Effet de l'atorvastatine et de l'amlodipine sur le remodelage vasculaire dans l'hypertension

Résumé Introduction L’amlodipine et l’atorvastatine offrent des avantages thérapeutiques au-delà de leur indication primaire, soit la réduction de la pression artérielle et des lipides sanguins, respectivement. L’amlodipine induit l’apoptose des cellules de muscle lisse vasculaire (CMLV) in vivo, contribuant à la régression de l'hypertrophie aortique chez le rat spontanément hypertendu (SHR). L'atorvastatine induit l’apoptose des CMLV in vitro, un effet proportionnel à la dose. Toutefois, cet effet reste à être démontré in vivo. Nous postulons que l’atorvastatine induira la régression de l’hypertrophie aortique via l’apoptose des CMLV chez le SHR, et que la combinaison de l’amlodipine et de l’atorvastatine aura un effet synergique sur la régression de l’hypertrophie aortique via l’apoptose des CMLV chez le SHR. Méthodologie L’amlodipine et l’atorvastatine ont été administrées à des SHR âgés de 11 semaines durant trois ou six semaines, individuellement ou en combinaison. Les points principaux à l'étude étaient le remodelage vasculaire et la pression artérielle. La fragmentation et le contenu en ADN, le stress oxydant, le taux de cholestérol et les niveaux de nitrates ont aussi été mesurés. Résultats Lorsque l’atorvastatine a été administrée seule, une diminution significative du stress oxydant et de la pression artérielle a été observée après trois et six semaines de traitement, respectivement. Par contre, aucune différence n’a pu être décelée quant au remodelage vasculaire. L'amlodipine a réduit la pression artérielle et l'hypertrophie aortique de façon dépendante de la dose. Une diminution significative de l'hyperplasie a été détectée après trois semaines de traitement avec la combinaison, et après six semaines avec une faible dose d'amlodipine. Conclusion Nos résultats ne supportent pas l'hypothèse que l'atorvastatine induit l'apoptose des CMLV in vivo. Par contre, lorsque combinée à l'amlodipine, elle pourrait ajouter un bénéfice supplémentaire au niveau de la réduction de l'hyperplasie aortique.

Les mécanismes endogènes de modulation de la douleur et leur dysfonction dans le syndrome de l'intestin irritable

La douleur est une expérience subjective multidimensionnelle accompagnée de réponses physiologiques. Ces dernières sont régulées par des processus cérébraux qui jouent un rôle important dans la modulation spinale et cérébrale de la douleur. Cependant, les mécanismes de cette régulation sont encore mal définis et il est essentiel de bien les comprendre pour mieux traiter la douleur. Les quatre études de cette thèse avaient donc comme objectif de préciser les mécanismes endogènes de modulation de la douleur par la contreirritation (inhibition de la douleur par une autre douleur) et d’investiguer la dysfonction de ces mécanismes chez des femmes souffrant du syndrome de l’intestin irritable (Sii). Dans un premier temps, un modèle expérimental a été développé pour mesurer l’activité cérébrale en imagerie par résonance magnétique fonctionnelle concurremment à l’enregistrement du réflexe nociceptif de flexion (RIII : index de nociception spinale) et des réponses de conductance électrodermale (SCR : index d’activation sympathique) évoqués par des stimulations électriques douloureuses. La première étude indique que les différences individuelles d’activité cérébrale évoquée par les stimulations électriques dans les cortex orbitofrontal (OFC) et cingulaire sont associées aux différences individuelles de sensibilité à la douleur, de réactivité motrice (RIII) et de réactivité autonomique (SCR) chez des sujets sains. La deuxième étude montre que l’analgésie par contreirritation produite chez des sujets sains est accompagnée de l’inhibition de l’amygdale par OFC et d’une modulation du réflexe RIII par la substance grise périaqueducale (PAG) et le cortex somesthésique primaire (SI). Dans les troisième et quatrième études, il est montré que la contreirritation ne produit pas d’inhibition significative de la douleur et du réflexe RIII chez les patientes Sii en comparaison aux contrôles. De plus, les résultats indiquent que la sévérité des symptômes psychologiques est associée au déficit de modulation de la douleur et à une hypersensibilité diffuse chez les patientes Sii. Dans l’ensemble, cette thèse précise le rôle de certaines structures cérébrales dans les multiples composantes de la douleur et dans l’analgésie par contreirritation et montre que les patientes Sii présentent une dysfonction des mécanismes spinaux et cérébraux impliqués dans la perception et la modulation de la douleur.

Effet d’une supplémentation en vitamine E alimentaire sur l’inflammation et la douleur chez le chien avec arthrose

La vitamine E (VE) est parfois préconisée pour le traitement de l’arthrose chez le chien, par contre aucune étude n’a documenté cette efficacité. L’objectif de cette étude était de déterminer l’effet d’une forte dose de VE alimentaire sur l’inflammation et la douleur arthrosique chez le chien. Deux groupes de chiens avec arthrose provoquée par section du ligament croisé crânial du membre postérieur droit ; un groupe contrôle (n=8) et un groupe supplémenté avec la VE (n=7), ont été suivis selon un design parallèle, randomisé et en aveugle. La supplémentation a été commencée 1 jour après la chirurgie avec une dose de 400 UI/animal/jour par voie orale pendant 56 jours. Les évaluations objectives (activité électrodermique, EDA) et subjectives (VAS, NRS) de la douleur ont été faites avant la chirurgie J0, à J28 et à J55 après chirurgie. La détermination de la concentration synoviale des marqueurs de l’inflammation (IL-1β, PGE2 et NOx) et l’étude lésionnelle ont été faites après l’euthanasie à J56. Une comparaison unilatérale avec un seuil alpha de 10% a été réalisée. Les concentrations synoviales de PGE2 et de NOx étaient faibles chez le groupe supplémenté en VE par rapport au contrôle (P=0,03 et P<0,0001 respectivement). Les valeurs de VAS, NRS et EDA ont montré une tendance constante à l’amélioration de la douleur dans le groupe traité, avec des résultats significatifs obtenus pour VAS à J55 et pour EDA à J28 (P ajusté = 0,07 dans les deux cas). L’analyse histologique du cartilage articulaire a montré une réduction significative des scores lésionnels dans le groupe traité. C’est la première fois qu’une étude menée chez le chien avec arthrose, a montré qu’une forte dose en VE alimentaire permet de réduire les marqueurs de l’inflammation articulaire, les lésions histologiques cartilagineuses et permet aussi d’améliorer les signes de la douleur associe à l’arthrose.

Modulation de la néovascularisation post-ischémique en présence de facteurs de risque cardiovasculaire

L’athérosclérose est la principale cause d’infarctus du myocarde, de mort subite d’origine cardiaque, d’accidents vasculaires cérébraux et d’ischémie des membres inférieurs. Celle-ci cause près de la moitié des décès dans les pays industrialisés. Lorsque les obstructions artérielles athérosclérotiques sont tellement importantes que les techniques de revascularisation directe ne peuvent être effectuées avec succès, la sévérité de l’ischémie tissulaire résiduelle dépendra de l’habilité de l’organisme à développer spontanément de nouveaux vaisseaux sanguins (néovascularisation). La néovascularisation postnatale est le résultat de deux phénomènes : la formation de nouveaux vaisseaux à partir de la vasculature existante (angiogenèse) et la formation de vaisseaux à partir de cellules souches progénitrices (vasculogenèse). Notre laboratoire a démontré que plusieurs facteurs de risque associés aux maladies cardiovasculaires (tabagisme, vieillissement, hypercholestérolémie) diminuaient également la réponse angiogénique suite à une ischémie. Cependant, les mécanismes précis impliqués dans cette physiopathologie sont encore inconnus. Un point commun à tous ces facteurs de risque cardiovasculaire est l’augmentation du stress oxydant. Ainsi, le présent ouvrage visait à élucider l’influence de différents facteurs de risque cardiovasculaire et du stress oxydant sur la néovascularisation. Nos résultats démontrent que l’exposition à la fumée de cigarette et le vieillissement sont associés à une diminution de la néovascularisation en réponse à l’ischémie, et que ceci est au moins en partie causé par une augmentation du stress oxydant. De plus, nous démontrons que les acides gras dérivés de la diète peuvent affecter la réponse à l’ischémie tissulaire. La première étude du projet de recherche visait à évaluer l’impact de l’exposition à la fumée de cigarette sur la néovascularisation post-ischémique, et l’effet d’une thérapie antioxydante. L’exposition à la fumée de cigarette a été associée à une réduction significative de la récupération du flot sanguin et de la densité des vaisseaux dans les muscles ischémiques. Cependant, une récupération complète de la néovascularisation a été démontrée chez les souris exposées à la fumée de cigarette et traitées au probucol ou aux vitamines antioxydantes. Nous avons démontré qu’une thérapie antioxydante administrée aux souris exposées à la fumée de cigarette était associée à une réduction significative des niveaux de stress oxydant dans le plasma et dans les muscles ischémiques. De plus, les cellules endothéliales progénitrices (EPCs) exposées à de l’extrait de fumée de cigarette in vitro présentent une diminution significative de leur activité angiogénique (migration, adhésion et incorporation dans les tissus ischémiques) qui a été complètement récupérée par le probucol et les vitamines antioxydantes. La deuxième étude avait pour but d’investiguer le rôle potentiel de la NADPH oxydase (Nox2) pour la modulation de la néovascularisation post-ischémique dans le contexte du vieillissement. Nous avons trouvé que l’expression de la Nox2 est augmentée par le vieillissement dans les muscles ischémiques des souris contrôles. Ceci est associé à une réduction significative de la récupération du flot sanguin après l’ischémie chez les vieilles souris contrôles comparées aux jeunes. Nous avons aussi démontré que la densité des capillaires et des artérioles est significativement réduite dans les muscles ischémiques des animaux vieillissants alors que les niveaux de stress oxydant sont augmentés. La déficience en Nox2 réduit les niveaux de stress oxydant dans les tissus ischémiques et améliore la récupération du flot sanguin et la densité vasculaire chez les animaux vieillissants. Nous avons aussi démontré que l’activité fonctionnelle des EPCs (migration et adhésion à des cellules endothéliales matures) est significativement diminuée chez les souris vieillissantes comparée aux jeunes. Cependant, la déficience en Nox2 est associée à une récupération de l’activité fonctionnelle des EPCs chez les animaux vieillissants. Nous avons également démontré une augmentation pathologique du stress oxydant dans les EPCs isolées d’animaux vieillissants. Cette augmentation de stress oxydant dans les EPCs n’est pas présente chez les animaux déficients en Nox2. La troisième étude du projet de recherche a investigué l’effet des acides gras dérivés de la diète sur la néovascularisation postnatale. Pour ce faire, les souris ont reçu une diète comprenant 20% d’huile de maïs (riche en oméga-6) ou 20% d’huile de poisson (riche en oméga-3). Nos résultats démontrent qu’une diète riche en oméga-3 améliore la néovascularisation post-ischémique au niveau macro-vasculaire, micro-vasculaire et clinique comparée à une diète riche en oméga-6. Cette augmentation de la néovascularisation postnatale est associée à une réduction du ratio cholestérol total/cholestérol HDL dans le sérum et à une amélioration de la voie VEGF/NO dans les tissus ischémiques. De plus, une diète riche en acides gras oméga-3 est associée à une augmentation du nombre d’EPCs au niveau central (moelle osseuse) et périphérique (rate). Nous démontrons aussi que l’activité fonctionnelle des EPCs (migration et incorporation dans des tubules de cellules endothéliales matures) est améliorée et que le niveau de stress oxydant dans les EPCs est réduit par la diète riche en oméga-3. En conclusion, nos études ont permis de déterminer l’impact de différents facteurs de risque cardiovasculaire (tabagisme et vieillissement) et des acides gras dérivés de la diète (oméga-3) sur la néovascularisation post-ischémique. Nous avons aussi identifié plusieurs mécanismes qui sont impliqués dans cette physiopathologie. Globalement, nos études devraient contribuer à mieux comprendre l’effet du tabagisme, du vieillissement, des oméga-3, et du stress oxydant sur l’évolution des maladies vasculaires ischémiques.

Le niveau réduit d’AMPc dans la surexpression des protéines G(alpha)i et la prolifération accrue des cellules du muscle lisse vasculaire des rats spontanément hypertendus

Nous avons précédemment montré que les cellules musculaires lisses vasculaires(CMLV) des rats spontanément hypertendus (SHR) présentent une expression augmentée des protéines G inhibitrices (Gi) et une prolifération cellulaire accrue par rapport aux CMLV des rats Wystar-Kyoto (WKY). Le niveau d'AMPc s’est également avéré plus faible dans les CMLV de SHR. La présente étude a donc été entreprise afin d'examiner la contribution de la diminution du niveau intracellulaire d'AMPc à l’augmentation de l'expression des protéines Gi et à la prolifération accrue des CMLV de SHR et de continuer à explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents responsables de cette réponse. Les CMLV de SHR ont montré par rapport aux CMLV des WKY une expression accrue de Giα-2 et Giα-3 qui a été diminué d'une manière dépendante de concentration par le dbcAMP, un analogue d'AMPc perméable à la membrane cellulaire. En outre, les fonctions augmentées des protéines Gi comme démontrées par l'amplification de l’inhibition de l'adénylate cyclase par les hormones inhibitrices et l'activité forskoline (FSK)-stimulée de l’adénylate cyclase par une faible concentration de GTPγS dans les CMLV de SHR ont également été restaurées aux niveaux de WKY par le dbcAMP. La prolifération accrue des CMLV de SHR a également été atténuée par le dbcAMP et la forskoline, un activateur de l'adénylate cyclase. De plus, dbcAMP a restauré la production augmentée d'anion superoxyde (O2-), l'activité de la NAD(P)H oxydase et l’expression accrue des protéines Nox 4 et p47phox observée dans les CMLV de SHR jusqu’au niveau contrôle. Par ailleurs, la phosphorylation accrue des PDGF-R, EGF-R, c-Src et ERK1/2 énoncée par les CMLV de SHR a également été diminuée par le dbcAMP d'une manière dépendante de concentration. Ces résultats suggèrent que le niveau réduit d'AMPc intracellulaire montré par les CMLV de SHR contribue à l'expression accrue des protéines Gi et à l’hyperprolifération cellulaire à travers l’augmentation du stress oxydatif, la transactivation des EGF-R, PDGF-R et la voie de signalisation des MAP kinases.

Systemic and regional hemodynamics in pigs with acute liver failure and the effect of albumin dialysis.

OBJECTIVE: Acute liver failure (ALF) is haemodynamically characterized by a hyperdynamic circulation. The aims of this study were to investigate the systemic and regional haemodynamics in ALF, to measure changes in nitric oxide metabolites (NOx) and to evaluate whether these haemodynamic disturbances could be attenuated with albumin dialysis. MATERIAL AND METHODS: Norwegian Landrace pigs (23-30 kg) were randomly allocated to groups as controls (sham-operation, n = 8), ALF (hepatic devascularization, n = 8) and ALF + albumin dialysis (n = 8). Albumin dialysis was started 2 h after ALF induction and continued for 4 h. Systemic and regional haemodynamics were monitored. Creatinine clearance, nitrite/nitrate and catecholamines were measured. A repeated measures ANOVA was used to analyse the data. RESULTS: In the ALF group, the cardiac index increased (PGT < 0.0001), while mean arterial pressure (PG = 0.02) and systemic vascular resistance decreased (PGT < 0.0001). Renal resistance (PG = 0.04) and hind-leg resistance (PGT = 0.003) decreased in ALF. There was no difference in jejunal blood flow between the groups. ALF pigs developed renal dysfunction with increased serum creatinine (PGT = 0.002) and decreased creatinine clearance (P = 0.02). Catecholamines were significantly higher in ALF, but NOx levels were not different. Albumin dialysis did not attenuate these haemodynamic or renal disturbances. CONCLUSIONS: The haemodynamic disturbances during the early phase of ALF are characterized by progressive systemic vasodilatation with no associated changes in metabolites of NO. Renal vascular resistance decreased and renal dysfunction developed independently of changes in renal blood flow. After 4 h of albumin dialysis there was no attenuation of the haemodynamic or renal disturbances.

Role of NOX2 and DUOX2 in the antiviral airway responses

Les voies respiratoires sont exposées à une panoplie de pathogènes. Lors d’une infection virale respiratoire les cellules qui recouvrent ces voies participent activement à la défense immunitaire contre ces derniers en limitant la propagation du virus et en engendrant une réponse proinflammatoire. Un évènement clef dans ces processus est l’activation des facteurs de transcription, notamment le « Nuclear Factor » (NF)-κB et l’« Interferon Regulatory Factor -3 » (IRF-3), qui régulent l’expression des cytokines antivirales et proinflammatoires. Des données récentes démontrent que les dérivés actifs de l’oxygène (ROS), produits suite à une infection virale, ont la capacité de réguler les voies de signalisation enclenchées par NF-κB et IRF-3. Une source importante de ROS est la famille de NADPH oxydases (NOX), qui contient les membres NOX1-5 et DUOX1 et 2. L’objectif de notre étude était d’identifier la NOX qui régule les mécanismes antiviraux et proinflammatoires suite à l’infection avec le virus respiratoire syncytial (RSV), qui cause des complications respiratoires majeures, et le virus Sendai (SeV), un modèle viral non-pathogène. Nos travaux ont permis d’identifier que NOX2 est une molécule clef dans la réponse proinflammatoire suite à l’infection virale. Plus spécifiquement, NOX2 est important pour l’activation de NF-κB et la sécrétion des cytokines régulées par ce dernier. De plus, nous avons observé une forte augmentation de la présence de DUOX2 dans les cellules de voies respiratoires humaines infectées par SeV. Une étude plus approfondie nous a permis de caractériser qu’une synergie entre deux cytokines secrétées lors de l’infection, soit l’interféron (IFN)β et le TNFα est responsable de l’induction de DUOX2. Nous avons aussi découvert que DUOX2 confère une activité antivirale et est nécessaire pour maintenir les taux des cytokines antivirales tardives IFNβ et IFNλ. Lors d’une infection avec RSV, l’induction de DUOX2 n’est pas détectable. Nous avons mis en évidence que RSV interfère avec l’expression de DUOX2 ce qui pourrait suggérer sa pathogénicité. En conclusion, nos travaux démontrent pour la première fois une implication spécifique des NADPH oxydase NOX2 et DUOX suite aux infections virales respiratoires.

Sélection de gènes de référence pour la normalisation des expériences de PCR quantitative dans un modèle de dysfonction diastolique de lapin

La dysfonction diastolique du ventricule gauche (DDVG) réfère à une rigidité ainsi qu’à des troubles de relaxation au niveau de ce ventricule pendant la phase de la diastole. Nos connaissances sur les mécanismes moléculaires sous-jacents de cette pathologie demeurent limités. Les analyses géniques sont indispensables afin de bien identifier les voies par lesquelles cette maladie progresse. Plusieurs techniques de quantification de l’expression génique sont disponibles, par contre la RT-qPCR demeure la méthode la plus populaire vu sa haute sensibilité et de ses coûts modérés. Puisque la normalisation occupe un aspect très important dans les expériences de RT-qPCR, nous avons décidé de sélectionner des gènes montrant une haute stabilité d’expression dans un modèle de DDVG de lapin. Nous avons alors exposé 18 lapins blancs soit à une diète normale (n=7) ou bien à une diète hypercholestérolémiante additionnée de vitamine D2 (n=11). La DDVG a été évaluée par des mesures échocardiographiques. L’expression de l’ARNm de dix gènes communément utilisés dans la littérature comme normalisateur (Gapdh, Hprt1, Ppia, Sdha, Rpl5, Actb, Eef1e1, Ywhaz, Pgk1, et G6pd) a été mesurée par RT-qPCR. L’évaluation de leur stabilité a été vérifiée par les algorithmes de geNorm et Normfinder. Sdha et Gapdh ont obtenu les meilleurs scores de stabilité (M<0.2) et ont été suggérés par le geNorm, comme meilleure combinaison. Par contre, l’utilisation de Normfinder mène à la sélection d’Hprt1 et Rpl5 comme meilleure combinaison de gènes de normalisation (0.042). En normalisant par ces deux combinaisons de gènes, l’expression de l’ARNm des peptides natriurétiques de type A et B (Anp et Bnp), de la protéine chimiotactique des monocytes-1 (Mcp-1) et de la sous unité Nox-2 de la NADPH oxydase ont montré des augmentations similaires chez le groupe hypercholestérolémique comparé au groupe contrôle (p<0.05). Cette augmentation d’expressions a été corrélée avec plusieurs paramètres échocardiographiques de DDVG. À notre connaissance, c’est la première étude par laquelle une sélection de gènes de référence a été réalisée dans un modèle de lapin développant une DDVG.

Selective inhibition of inducible nitric oxide synthase prevents lipid peroxidation in cartilage from patients with osteoarthritis.

INTRODUCTION: Emerging evidence indicates that nitric oxide (NO), which is increased in osteoarthritic (OA) cartilage, plays a role in 4-hydroxynonenal (HNE) generation through peroxynitrite formation. HNE is considered as the most reactive product of lipid peroxidation (LPO). We have previously reported that HNE levels in synovial fluids are more elevated in knees of OA patients compared to healthy individuals. We also demonstrated that HNE induces a panoply of inflammatory and catabolic mediators known for their implication in OA cartilage degradation. The aim of the present study was to investigate the ability of inducible NO synthase (iNOS) inhibitor, L-NIL (L-N6-(L-Iminoethyl)Lysine), to prevent HNE generation through NO inhibition in human OA chondrocytes. METHOD: Cells and cartilage explants were treated with or without either an NO generator (SIN or interleukin 1beta (IL-1β)) or HNE in absence or presence of L-NIL. Protein expression of both iNOS and free-radical-generating NOX subunit p47 (phox) were investigated by western blot. iNOS mRNA detection was measured by real-time RT-PCR. HNE production was analysed by ELISA, Western blot and immunohistochemistry. S-nitrosylated proteins were evaluated by Western Blot. Prostaglandin E2 (PGE2) and metalloproteinase 13 (MMP-13) levels as well as glutathione S-transferase (GST) activity were each assessed with commercial kits. NO release was determined using improved Griess method. Reactive oxygen species (ROS) generation was revealed using fluorescent microscopy with the use of commercial kits. RESULTS: L-NIL prevented IL-1β-induced NO release, iNOS expression at protein and mRNA levels, S-nitrosylated proteins and HNE in a dose dependent manner after 24h of incubation. Interestingly, we revealed that L-NIL abolished IL-1β-induced NOX component p47phox as well as ROS release. The HNE-induced PGE2 release and both cyclooxygenase-2 (COX-2) and MMP-13 expression were significantly reduced by L-NIL addition. Furthermore, L-NIL blocked the IL-1β induced inactivation of GST, an HNE-metabolizing enzyme. Also, L-NIL prevented HNE induced cell death at cytotoxic levels. CONCLUSION: Altogether, our findings support a beneficial effect of L-NIL in OA by preventing LPO process in NO-dependent and/or independent mechanisms.