Interactions protéiques et relation dynamique entre phosphorylation / sumoylation / ubiquitination des protéines TIF1α, β et PML: détection in vivo par BRET

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation.

POCN-type Pincer Complexes of NiII and NiIII : synthesis, reactivities, catalytic activities and physical properties

Cette thèse décrit la synthèse, la caractérisation, les réactivités, et les propriétés physiques de complexes divalents et trivalents de Ni formés à partir de nouveaux ligands «pincer» de type POCN. Les ligands POCN de type amine sont préparés d’une façon simple et efficace via l’amination réductrice de 3-hydroxybenzaldéhyde avec NaBH4 et plusieurs amines, suivie par la phosphination de l’amino alcool résultant pour installer la fonction phosphinite (OPR2); le ligand POCN de type imine 1,3-(i-Pr)2PC6H4C(H)=N(CH2Ph) est préparé de façon similaire en faisant usage de PhCH2NH2 en l’absence de NaBH4. La réaction de ces ligands «pincer» de type POCN avec NiBr2(CH3CN)x en présence d’une base résulte en un bon rendement de la cyclométalation du lien C-H situé en ortho aux fonctions amine et phosphinite. Il fut découvert que la base est essentielle pour la propreté et le haut rendement de la formation des complexes «pincer» désirés. Nous avons préparé des complexes «pincer» plan- carrés de type POCN, (POCNRR΄)NiBr, possédant des fonctions amines secondaires et tertiaires qui démontrent des réactivités différentes selon les substituants R et R΄. Par exemple, les complexes possédant des fonctions amines tertiaires ArCH2NR2 (NR2= NMe2, NEt2, and morpholinyl) démontrent des propriétés rédox intéressantes et pourraient être convertis en leurs analogues trivalents (POCNR2)NiBr2 lorsque réagis avec Br2 ou N-bromosuccinimide (NBS). Les complexes trivalents paramagnétiques à 17 électrons adoptent une géométrie de type plan-carré déformée, les atomes de Br occupant les positions axiale et équatoriale. Les analyses «DSC» et «TGA» des ces composés ont démontré qu’ils sont thermiquement stables jusqu’à ~170 °C; tandis que la spectroscopie d’absorption en solution a démontré qu’ils se décomposent thermiquement à beaucoup plus basse température pour regénérer les complexes divalents ne possédant qu’un seul Br; l’encombrement stérique des substitutants amines accélère cette route de décomposition de façon significative. Les analogues NMe2 et N(morpholinyl) de ces espèces de NiIII sont actifs pour catalyser la réaction d’addition de Kharasch, de CX4 à des oléfines telles que le styrène, tandis qu’il fut découvert que l’analogue le moins thermiquement stable (POCNEt2)Ni est complètement inerte pour catalyser cette réaction. Les complexes (POCNRH)NiBr possédant des fonctions amines secondaires permettent l’accès à des fonctions amines substituées de façon non symétrique via leur réaction avec des halogénures d’alkyle. Un autre avantage important de ces complexes réside dans la possibilité de déprotonation pour préparer des complexes POCN de type amide. De telles tentatives pour déprotoner les fonctions NRH nous ont permis de préparer des espèces dimériques possédant des ligands amides pontants. La nature dimérique des ces complexes [P,C,N,N-(2,6-(i-Pr)2PC6H3CH2NR)Ni]2 (R= PhCH2 et Ph) fut établie par des études de diffraction des rayons-X qui ont démontré différentes géométries pour les cœurs Ni2N2 selon le substituant N : l’analogue (PhCH2)N possède une orientation syn des substitutants benzyles et un arrangement ressemblant à celui du cyclobutane du Ni et des atomes d’azote, tandis que l’analogue PhN adopte un arrangement de type diamant quasi-planaire des atomes du Ni et des atomes d’azote et une orientation anti des substituants phényles. Les espèces dimériques ne se dissocient pas en présence d’alcools, mais elles promouvoient l’alcoolyse catalytique de l’acrylonitrile. De façon intéressante, les rendements de ces réactions sont plus élevés avec les alcools possédant des fonctions O-H plus acides, avec un nombre de «turnover» catalytique pouvant atteindre 2000 dans le cas de m-cresol. Nous croyons que ces réactions d’alcoolyse procèdent par activation hétérolytique de l’alcool par l’espèce dimérique via des liaisons hydrogènes avec une ou deux des fonctions amides du dimère. Les espèces dimériques de Ni (II) s’oxydent facilement électrochimiquement et par reaction avec NBS ou Br2. De façon surprenante, l’oxydation chimique mène à l’isolation de nouveaux produits monomériques dans lesquels le centre métallique et le ligand sont oxydés. Le mécanisme d’oxydation fut aussi investigué par RMN, «UV-vis-NIR», «DFT» et spectroélectrochimie.

Étude de facteurs génétiques prédictifs dans le neuroblastome, en particulier les anomalies du chromosmoe 14q

Le neuroblastome (NB) représente 8% de tous les cancers pédiatriques et est caractérisé par sa grande hétérogénéité clinique. Afin d’évaluer son pronostic, plusieurs facteurs génétiques sont utilisés : amplification de MYCN, délétion 1p, gain 11q et gain 17q. Les buts de notre travail étaient d’abord de vérifier si l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) permet une analyse complète de ces anomalies et ensuite, en utilisant une analyse globale du génome telle le polymorphisme nucléotidique simple (SNP), de vérifier la concordance avec les résultats de la FISH et le pronostic potentiel des anomalies du 14q, en particulier du gène AKT. Nous avons donc établi un panel de sondes pour la FISH qui a été appliqué sur 16 tumeurs non-fixées. Après isolation de l’ADN de 36 tumeurs, nous avons effectué une analyse génotypique par SNP utilisant les puces « Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 » contenant 945,826 sondes non polymorphiques et 906,000 sondes polymorphiques. Nos résultats ont démontré que la FISH permet l’évaluation complète des anomalies génétiques importantes du NB et que les anomalies déséquilibrées sont détectées très précisément par SNP. Les anomalies du 14q tendent à être associées avec des facteurs cliniques comme le grade et l’évolution, contrairement aux anomalies d’AKT. L’analyse du 14q a révélé trois gènes d’intérêt, MAX, BCL11B et GPHN, qui devraient être analysés sur un plus grand échantillon. Ainsi, l’étude par FISH semble adaptée pour détecter les anomalies génétiques classiques du NB, alors que celles retrouvées en 14q représentent de potentielles cibles thérapeutiques pour cette tumeur.

Monocouches peptidiques auto-assemblées et applications dans le domaine des biocapteurs de résonance de plasmon de surfaces

Ces travaux visent à étendre les applications de la résonance de plasmons de surface (SPR) L’objectif est d’offrir des outils diagnostics plus rapides, efficaces et simple d’utilisation pour diagnostiquer ou effectuer le suivi de conditions cliniques. Pour se faire, un nouveau type d’instrumentation SPR basé sur l’utilisation d’un prisme d’inversion (dove) a permis d’atteindre une limite de détection (LOD) de 10-6 unité d’indice de réfraction (RIU), une valeur comparable aux instruments commerciaux complexes tout en demeurant peu dispendieux, robuste et simple d’utilisation. Les travaux présentés dans cet ouvrage visent, dans un second temps, à réduire les interactions nonspécifiques (NSB) entre la surface des biocapteurs SPR et les composants de la matrice biologique complexe telles que: l’urine, le lysat cellulaire, le sérum et le sang. Ces dernières induisent des réponses empêchant l’utilisation de biocapteurs SPR en milieux complexes. Les acides aminés (AA) offrent une grande variété de propriétés physico-chimiques permettant la mise au point de monocouches auto-assemblées (SAM) aux propriétés diverses. Initialement, 19 des 20 acides aminés naturels ont été attachés à l’acide 3-mercaptopropionique (3-MPA) formant des SAMs peptidomimétiques. La quantité d’interactions nonspécifiques engendrées par ces différentes surfaces a été mesurée en exposant ces surfaces au sérum sanguin bovin complet variant de 400 ng/cm² jusqu’à 800 ng/cm². La détection à l’aide de ces surfaces de la β-lactamase (une enzyme responsable de la résistance aux antibiotiques au niveau μM) a démontré la possibilité d’employer ces surfaces pour bâtir des biocapteurs SPR. Des peptides de longueur allant de 2 à 5 résidus attachés à 3-MPA ont été synthétisés sur support solide. Cette étude a démontré que l’augmentation de la longueur des peptides formés d’AA résistants aux NBS accroit leur résistance jusqu’à 5 résidus. Le composé le plus performant de ce type (3-MPA-(Ser)5-OH) a permis d’atteindre 180 ng/cm². Cette valeur est similaire à celle des meilleures surfaces disponibles commercialement, notamment les surfaces de polyethylène glycol (PEG) à 100 ng/cm². Des surfaces de 3-MPA-(Ser)5-OH ont permis l’étalonnage de la β-lactamase et sa quantification directe dans un lysat cellulaire. La LOD pour ces biocapteurs est de 10 nM. Une troisième génération de surfaces peptidiques binaires a permis la réduction de la NSB jusqu’à un niveau de 23±10 ng/cm² une valeur comparable aux meilleures surfaces disponibles. Ces surfaces ont permis l’étalonnage d’un indicateur potentiel du cancer la metalloprotéinase-3 de matrice (MMP-3). Les surfaces formées de peptides binaires (3-MPA-H3D2-OH) ont permis la quantification directe de la MMP-3 dans le sérum sanguin complet. Une quatrième génération de surfaces peptidiques a permis de réduire davantage le niveau de NSB jusqu’à une valeur de 12 ± 11 ng/cm². Ces surfaces ont été modifiées en y attachant une terminaison de type acide nitriloacétique (NTA) afin d’y attacher des biomolécules marquées par six résidus histidines terminaux. Ces surfaces ont permis le développement d’une méthode rapide de balayage des ligands ciblant le « cluster of differenciation-36 » (CD36). L’étude d’électroformation des monocouches de peptide a permis de déterminer les conditions de formation optimales d’une couche de 3-MPA-HHHDD-OH permettant ainsi la formation de monocouches résistantes au NSB en moins de 6 minutes en appliquant un potentiel de formation de 200mV vs Ag/AgCl.

Elaboration d'une boîte à outils pour les archives audiovisuelles

Travail réalisé à l'EBSI, Université de Montréal, sous la direction de M. Yvon Lemay dans le cadre du cours SCI6111 - Politique de gestion des archives, à l'automne 2012.

Boîte à outils destinée aux chercheurs de documents iconographiques

Travail réalisé à l'EBSI, Université de Montréal, sous la direction de M. Yvon Lemay dans le cadre du cours SCI6111 - Politique de gestion des archives, à l'automne 2013.

Structure de fonctionnement des charrettes en design urbain

Ce document s’inscrit dans la foulée des préoccupations mondiales sur le devenir des villes au XXIe siècle. Il questionne les façons de faire qui contribuent à un développement de qualité des cadres de vie des citoyens. Les processus d’idéation de type atelier et charrette sont retenus en regard de leurs valeurs mobilisatrices et consensuelles qui répondent aux principes du développement durable. La problématique posée concerne l’adaptation de leur structure de fonctionnement au contexte local dans lequel il s’applique et de leur performance à induire les résultats escomptés. Une analyse comparative de trois études de cas révèle que le processus d’idéation se singularise en fonction des modalités de communication nécessaires pour progresser dans la démarche de planification des projets et conjointement à ceci, confirme que leur performance réside en leur capacité de rassembler l’ensemble des acteurs du projet en un même lieu. À l’issue de notre étude, nous fournissons un procédurier préliminaire pour diriger la mise en œuvre de processus d’idéation localement.

Développement des marqueurs moléculaires spécifiques pour l'identification et la quantification de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires en utilisant la PCR en temps réel

Les champignons mycorhizien à arbuscules (CMA) sont des organismes pouvant établir des symbioses avec 80% des plantes terrestres. Les avantages d'une telle symbiose sont de plus en plus caractérisés et exploités en agriculture. Par contre, jusqu'à maintenant, il n'existe aucun outil permettant à la fois l'identification et la quantification de ces champignons dans le sol de façon fiable et rapide. Un tel outil permettrait, entre autres, de mieux comprendre les dynamiques des populations des endomycorhizes dans le sol. Pour les producteurs d'inoculum mycorhiziens, cela permettrait également d'établir un suivi de leurs produits en champs et d'avoir un contrôle de qualité de plus sur leurs inoculants. C'est ce que nous avons tenté de développer au sein du laboratoire du Dr. Hijri. Depuis environ une trentaine d'années, des outils d'identification et/ou de quantification ont été développés en utilisant les profiles d'acides gras, les isozymes, les anticorps et finalement l'ADN nucléaire. À ce jour, ces méthodes d’identification et de quantification sont soit coûteuses, soit imprécises. Qui plus est, aucune méthode ne permet à la fois la quantification et l’identification de souches particulières de CMA. L’ADN mitochondrial ne présente pas le même polymorphisme de séquence que celui qui rend l’ADN nucléaire impropre à la quantification. C'est pourquoi nous avons analysé les séquences d’ADN mitochondrial et sélectionné les régions caractéristiques de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA). C’est à partir de ces régions que nous avons développé des marqueurs moléculaires sous forme de sondes et d’amorces TaqMan permettant de quantifier le nombre de mitochondries de chacune de ces espèces dans un échantillon d’ADN. Nous avons ensuite tenté de déterminer une unité de quantification des CMA, soit un nombre de mitochondries par spore. C’est alors que nous avons réalisé que la méthode de préparation des échantillons de spores ainsi que la méthode d’extraction d’ADN avaient des effets significatifs sur l’unité de quantification de base. Nous avons donc optimisé ces protocoles, avant d’en e tester l’application sur des échantillons de sol et de racines ayant été inoculés avec chacune des deux espèces cibles. À ce stade, cet outil est toujours semi-quantificatif, mais il permet 9 l’identification précise de deux espèces de CMA compétentes dans des milieux saturés en phosphore inorganique. Ces résultats , en plus d’être prometteurs, ont permis d’augmenter les connaissances méthodologiques reliées à la quantification des CMA dans le sol, et suggèrent qu’à cause de leurs morphologies différentes, l’élaboration d’un protocole de quantification standardisé pour toutes les espèces de CMA demeure un objectif complexe, qui demande de nouvelles études in vivo.

An adaptive neighborhood search algorithm for optimizing stochastic mining complexes

Les métaheuristiques sont très utilisées dans le domaine de l'optimisation discrète. Elles permettent d’obtenir une solution de bonne qualité en un temps raisonnable, pour des problèmes qui sont de grande taille, complexes, et difficiles à résoudre. Souvent, les métaheuristiques ont beaucoup de paramètres que l’utilisateur doit ajuster manuellement pour un problème donné. L'objectif d'une métaheuristique adaptative est de permettre l'ajustement automatique de certains paramètres par la méthode, en se basant sur l’instance à résoudre. La métaheuristique adaptative, en utilisant les connaissances préalables dans la compréhension du problème, des notions de l'apprentissage machine et des domaines associés, crée une méthode plus générale et automatique pour résoudre des problèmes. L’optimisation globale des complexes miniers vise à établir les mouvements des matériaux dans les mines et les flux de traitement afin de maximiser la valeur économique du système. Souvent, en raison du grand nombre de variables entières dans le modèle, de la présence de contraintes complexes et de contraintes non-linéaires, il devient prohibitif de résoudre ces modèles en utilisant les optimiseurs disponibles dans l’industrie. Par conséquent, les métaheuristiques sont souvent utilisées pour l’optimisation de complexes miniers. Ce mémoire améliore un procédé de recuit simulé développé par Goodfellow & Dimitrakopoulos (2016) pour l’optimisation stochastique des complexes miniers stochastiques. La méthode développée par les auteurs nécessite beaucoup de paramètres pour fonctionner. Un de ceux-ci est de savoir comment la méthode de recuit simulé cherche dans le voisinage local de solutions. Ce mémoire implémente une méthode adaptative de recherche dans le voisinage pour améliorer la qualité d'une solution. Les résultats numériques montrent une augmentation jusqu'à 10% de la valeur de la fonction économique.