caractéristiques de la LMC en PB. Nous avons identifié les fusions RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 et ETV6-HOXD11, respectivement associées aux translocations chromosomiques t(1;21), t(7;17), t(8;17) et t(2;12). Ces fusions génèrent différents transcrits alternatifs qui maintiennent et altèrent le cadre ouvert de lecture. L’analyse des séquences des transcrits chimériques identifiés dans ce projet, incluant RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 et ETV6-HOXD11, nous a permis de prédire les domaines fonctionnels potentiellement présents au niveau des protéines chimériques prédites. Les transcrits de fusion qui respectent le cadre ouvert de lecture peuvent générer des domaines fonctionnels des deux partenaires. C’est le cas des deux transcrits identifiés pour la fusion RUNX1-PRDM16 où le domaine de liaison à l’ADN RHD (Runt homology domain) de RUNX1 est fusionné avec la quasi-totalité des domaines de PRDM16. Les transcrits de fusion qui ne respectent pas le cadre ouvert de lecture donnent des formes tronquées des transcrits RUNX1, MSI2 et ETV6. La juxtaposition des régions promotrices de ces derniers en 5’ de leurs partenaires entraîne l’activation de la forme courte oncogénique de PRDM16 dans la t(1;21) ou de différents gènes HOXA/D dans les t(7;17) et t(2;12), ainsi que l’expression aberrante d’un nouveau transcrit alternatif de SOX17 dans la t(8;17). Notre étude nous a permis d’identifier de nouveaux gènes de fusion et/ou une activation de gènes qui pourraient coopérer avec la fusion BCR-ABL1 dans la progression de la LMC et être impliqués dans la résistance au traitement de la LMC en phase avancée. La caractérisation des événements génétiques associés à la transformation blastique de la LMC est essentielle pour l’investigation des voies moléculaires impliquées dans cette phase de la maladie. Investiguer la résistance au traitement de ces patients pourrait aussi contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans cette leucémie.

Étude de la voie HOX-Flt3 dans les leucémies de type pré-B induites par E2A-Pbx1

Introduction: Notre laboratoire a précédemment établi que Hoxa9 accélérait l’apparition de leucémie de type B induite par E2A-PBX1. Une analyse par qRT-PCR a montré que les niveaux d’ARN de Flt3, une cible de Hoxa9, étaient 32 fois plus élevés dans les leucémies Hoxa9/E2A-PBX1 par rapport que dans les leucémies E2A-PBX1. Il est important de noter que l’expression aberrante de Flt3 est retrouvée dans les leucémies ALL de type B et les AML. De plus, l’activation constitutive de Flt3 est associée à un faible pronostic. Nous avons posé l’hypothèse que la maintenance/ré-initiation des leucémies de type pré-B induites par E2A-Pbx1 est associée à la présence du récepteur Flt3. Méthodes et Résultats: Premièrement, nous avons analysé par FACS la présence de Flt3 et mesuré l’expression de Flt3 par qRT-PCR des cellules E2A-PBX1 leucémiques pré-B. Nous avons montré que les cellules leucémiques E2A-PBX1 expriment l’ARNm du gène Flt3. Cependant, le récepteur n’était détectable à la surface cellulaire que dans des proportions variant de 0.3 à 28%. Deuxièmement, nous avons évalué le potentiel leucémique des fractions positive et négative pour Flt3. Toutes deux ont été capables de ré-initier la leucémie environ 20 jours après transplantation. Des analyses par FACS ont montré qu’une proportion de cellules leucémiques exprimaient Flt3, incluant même celles provenant de la fraction Flt3-. Troisièmement, une stratégie de perte de fonction de Flt3 par shARN a été mise en œuvre afin d’examiner le rôle de la voie de signalisation de Flt3 dans les cellules leucémiques E2A-PBX1. Pour ce faire, des cellules primaires leucémiques ont été infectées, soit par le shARN anti-Flt3 soit shARN contrôle, et transplantées dans des souris receveuses. Les cellules leucémiques contenant le shARN ont été capables de régénérer la leucémie. Cependant, une proportion des cellules exprimaient toujours Flt3, ce qui indique que l’efficacité des shARn n’était pas suffisante. Conclusion et Perspectives: Nos shARN ne sont pas suffisamment efficaces sur les cellules leucémiques choisies. De ce fait, nous proposons d’utiliser des cellules leucémiques moins agressives tout en réalisant le même set-up expérimental. Des transplantations dans des receveurs KO Flt3-/- seraient également requises afin de réellement étudier l’impact de la voie de signalisation Flt3 dans la ré-initiation leucémique.

Étude des mécanismes moléculaires impliquant l'homéoprotéine MEIS1 dans le développement de leucémies myéloïdes aigües

Les leucémies myéloïdes aigües résultent d’un dérèglement du processus de l’hématopoïèse et regroupent des maladies hétérogènes qui présentent des profils cliniques et génétiques variés. La compréhension des processus cellulaires responsables de l’initiation et du maintien de ces cancers permettrait de développer des outils thérapeutiques efficaces et ciblés. Au cours des dernières années, une quantité croissante d’anomalies génétiques reliées au développement de leucémies ont été corrélées à une expression anormale des gènes HOX et de leurs cofacteurs MEIS et PBX. Des modèles expérimentaux murins ont confirmé le rôle direct joué par ces protéines dans le développement de leucémies. En effet, la protéine MEIS1 collabore avec HOXA9 dans la leucémogenèse et requiert pour ce faire trois domaines distincts. Deux de ces domaines sont conservés chez PREP1, un membre de la même classe d’homéoprotéine que MEIS1. En utilisant une approche de gain-de-fonction, j’ai confirmé l’importance du rôle joué par le domaine C-terminal de MEIS1 dans l’accélération des leucémies induites par HOXA9. J’ai également montré que l’activité de ce domaine était corrélée avec une signature transcriptionnelle associée à la prolifération cellulaire. J’ai ensuite réalisé un criblage à haut débit afin d’identifier des antagonistes de l’interaction MEIS-PBX, également essentielle à l’accélération des leucémies HOX. À cette fin, j’ai développé un essai de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) permettant de détecter la dimérisation MEIS-PBX dans les cellules vivantes. Plus de 115 000 composés chimiques ont été testés et suite à une confirmation par un essai orthogonal, une vingtaine de molécules ont été identifiées comme inhibiteurs potentiels. Ces composés pourront être rapidement testés sur la prolifération de cellules leucémiques primaires dans un contexte d’étude préclinique. Finalement, deux approches protéomiques complémentaires ont permis d’identifier des partenaires potentiels de MEIS1 et PREP1. La catégorisation fonctionnelle de ces candidats suggère un nouveau rôle pour ces homéoprotéines dans l’épissage de l’ARN et dans la reconnaissance de l’ADN méthylé.