42 resultados para NA TRANSPORTERS
em Université de Montréal, Canada
Resumo:
Lexcitotoxicit est un mcanisme physiopathologique majeur impliqu dans la pathogense de la dficience en thiamine (DT). Dans les rgions crbrales vulnrables la DT, on observe une mort cellulaire induite par excitotoxicit dont lorigine semble tre la consquence dune perturbation du mtabolisme nergtique mitochondrial, dune dpolarisation membranaire soutenue et dune diminution de labsorption du glutamate par les astrocytes suite la diminution de lexpression des transporteurs EAAT1 et EAAT2. Il est clairement tabli que le glutamate joue un rle central dans lexcitotoxicit lors de la DT. Ainsi, la mise en vidence des mcanismes impliqus dans la diminution de lexpression des transporteurs du glutamate est essentielle la comprhension de la physiopathologie de la DT. Lobjectif de cette thse consiste en ltude de la rgulation des transporteurs astrocytaires du glutamate et la mise au point de stratgies thrapeutiques ciblant la pathogense de lexcitotoxicit lors de lencphalopathie conscutive la DT. Les principaux rsultats de cette thse dmontrent des perturbations des transporteurs du glutamate la fois dans des modles animaux de DT et dans des astrocytes en culture soumis une DT. La DT se caractrise par la perte du variant dpissage GLT-1b codant pour un transporteur du glutamate dans le thalamus et le colliculus infrieur, les rgions crbrales affectes lors dune DT, en labsence de modification des niveaux dARNm. Ces rsultats suggrent une rgulation post-transcriptionnelle de lexpression des transporteurs du glutamate en condition de DT. Les tudes bases sur lutilisation dinhibiteurs spcifiques des facteurs de transcription NFkB et de lenzyme nuclaire poly(ADP)ribose polymrase-1 (PARP-1) dmontrent que la rgulation de lexpression du transporteur GLT-1 est sous le contrle de voies de signalisation NFkB dpendantes de PARP-1. Cette tude dmontre une augmentation de lactivation de PARP-1 et de NFkB dans les rgions vulnrables chez le rat soumis une DT et en culture dastrocytes DT. Linhibition pharmacologique du facteur de transcription NFkB par le PDTC induit une augmentation des niveaux dexpression de GLT-1, tandis que linhibition de PARP-1 par le DPQ conduit linhibition de lhyperactivation de NFkB observe lors de DT. Lensemble de ces rsultats met en vidence un nouveau mcanisme de rgulation des transporteurs du glutamate par lactivation de PARP-1. Laccumulation de lactate est une caractristique de la DT. Un traitement avec le milieu de culture dastrocytes en condition de DT sur des cultures dastrocytes nafs induit une diminution de lexpression de GLT-1 ainsi quune inhibition de la capacit dabsorption du glutamate par les astrocytes nafs. En revanche, ladministration de lactate exogne ne modifie pas le niveau dexpression protique de GLT-1. Ainsi, des facteurs solubles autres que le lactate sont scrts par des astrocytes en condition de perturbation mtabolique et peuvent potentiellement rguler lactivit des transporteurs du glutamate et contribuer la pathogense du syncytium astroglial. En outre, la ceftriaxone, un antibiotique de la famille des -lactamines, augmente de faon diffrentielle lexpression du variant-dpissage GLT-1 dans le colliculus infrieur chez le rat DT et en culture dastrocytes DT. Ces rsultats suggrent que la ceftriaxone peut constituer une avenue thrapeutique dans la rgulation de lactivit des transporteurs du glutamate lors de DT. Pour conclure, la mort cellulaire dorigine excitotoxique lors de DT survient en consquence dune dysfonction mitochondriale associe une perturbation du mtabolisme nergtique crbral. La modification de lexpression des transporteurs du gluatamate est sous le contrle des voies de signalisation NFkB dpendantes du facteur PARP-1. De plus, linhibition mtabolique et laugmentation des scrtions de lactate observes lors de DT peuvent galement constituer un autre mcanisme physiopathologique expliquant la diminution dexpression des transporteurs de glutamate. Enfin, la ceftriaxone pourrait reprsenter une stratgie thrapeutique potentielle dans le traitement de la rgulation de lexpression des transporteurs du glutamate et de la perte neuronale associs lexcitotoxicit observe lors de DT.
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Les virus ont besoin dinteragir avec des facteurs cellulaires pour se rpliquer et se propager dans les cellules dhtes. Une tude de l'interactome des protines du virus d'hpatite C (VHC) par Germain et al. (2014) a permis d'lucider de nouvelles interactions virus-hte. L'tude a galement dmontr que la majorit des facteurs de l'hte n'avaient pas d'effet sur la rplication du virus. Ces travaux suggrent que la majorit des protines ont un rle dans d'autres processus cellulaires tel que la rponse inne antivirale et cibles pas le virus dans des mcanismes d'vasion immune. Pour tester cette hypothse, 132 interactant virus-htes ont t slectionns et valus par silenage gnique dans un criblage d'ARNi sur la production interferon-beta (IFNB1). Nous avons ainsi observ que les rductions de l'expression de 53 interactants virus-hte modulent la rponse antivirale inne. Une tude dans les termes de gne d'ontologie (GO) dmontre un enrichissement de ces protines au transport nuclocytoplasmique et au complexe du pore nuclaire. De plus, les gnes associs avec ces termes (CSE1L, KPNB1, RAN, TNPO1 et XPO1) ont t caractris comme des interactant de la protine NS3/4A par Germain et al. (2014), et comme des rgulateurs positives de la rponse inne antivirale. Comme le VHC se rplique dans le cytoplasme, nous proposons que ces interactions des protines associes avec le noyau confrent un avantage de rplication et bnficient au virus en interfrant avec des processus cellulaire tel que la rponse inne. Cette rponse inne antivirale requiert la translocation nuclaire des facteurs transcriptionnelles IRF3 et NF-B p65 pour la production des IFNs de type I. Un essai de microscopie a t dvelopp afin d'valuer leffet du silenage de 60 gnes exprimant des protines associs au complexe du pore nuclaire et au transport nuclocytoplasmique sur la translocation dIRF3 et NF-B p65 par un criblage ARNi lors dune cintique d'infection virale. En conclusion, ltude dmontre quil y a plusieurs protines qui sont impliqus dans le transport de ces facteurs transcriptionnelles pendant une infection virale et peut affecter la production IFNB1 diffrents niveaux de la rponse d'immunit antivirale. L'tude aussi suggre que l'effet de ces facteurs de transport sur la rponse inne est peut tre un mcanisme d'vasion par des virus comme VHC.
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Thse numrise par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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"Mmoire prsent la Facult des tudes suprieures en vue de l'obtention du grade de L.L.M. en droit des affaires"
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La rsistance linsuline et le diabte de type 2 (DT2) sont caractriss par une hyperlipidmie. Le but de cette tude est de dterminer si le DT2 contribue au drglement du mtabolisme du cholestrol au niveau du petit intestin et du foie du Psammomys obesus, un modle animal nutritionnel dinduction de la rsistance linsuline et du DT2. Labsorption intestinale du cholestrol est diminue chez les animaux diabtiques. Cette diminution est associe une baisse (i) de lexpression gnique et protique de NPC1-L1 qui joue un rle primordial dans labsorption du cholestrol au niveau des entrocytes; et (ii) de lARNm de lABCA1 responsable de lefflux de cholestrol des cellules intestinales lapolipoprotine A-I et aux HDLs. En ce qui a trait aux transporteurs SR-B1 et Annexin II, aucune diffrence na t observe au niveau intestinal. Toutefois, une diminution significative de lexpression gnique de lABCG5, un intervenant majeur dans la scrtion du cholestrol des entrocytes vers la lumire intestinale, est mesure chez les animaux diabtiques. De plus, lexpression protique est diminue pour le PCSK9 et augmente pour le LDLr au niveau du jjunum, tandis que la quantit de protine de lenzyme HMG-CoA rductase est rgule la baisse chez les Psammomys obesus diabtiques. Finalement, de tous les facteurs de transcription tests seule une augmentation de LXR et une diminution de PPAR/ sont dtectes au niveau de lintestin. Au niveau hpatique, il y a (i) une augmentation de la masse protique de NPC1-L1, SR-BI et Annexin II; (ii) une lvation lARNm de SR-BI; (iii) une diminution du contenu protique de ABCG8 et de lexpression gnique de lABCG5 et de lABCA1; et (iv) une lvation de lARNm de LXR et de PPAR/, tout comme une baisse de lexpression protique de SREBP-2. Somme toute, nos rsultats montrent que le dveloppement du diabte de type 2 chez le Psammomys obesus entrane un changement dans la machinerie intra-entrocytaire et hpatocytaire, qui mne un drglement de lhomostasie du cholestrol.
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Le myo-inositol (MI) est un solut organique impliqu dans diverses fonctions physiologiques de la cellule dont la signalisation cellulaire. Il est galement un osmolyte compatible reconnu. Trois co-transporteurs de type actif secondaire responsables de son absorption ont t identifis. Deux dentre eux sont coupls au transport du sodium (SMIT1 et SMIT2) et le troisime est coupl au transport de protons (HMIT). Lobjectif de cette tude a t la caractrisation du transport du MI par SMIT2 dans des membranes en bordure en brosse (BBMv) issues du rein de lapin et de lintestin de rat ainsi quaprs expression dans les ovocytes de Xenopus laevis. La quantification de lARNm de SMIT1 et de SMIT2 dans le rein nous a appris que SMIT1 est majoritairement prsent dans la mdullaire alors que SMIT2 est principalement localis dans le cortex. Ces rsultats ont t confirms par immunobuvardage en utilisant un anticorps dirig contre SMIT2. Grce linhibition slective de SMIT1 par le L-Fucose et de SMIT2 par le D-chiro-inositol (DCI), nous avons dmontr que SMIT2 semble le seul responsable du transport luminal de MI dans le tubule contourn proximal avec un Km de 57 14 M. Pour ce qui est de lintestin, des tudes de transport de MI radioactif ont dmontr une absence de transport de MI chez le lapin alors que lintestin de rat prsente un transport de MI trs actif. Une quantification par qRT-PCR nous a permis de constater que lintestin de lapin ne semble pas possder les transporteurs de MI ncessaires. Comme pour le rein, SMIT2 semble le seul transporteur de MI prsent au niveau du ple apical des entrocytes intestinaux chez le rat. Il est charg du prlvement du MI de l'alimentation avec un Km de 150 40 M. Les analyses fonctionnelles excutes sur SMIT2 de rat en lectrophysiologie aprs expression dans les ovocytes de Xenopus laevis donnent sensiblement les mmes rsultats que pour les BBMv de rein de lapin et dintestin de rat. Dans les ovocytes, SMIT2 prsente une grande affinit pour le MI (270 19 M) et le DCI (310 60 M) et aucune affinit pour le L-fucose. Il est ii galement trs sensible la phlorizine (16 7 M). Une seule exception persiste : la constante daffinit pour le glucose dans les BBMv dintestin de rat est 40 fois plus petite que celle observe sur les ovocytes de Xenopus laevis. Nous avons galement test la capacit de certains transporteurs de sucre prsents la surface des membranes apicales des entrocytes prlever le MI. Vu que l'inhibition de ces transporteurs (SGLT1 et GLUT5) ne changeait rien au taux de MI radioactif transport, nous en avons conclu qu'ils ne sont pas impliqus dans son transport. Finalement, lefflux de MI partir du ple basolatral des entrocytes nest pas effectu par GLUT2 puisque ce dernier lorsqu'il est exprim dans des ovocytes, est incapable de transporter le MI.
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Le testicule assure la production des spermatozodes et la scrtion de la testostrone. Chaque fonction est assume par un compartiment cellulaire distinct: lpithlium sminifre et le tissu interstitiel. Le cholestrol, prsent dans les deux compartiments, est un compos indispensable aux membranes cellulaires et un prcurseur essentiel de la testostrone. Dans le compartiment interstitiel, environ 40 % du cholestrol utilis pour la production hormonale est import du sang partir des lipoprotines HDL et/ou LDL. Dans lpithlium sminifre, la cellule de Sertoli assure le contrle et le maintien de la spermatogense. Elle a la capacit de synthtiser du cholestrol partir de lactate in vitro, nanmoins, il ny a pas dvidence quelle le fait in vivo. De plus il existe, au niveau des tubules sminifres, une barrire hmato-testiculaire qui empche le libre passage de plusieurs composs sanguins, y compris le cholestrol. Nous avons test lhypothse quil existe des moyens dimportation du cholestrol sanguin, mais aussi lexportation du cholestrol intra-tissulaire, qui contourneraient cette barrire et qui contribueraient au maintien du taux intratubulaire du cholestrol compatible avec le bon droulement de la spermatogense. Nous avons compar les taux de variation de lexpression de lARNm et de la protine des transporteurs slectifs de cholestrol SR-BI, SR-BII, CD36 et ABCA1 aux taux de variation du cholestrol libre et estrifi au cours de la spermatogense chez les souris normales durant le dveloppement postnatal. Afin de mieux apprcier le niveau dimplication de chacun de ces rcepteurs, nous avons examin comment la suppression du gne dune enzyme comme la lypase hormono-sensible (HSL) ou de celui dun transporteur de cholestrol comme SR-BI, CD36 ou NPC1 tait compense et comment cette suppression affectait le taux de cholestrol libre et estrifi dans chacun des deux compartiments cellulaires du testicule. Nous avons dans un premier temps mis au point une nouvelle technique disolation des testicules en fraction enrichie en tissu interstitiel (ITf) et en tubules sminifres (STf) qui a lavantage de mieux prserver lintgrit des formes phosphoryles et glycosyles des protines compare aux techniques prexistantes. Les rsultats de nos analyses ont montr que lexpression de SR-BI et CD36 taient maximales dans les ITf au moment o les souris ont complt leur maturit sexuelle et o le niveau de synthse de la testostrone tait maximal. Dans les tubules sminifres, lexpression maximale de SR-BI et le taux le plus lev de cholestrol estrifi taient mesurs de faon concomitante 35 jours aprs la naissance, au moment o la premire vague de lactivit spermatogntique tait complte. Lexpression de lABCA1 tait maximale au moment o le taux de cholestrol tait lev et minimale au moment o le taux de cholestrol tait le plus bas, alors que le niveau dexpression de CD36 tait maximal chez ladulte au moment o le taux de spermiation tait le plus lev. Lexpression de SR-BII variait peu dans les deux compartiments cellulaires durant le dveloppement. La suppression gntique de la HSL et de NPC1, qui cause une infertilit chez les souris mles, tait accompagne dune accumulation de cholestrol libre et estrifi dans les tubules sminifres. Par contre, la suppression gntique de SR-BI et CD36, qui ne causent pas dinfertilit chez les souris mles tait sans impact significatif sur le taux de cholestrol intratubulaire. Nous avons montr que linvalidation gntique dun transporteur slectif ou dune enzyme du mtabolisme du cholestrol tait accompagne dun ensemble de mcanismes de compensation visant maintenir le taux de cholestrol libre aux niveaux semblables ceux mesurs dans les fractions tissulaires de souris normales. Ensemble, nos rsultats ont montr que lexpression des transporteurs slectifs de cholestrol SR-BI, SR-BII, CD36 et ABCA1 variait en fonction de la spermatogense et du taux intratesticulaire du cholestrol suggrant leur contribution au maintien de lhomostasie du cholestrol intratesticulaire.
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De nombreuses tudes ont tabli que la majorit des neurones librent plus quune substance chimique. Il est bien connu que les neurones peuvent co-exprimer et co-librer des neuropeptides en plus de leur neurotransmetteur, mais des vidences de la co-libration de deux petits neurotransmetteurs action rapide se sont accumules rcemment. Des enregistrements lectrophysiologiques ont aussi montr que des neurones srotoninergiques et dopaminergiques isols peuvent librer du glutamate quand ils sont placs en culture. De plus, la prsence de glutamate et de glutaminase a t dtecte dans des neurones srotoninergiques, dopaminergiques et noradrnergiques par immunomarquage sur des tranches de cerveau. Malheureusement, en considrant le rle mtabolique du glutamate, sa dtection immunologique nest pas suffisante pour assurer le phnotype glutamatergique dun neurone. Rcemment, la dcouverte de trois transporteurs vsiculaires du glutamate (VGLUT1-3) a grandement facilit lidentification des neurones glutamatergiques. Ces transporteurs sont ncessaires pour la libration de glutamate et constituent les premiers marqueurs morphologiques du phnotype glutamatergique. Il a t dmontr que des neurones noradrnergiques expriment VGLUT2 et que des neurones srotoninergiques expriment VGLUT3. Mais aucune vidence dexpression dun des sous-types de VGLUT na t reporte pour les neurones dopaminergiques. Le but de notre travail tait didentifier quel sous-type de VGLUT est exprim par les neurones dopaminergiques msencphaliques, et de dterminer si le phnotype glutamatergique de ces neurones peut tre modul dans des conditions particulires. Premirement, nous avons utilis des microcultures pour isoler les neurones dopaminergiques et des doubles marquages immunocytochimiques pour observer lexpression de VGLUT dans les neurones positifs pour la tyrosine hydroxylase (TH). Nous avons montr que la majorit (80%) des neurones TH+ isols exprime spcifiquement VGLUT2. Cette expression est prcoce au cours du dveloppement in vitro et limite aux projections axonales des neurones dopaminergiques. Toutefois, cette forte expression in vitro contraste avec la non-dtection de ce transporteur dans les rats adultes in vivo. Nous avons dcid ensuite de regarder si lexpression de VGLUT2 pouvait tre rgule pendant le dveloppement crbral de jeunes rats et sous des conditions traumatiques, par double hybridation in situ. Entre 14 et 16 jours embryonnaires, les marquages de VGLUT2 et de TH montraient une superposition significative qui ntait pas retrouve des stades ultrieurs. Dans le msencphale de jeunes rats postnataux, nous avons dtect lARNm de VGLUT2 dans environs 1-2% des neurones exprimant lARNm de TH dans la substance noire et laire tegmentaire ventrale (ATV). Pour explorer la rgulation de lexpression de VGLUT2 dans des conditions traumatiques, nous avons utilis la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) pour lser les neurones dopaminergiques dans les jeunes rats. Dix jours aprs la chirurgie, nous avons trouv que 27% des neurones dopaminergiques survivants dans lATV exprimaient lARNm de VGLUT2 dans les rats 6-OHDA. Finalement, nous avons observ la colocalisation de la protine VGLUT2 dans les terminaisons TH positives par microscopie lectronique. Dans les rats normaux, la protine VGLUT2 est retrouve dans 28% des terminaisons axonales TH dans le noyau accumbens. Dans les rats lss la 6-OHDA, nous avons observ une diminution considrable des terminaisons TH positives, et une augmentation dans la proportion (37%) des terminaisons dopaminergiques prsentant du VGLUT2. Nos rsultats suggrent que le phnotype glutamatergique des neurones dopaminergiques est rgul au cours du dveloppement, peut tre ractiv dans des tats pathologiques, et que ces neurones peuvent librer du glutamate dans conditions spcifiques.
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Les scrtines peptidiques de lhormone de croissance (GHRPs) constituent une classe de peptides synthtiques capables de stimuler la scrtion de lhormone de croissance (GH). Cette activit est mdie par leur liaison un rcepteur coupl aux protines G : le rcepteur des scrtines de lhormone de croissance (GHS-R1a), identifi subsquemment comme le rcepteur de la ghrline. La ghrline est un peptide de 28 acides amins scrt principalement par les cellules de la muqueuse de lestomac, qui exerce de nombreux effets priphriques indpendamment de la scrtion de lhormone de croissance. Les effets indpendants de la scrtion de GH incluent, entre autres, des actions sur le contrle de la prise de nourriture, le mtabolisme nergtique, la fonction cardiaque, le systme immunitaire et la prolifration cellulaire. Ltude de la distribution priphrique des sites de liaison des GHRPs nous a permis didentifier un second site, le CD36, un rcepteur scavenger exprim dans plusieurs tissus dont le myocarde, lendothlium de la microvasculature et les monocytes/macrophages. Le CD36 exprim la surface du macrophage joue un rle cl dans linitiation du dveloppement de lathrosclrose par la liaison et linternalisation des lipoprotines de faible densit oxydes (LDLox) dans lespace sous-endothlial de lartre. Lhexarline, un analogue GHRP, a t dvelopp comme agent thrapeutique pour stimuler la scrtion de lhormone de croissance par lhypophyse. Sa proprit de liaison aux rcepteurs GHS-R1a et CD36 situs en priphrie et particulirement sa capacit dinterfrer avec la liaison des LDLox par le CD36 nous ont incit valuer la capacit de lhexarline moduler le mtabolisme lipidique du macrophage. Lobjectif principal de ce projet a t de dterminer les effets de lactivation des rcepteurs CD36 et GHS-R1a, par lhexarline et la ghrline, le ligand endogne du GHS-R1a, sur la physiologie du macrophage et de dterminer son potentiel anti-athrosclrotique. Les rsultats montrent premirement que lhexarline et la ghrline augmentent lexpression des transporteurs ABCA1 et ABCG1, impliqus dans le transport inverse du cholestrol, via un mcanisme contrl par le rcepteur nuclaire PPAR. La rgulation de lactivit transcriptionnelle de PPAR par lactivation des rcepteurs CD36 et GHS-R1a se fait indpendamment de la prsence du domaine de liaison du ligand (LBD) de PPAR et est consquente de changements dans ltat de phosphorylation de PPAR. Une tude plus approfondie de la signalisation rsultant de la liaison de la ghrline sur le GHS-R1a rvle que PPAR est activ par un mcanisme de concertation entre les voies de signalisation Gq/PI3-K/Akt et Fyn/Dok-1/ERK au niveau du macrophage. Le rle de PPAR dans la rgulation du mtabolisme lipidique par lhexarline a t dmontr par lutilisation de macrophages de souris htrozygotes pour le gne de Ppar gamma, qui prsentent une forte diminution de lactivation des gnes de la cascade mtabolique PPAR-LXR-transporteurs ABC en rponse lhexarline. Linjection quotidienne dhexarline un modle de souris prdisposes au dveloppement de lathrosclrose, les souris dficientes en apoE sous une dite riche en cholestrol et en lipides, se traduit galement en une diminution significative de la prsence de lsions athrosclrotiques correspondant une augmentation de lexpression des gnes cibles de PPAR et LXR dans les macrophages pritonaux provenant des animaux traits lhexarline. Lensemble des rsultats obtenus dans cette thse identifie certains nouveaux mcanismes impliqus dans la rgulation de PPAR et du mtabolisme du cholestrol dans le macrophage via les rcepteurs CD36 et GHS-R1a. Ils pourraient servir de cibles thrapeutiques dans une perspective de traitement des maladies cardiovasculaires.
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Introduction: L'homostasie du cholestrol est indispensable la synthse de la testostrone dans le tissu interstitiel et la production de gamtes mles fertiles dans les tubules sminifres. Les facteurs enzymatiques contribuent au maintien de cet quilibre intracellulaire du cholestrol. L'absence d'un ou de plusieurs enzymes telles que la HMG-CoA rductase, la HSL et l'ACAT-1 a t associe l'infertilit masculine. Toutefois, les facteurs enzymatiques qui contribuent au maintien de l'quilibre intra-tissulaire du cholestrol n'ont pas t tudis. Cette tude a pour but de tester l'hypothse que le maintien des taux de cholestrol compatibles avec la spermatogense ncessite une coordination de la fonction intracellulaire des enzymes HMG-CoA rductase, ACAT1 et ACAT2 et la HSL. Mthodes: Nous avons analys l'expression de lARNm et de la protine de ces enzymes dans les fractions enrichies en tubules sminifres (STf) de vison durant le dveloppement postnatal et le cycle reproductif annuel et dans les fractions enrichies en tissu interstitiel (ITf) et de STf durant le dveloppement postnatal chez la souris. Nous avons dvelopp deux nouvelles techniques pour la mesure de l'activit enzymatique de la HMG-CoA rductase et de celle de l'ACAT1 et ACAT2. En outre, l'immunohistochimie a t utilise pour localiser les enzymes dans le testicule. Enfin, les souris gntiquement dficientes en HSL, en SR-BI et en CD36 ont t utilises pour lucider la contribution de la HMG-CoA rductase, l'ACAT1 et l'ACAT2 et la HSL l'homostasie du cholestrol. Rsultats: 1) HMG-CoA rductase: (Vison) La variation du taux dexpression de lARNm de la HMG-CoA rductase tait corrle celle de l'isoforme de 90 kDa de la protine HMG-CoA rductase durant le dveloppement postnatal et chez l'adulte durant le cycle reproductif saisonnier. L'activit enzymatique de la HMG-CoA rductase augmentait de faon concomitante avec le taux protinique pour atteindre son niveau le plus lev 240 jours (3.6411e-7 mol/min/g de protines) au cours du dveloppement et en Fvrier (1.2132e-6 mol/min/g de protines) durant le cycle reproductif chez ladulte. (Souris), Les niveaux d'expression de l'ARNm et l'activit enzymatique de la HMG-CoA rductase taient maximales 42 jours. A l'oppos, le taux protinique diminuait au cours du dveloppement. 2) HSL: (Vison), l'expression de la protine de 90 kDa de la HSL tait leve 180- et 240 jours aprs la naissance, ainsi qu'en Janvier durant le cycle saisonnier chez l'adulte. L'activit enzymatique de la HSL augmentait durant le dveloppement pour atteindre un pic 270 jours (36,45 nM/min/g). Chez l'adulte, l'activit enzymatique de la HSL tait maximale en Fvrier. (Souris) Le niveau dexpression de l'ARNm de la HSL augmentait significativement 21-, 28- et 35 jours aprs la naissance concomitamment avec le taux d'expression protinique. L'activit enzymatique de la HSL tait maximale 42 jours suivie d'une baisse significative chez l'adulte. 3) ACAT-1 et ACAT-2: Le prsent rapport est le premier identifier lexpression de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 dans les STf de visons et de souris. (Vison) L'activit enzymatique de l'ACAT-2 tait maximale la compltion du dveloppement 270 jour (1190.00 CPMB/200 g de protines) et en janvier (2643 CPMB/200 g de protines) chez l'adulte. En revanche, l'activit enzymatique de l'ACAT-1 piquait 90 jours et en aot respectivement durant le dveloppement et chez l'adulte. (Souris) Les niveaux d'expression de l'ARNm et la protine de l'ACAT-1 diminuait au cours du dveloppement. Le taux de l'ARNm de l'ACAT-2, loppos du taux protinique, augmentait au cours du dveloppement. L'activit enzymatique de l'ACAT-1 diminuait au cours du dveloppement tandis que celle de l'ACAT-2 augmentait pour atteindre son niveau maximal 42 jours. 4) Souris HSL-/ -: Le taux dexpression de l'ARNm et l'activit enzymatique de la HMG-CoA rductase diminuaient significativement dans les STf de souris HSL-/- compars aux souris HSL+/+. Par contre, les taux de l'ARNm et les niveaux des activits enzymatiques de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 taient significativement plus levs dans les STf de souris HSL-/- compars aux souris HSL+/+ 5) Souris SR-BI-/-: L'expression de l'ARNm et l'activit enzymatique de la HMG-CoA rductase et de l'ACAT-1 taient plus basses dans les STf de souris SR-BI-/- compares aux souris SR-BI+/+. A l'oppos, le taux d'expression de l'ARNm et l'activit enzymatique de la HSL taient augmentes chez les souris SR-BI-/- compares aux souris SR-BI+/+. 6) Souris CD36-/-: L'expression de l'ARNm et l'activit enzymatique de la HMG-CoA rductase et de l'ACAT-2 taient significativement plus faibles tandis que celles de la HSL et de l'ACAT-1 taient inchanges dans les STf de souris CD36-/- compares aux souris CD36+/+. Conclusion: Nos rsultats suggrent que: 1) L'activit enzymatique de la HMG-CoA rductase et de la HSL sont associes l'activit spermatogntique et que ces activits ne seraient pas rgules au niveau transcriptionnel. 2) L'ACAT-1 et de l'ACAT-2 sont exprimes dans des cellules diffrentes au sein des tubules sminifres, suggrant des fonctions distinctes pour ces deux isoformes: l'estrification du cholestrol libre dans les cellules germinales pour l'ACAT-1 et l'efflux du cholestrol en excs dans les cellules de Sertoli au cours de la spermatogense pour l'ACAT-2. 3) La suppression gntique de la HSL diminuait la HMG-CoA rductase et augmentait les deux isoformes de l'ACAT, suggrant que ces enzymes jouent un rle critique dans le mtabolisme du cholestrol intratubulaire. 4) La suppression gntique des transporteurs slectifs de cholestrol SR-BI et CD36 affecte l'expression (ARNm et protine) et l'activit des enzymes HMG-CoA rductase, HSL, ACAT-1 et ACAT-2, suggrant l'existence dun effet compensatoire entre facteurs enzymatiques et non-enzymatiques du mtabolisme du cholestrol dans les fractions tubulaires. Ensemble, les rsultats de notre tude suggrent que les enzymes impliques dans la rgulation du cholestrol intratubulaire agissent de concert avec les transporteurs slectifs de cholestrol dans le but de maintenir l'homostasie du cholestrol intra-tissulaire du testicule.
Resumo:
Plusieurs souches cliniques de Candida albicans rsistantes aux mdicaments antifongiques azols surexpriment des gnes encodant des effecteurs de la rsistance appartenant deux classes fonctionnelles : i) des transporteurs expulsant les azoles, CDR1, CDR2 et MDR1 et ii) la cible des azoles 14-lanostrol dmthylase encode par ERG11. La surexpression de ces gnes est due la slection de mutations activatrices dans des facteurs de transcription doigts de zinc de la famille zinc cluster (Zn2Cys6) qui contrlent leur expression : Tac1p (Transcriptional activator of CDR genes 1) contrlant lexpression de CDR1 et CDR2, Mrr1p (Multidrug resistance regulator 1), rgulant celle de MDR1 et Upc2p (Uptake control 2), contrlant celle dERG11. Un autre effecteur de la rsistance clinique aux azoles est PDR16, encodant une transfrase de phospholipides, dont la surexpression accompagne souvent celle de CDR1 et CDR2, suggrant que les trois gnes appartiennent au mme rgulon, potentiellement celui de Tac1p. De plus, la rgulation transcriptionnelle du gne MDR1 ne dpend pas seulement de Mrr1p, mais aussi du facteur de transcription de la famille basic-leucine zipper Cap1p (Candida activator protein 1), un rgulateur majeur de la rponse au stress oxydatif chez C. albicans qui, lorsque mut, induit une surexpression constitutive de MDR1 confrant la rsistance aux azoles. Ces observations suggrent quun rseau de rgulation transcriptionnelle complexe contrle le processus de rsistance aux antifongiques azols chez C. albicans. Lobjectif de mon projet au doctorat tait didentifier les cibles transcriptionnelles directes des facteurs de transcription Tac1p, Upc2p et Cap1p, en me servant dapproches gntiques et de gnomique fonctionnelle, afin de i) caractriser leur rseau transcriptionnel et les modules transcriptionnels qui sont sous leur contrle direct, et ii) dinfrer leurs fonctions biologiques et ainsi mieux comprendre leur rle dans la rsistance aux azoles. Dans un premier volet, jai dmontr, par des expriences de gntique, que Tac1p contrle non seulement la surexpression de CDR1 et CDR2 mais aussi celle de PDR16. Mes rsultats ont identifi une nouvelle mutation activatrice de Tac1p (N972D) et ont rvl la participation dun autre rgulateur dans le contrle transcriptionnel de CDR1 et PDR16 dont lidentit est encore inconnue. Une combinaison dexpriences de transcriptomique et dimmunoprcipitation de la chromatine couple lhybridation sur des biopuces ADN (ChIP-chip) ma permis didentifier plusieurs gnes dont lexpression est contrle in vivo et directement par Tac1p (PDR16, CDR1, CDR2, ERG2, autres), Upc2p (ERG11, ERG2, MDR1, CDR1, autres) et Cap1p (MDR1, GCY1, GLR1, autres). Ces expriences ont rvl quUpc2p ne contrle pas seulement lexpression dERG11, mais aussi celle de MDR1 et CDR1. Plusieurs nouvelles proprits fonctionnelles de ces rgulateurs ont t caractrises, notamment la liaison in vivo de Tac1p aux promoteurs de ses cibles de faon constitutive et indpendamment de son tat dactivation, et la liaison de Cap1p non seulement la rgion du promoteur de ses cibles, mais aussi celle couvrant le cadre de lecture ouvert et le terminateur transcriptionnel putatif, suggrant une interaction physique avec la machinerie de la transcription. La caractrisation du rseau transcriptionnel a rvl une interaction fonctionnnelle entre ces diffrents facteurs, notamment Cap1p et Mrr1p, et a permis dinfrer des fonctions biologiques potentielles pour Tac1p (trafic et la mobilisation des lipides, rponse au stress oxydatif et osmotique) et confirmer ou proposer dautres fonctions pour Upc2p (mtabolisme des strols) et Cap1p (rponse au stress oxydatif, mtabolisme des sources dazote, transport des phospholipides). Mes tudes suggrent que la rsistance aux antifongiques azols chez C. albicans est intimement lie au mtabolisme des lipides membranaires et la rponse au stress oxydatif.
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L'interaction entre le systme immunitaire et le mtabolisme du fer est bien illustre par l'anmie des maladies chroniques (ACD), qui est frquemment rencontre dans les infections chroniques, l'inflammation et le cancer. La majorit des modifications dans les paramtres du fer observes dans lACD tient compte des modifications de lhomostasie du fer, avec la dlocalisation du mtal de la circulation et les sites de l'rythropose au compartiment de stockage dans les macrophages. Les mcanismes de la rponse hyposidrmique impliquent des cytokines, notamment TNF-alpha et IL-6, qui rgulent les niveaux de plusieurs gnes du mtabolisme du fer, y compris les transporteurs de fer et de l'hepcidine, un rgulateur ngatif de labsorption du fer, ce qui entrane l'inhibition de l'exportation du fer travers la ferroportine 1 (FPN1) au niveau de l'intestin et les macrophages. Des tudes antrieures ont montr que l'IL-6 induit lexpression dhepcidine dans les hpatocytes, mais il y a trs peu de donnes concernant la faon par laquelle l'hepcidine et la FPN1 sont rgules dans les macrophages. Rcemment, nous avons constat que l'induction de l'hepcidine dans le foie par le lipopolysaccharide (LPS) dpend de la voie de signalisation mdie par le rcepteur Toll-like 4 (TLR4). Le but de ce travail est didentifier les ligands des TLRs capables d'induire l'hepcidine dans les macrophages et de dterminer lexigence des TLRs dans linduction de lhepcidine et le dveloppement dhyposidrmie. En plus, nous voulons tudier leffet de linflammation cause par les ligands des TLRs sur le taux de fer srique, la production des cytokines et l'expression de lhepcidine et de la ferroportine. Dautre part nous voulons tudier leffet du taux du fer sur la production dIL-6 macrophagique en rponse la stimulation par le TLR4. D'abord, pour identifier les ligands des TLRs capables d'induire l'hepcidine dans les macrophages, nous avons trait les macrophages RAW 264.7 et les macrophages pritonaux de souris (MPMs) avec diffrents ligands TLRs et on a mesur lexpression de l'hepcidine par qRT-PCR. Nous avons observ que Pam3CSK4 (Pam), un ligand de TLR2/1; LPS, un ligand de TLR-4 et FSL1 un ligand de TLR2/6 induisent lexpression de l'hepcidine dans les cellules RAW 264.7 et les MPMs, contrairement au polyinosinic: polycytidylic acid (Poly I: C), un ligand de TLR3. De plus, LPS tait capable de rprimer lexpression de la ferroportine dans les cellules RAW 264.7. Afin de mieux dfinir la ncessit des TLRs pour assurer cette expression, nous avons utilis les souris TLR-2 knock-out et on a tabli que l'expression de l'hepcidine dans les macrophages par LPS, Pam ou FSL1 est dpendante du TLR2. En accord avec les expriences in vitro, les tudes effectues in vivo ont montr que LPS rprime lexpression de la ferroportine, ainsi que PolyI:C nest pas capable de stimuler l'expression d'hepcidine hpatique, par contre il tait efficace pour dclencher une hyposidrmie. Ensuite, on voulait dterminer la voie de signalisation utilise dans linduction de lhepcidine dans les macrophages. Comme il y deux voies majeures connues pour la signalisation des TLRs : une dpendante et lautre indpendante de la protine MyD88, on a tudi lexpression de lhepcidine dans les MPMs isols des souris MyD88-/- et nous avons constat que l'absence de signalisation MyD88 abolit l'induction de l'hepcidine dclenche par Pam, LPS et FSL1. Dautre part, la stimulation avec du LPS induisait in vivo la production dIL-6 et de TNF-alpha, et la stimulation dIL-6 tait renforce in vitro par la prsence du fer. Ces observations indiquent que lexpression de HAMP (Hepcidin Antimicrobial Peptide) dans les macrophages peut tre rgule par diffrents TLRs, ce qui suggre que la production d'hepcidine macrophagique fait partie d'une rponse immunitaire actives par les TLRs.
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La neuropathie sensitive et motrice hrditaire avec agnsie du corps calleux (NSMH/ACC) se traduit par une atteinte neurodgnrative svre associe des anomalies dveloppementales dans le systme nerveux central et du retard mental. Bien que rare dans le monde, ce dsordre autosomique rcessif est particulirement frquent dans la population Qubcoise du Canada Franais du fait dun effet fondateur. Lunique tude ralise sur la mutation qubcoise du gne qui code pour le co-transporteur de potassiumchlore 3 (KCC3) a montr quil y a une perte de fonction de la protine. Cependant, la maladie est galement retrouve hors du Qubec et il reste encore lucider les pathomcanismes mis en jeu. Nous avons donc squenc les 26 exons du gne KCC3 chez des individus recruts dans le monde entier et suspects dtre atteints de la maladie. Nous avons ainsi identifi trois nouvelles mutations. Ltude fonctionnelle de ces mutations nous a confirm la perte de fonction systmatique des co-transporteurs muts. Puisque linactivation de KCC3 se produit majoritairement via llimination de segments peptidiques en C-terminus, nous avons concentr notre attention sur lidentification des interactions qui sy produisent. laide dapproches double hybride, pull-down et immunomarquage, nous avons dtermin que KCC3 interagit avec la cratine kinase CK-B et que cette interaction est perturbe par les mutations tronquantes. De plus, lutilisation dun inhibiteur de cratine kinase inactive KCC3, ce qui dmontre quil existe bien un lien fonctionnel et pathologique entre KCC3 et ses partenaires C-terminaux. Nous avons aussi identifi des anomalies majeures de localisation membranaire des KCC3 muts. Que KCC3 soit tronqu ou pleine longueur, sa distribution subcellulaire est affecte dans des cellules en culture, dans les ovocytes de Xenopes et dans des chantillons de cerveau de patients. La perte dinteraction entre KCC3 et CK-B et/ou les dfauts de transit intracellulaire de KCC3 sont donc les mcanismes pathologiques majeurs de la NSMH/ACC.
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La pharmacope Cris est riche en plantes mdicinales et plusieurs dentre elles sont tudies par notre laboratoire pour leur potentiel antidiabtique. Certaines espces ont dmontr leur capacit stimuler la protine kinase active par lAMP (AMPK), une enzyme qui favorise la translocation de transporteurs de glucose la membrane (effet hypoglycmiant). LAMPK stimule galement dautres fonctions, telle loxydation des graisses, dans le but de rtablir lnergie cellulaire. Ce projet a comme objectifs dvaluer, premirement, le stress mtabolique induit par huit des extraits dans des cellules musculaires et des hpatocytes, effet qui serait responsable de lactivation de lAMPK. Ce stress peut tre dtermin en mesurant lacidification du milieu extracellulaire ainsi que la dpltion du contenu en ATP des cellules suite aux traitements. Le deuxime objectif est de mesurer lefficacit des extraits rduire le contenu en gras (oxydation des graisses) et ainsi normaliser la rsistance linsuline dans des hpatocytes rendus insulino-rsistants. Les hpatocytes sont rendus rsistants linsuline (condition fortement li lobsit) via traitement avec un acide gras satur, le palmitate. Les rsultats montrent que la majorit des extraits semble induire un stress mtabolique de courte dure dans les cellules. Parmi les extraits, seul un a russi faire diminuer significativement le taux de triglycrides intracellulaire suite au traitement au palmitate sans toutefois amliorer la sensibilit linsuline. En conclusion, le potentiel hypoglycmiant des extraits serait du leur capacit affecter la respiration mitochondriale (stress mtabolique). Toutefois, leur capacit amliorer la sensibilit linsuline na pu tre tablie.
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Contexte - La variation interindividuelle de la rponse aux corticostrodes (CS) est un problme important chez les patients atteints de maladies inflammatoires dintestin. Ce problme est bien plus accentu chez les enfants avec la prvalence de la corticodpendance extrmement (~40 %) leve. La maladie rfractaire au CS a des rpercussions sur le dveloppement et le bien-tre physique et psychologique des patients et impose des cots mdicaux levs, particulirement avec la maladie active comparativement la maladie en rmission, le cot tant 2-3 fois plus lev en ambulatoire et 20 fois plus lev en hpital. Il est ainsi primordial de dterminer les marqueurs prdictifs de la rponse aux CS. Les efforts prcdents de dcouvrir les marqueurs cliniques et dmographiques ont t quivoques, ce qui souligne davantage le besoin de marqueurs molculaires. L'action des CS se base sur des processus complexes dtermins gntiquement. Deux gnes, le ABCB1, appartenant la famille des transporteurs transmembraneaux, et le NR3C1, encodant le rcepteur glucocorticode, sont des lments importants des voies mtaboliques. Nous avons postul que les variations dans ces gnes ont un rle dans la variabilit observe de la rponse aux CS et pourraient servir en tant que les marqueurs prdictifs. Objectifs - Nous avons vis : (1) examiner le fardeau de la maladie rfractaire aux CS chez les enfants avec la maladie de Crohn (MC) et le rle des caractristiques cliniques et dmographiques potentiellement lis la rponse; (2) tudier l'association entre les variantes d'ADN de gne ABCB1 et la rponse aux CS; (3) tudier les associations entre les variantes d'ADN de gne NR3C1 et la rponse aux CS. Mthodes - Afin datteindre ces objectifs, nous avons men une tude de cohorte des patients recruts dans deux cliniques pdiatriques tertiaires de gastroentrologie lOttawa (CHEO) et Montral (HSJ). Les patients avec la MC ont t diagnostiqus avant l'ge de 18 ans selon les critres standard radiologiques, endoscopiques et histopathologiques. La corticorsistance et la corticodpendance ont t dfinies en adaptant les critres reconnus. LADN, acquise soit du sang ou de la salive, tait gnotype pour des variations travers de gnes ABCB1 et NR3C1 slectionnes laide de la mthodologie de tag-SNP. La frquence de la corticorsistance et la corticodpendance a t estime assumant une distribution binomiale. Les associations entre les variables cliniques/dmographiques et la rponse aux CS ont t examines en utilisant la rgression logistique en ajustant pour des variables potentielles de confusion. Les associations entre variantes gntiques de ABCB1 et NR3C1 et la rponse aux CS ont t examines en utilisant la rgression logistique assumant diffrents modles de la transmission. Les associations multimarqueurs ont t examines en utilisant l'analyse de haplotypes. Les variantes nongnotypes ont t imputes en utilisant les donnes de HAPMAP et les associations avec SNPs imputs ont t examines en utilisant des mthodes standard. Rsultats - Parmi 645 patients avec la MC, 364 (56.2%) ont reu CS. La majorit de patients taient des hommes (54.9 %); prsentaient la maladie de liloclon (51.7%) ou la maladie inflammatoire (84.6%) au diagnostic et taient les Caucasiens (95.6 %). Huit pourcents de patients taient corticorsistants et 40.9% - corticodpendants. Le plus bas ge au diagnostic (OR=1.34, 95% CI: 1.03-3.01, p=0.040), la maladie cxistante de la rgion digestive suprieure (OR=1.35, 95% CI: 95% CI: 1.06-3.07, p=0.031) et lusage simultan des immunomodulateurs (OR=0.35, 95% CI: 0.16-0.75, p=0.007) ont t associs avec la corticodpendance. Un total de 27 marqueurs gnotyps travers de ABCB1 (n=14) et NR3C1 (n=13) ont t en l'quilibre de Hardy-Weinberg, lexception dun dans le gne NR3C1 (rs258751, exclu). Dans ABCB1, l'allle rare de rs2032583 (OR=0.56, 95% CI: 0.34-0.95, p=0.029) et gnotype htrozygote (OR=0.52, 95% CI: 0.28-0.95 p=0.035) ont t ngativement associes avec la dpendance de CS. Un haplotype 3 marqueurs, comprenant le SNP fonctionnel rs1045642 a t associ avec la dpendance de CS (p empirique=0.004). 24 SNPs imputs introniques et six haplotypes ont t significativement associs avec la dpendance de CS. Aucune de ces associations n'a cependant maintenu la signification aprs des corrections pour des comparaisons multiples. Dans NR3C1, trois SNPs: rs10482682 (OR=1.43, 95% CI: 0.99-2.08, p=0.047), rs6196 (OR=0.55, 95% CI: 0.31-0.95, p=0.024), et rs2963155 (OR=0.64, 95% CI: 0.42-0.98, p=0.039), ont t associs sous un modle additif, tandis que rs4912911 (OR=0.37, 95% CI: 0.13-1.00, p=0.03) et rs2963156 (OR=0.32, 95% CI: 0.07-1.12, p=0.047) - sous un modle rcessif. Deux haplotypes incluant ces 5 SNPs (AAACA et GGGCG) ont t significativement (p=0.006 et 0.01 empiriques) associs avec la corticodpendance. 19 SNPs imputs ont t associs avec la dpendance de CS. Deux haplotypes multimarqueurs (p=0.001), incluant les SNPs gnotyps et imputs, ont t associs avec la dpendance de CS. Conclusion - Nos tudes suggrent que le fardeau de la corticodpendance est lev parmi les enfants avec le CD. Les enfants plus jeunes au diagnostic et ceux avec la maladie coexistante de la rgion suprieure ainsi que ceux avec des variations dans les gnes ABCB1 et NR3C1 taient plus susceptibles de devenir corticodpendants.
