Étude de la fonction ovarienne chez les souris déficientes des enzymes hyaluronidases

Les mammifères femelles naissent avec un très grand nombre de follicules ovariens primordiaux (104-106); par contre, la grande majorité (99%) de ces follicules n’atteignent jamais la maturité et subissent l’atrésie, principalement par l’apoptose des cellules de la granulosa. Notre laboratoire a démontré que les hyaluronidases des mammifères induisent l’apoptose des cellules de la granulosa et sont impliquées dans l’atrésie des follicules mais que cet effet apoptotique ne serait pas dû à leur activité enzymatique. Notre modèle propose que les hyaluronidases aient un rôle dans les follicules non destinés à ovuler. Le but de la présente étude est d’évaluer la folliculogénèse et la fertilité des souris déficientes de ces enzymes. Les résultats montrent que la délétion de Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne des souris mais qu’il pourrait y avoir un effet compensatoire par Hyal-1 chez les souris déficientes de Hyal-3 étant donné que son expression est augmentée chez ces souris. La délétion de Hyal-1 a pour effet d’augmenter le nombre des follicules primordiaux, primaires et secondaires, particulièrement chez les souris de bas âge, et de diminuer le niveau d’apoptose des cellules de la granulosa. Afin d’évaluer la fonction de Hyal-1, -2 et -3 sans effet compensatoire entre elles, nous avons voulu créer une souris déficiente des ces 3 hyaluronidases spécifiquement dans les gonades en utilisant le système Cre/loxP. Un vecteur contenant la séquence Cre sous le contrôle du promoteur de Inhibin-α, qui conduit l’expression des gènes en aval chez les cellules somatiques des gonades, a été construit avec succès. En conclusion, cette étude nous révèle que Hyal-3 ne semble pas affecter la fonction ovarienne mais que la délétion de Hyal-1 augmente la folliculogénèse et diminue l’apoptose des cellules de la granulosa.

Étiopathogenèse de la scoliose idiopathique de l'adolescent : implication de la mélatonine et de l'ostéopontine

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est une maladie dont la cause est encore inconnue, et qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin. La prévalence est de 4% dans la population adolescente au Québec. Cette pathologie affecte surtout les filles durant leur poussée de croissance pubertaire. Parmi plusieurs hypothèses émises, l’hypothèse neuroendocrinienne, impliquant une déficience en mélatonine comme agent étiologique de la SIA a suscité beaucoup d’intérêt. Cette hypothèse découle du fait que l’ablation de la glande pinéale chez le poulet produit une scoliose ressemblant sous plusieurs aspects à la pathologie humaine. La pertinence biologique de la mélatonine dans la scoliose est controversée, étant donné que la majorité des études chez l’homme n’ont pu mettre en évidence une diminution significative des niveaux de mélatonine circulante chez les patients scoliotiques. Nous avons démontré un dysfonctionnement dans la signalisation de la mélatonine au niveau des tissus musculo-squelettiques chez une série de patients atteints de SIA (Moreau & coll. 2004). Nous avons confirmé ce défaut chez un plus grand nombre de patients ainsi qu’en utilisant une nouvelle technologie (spectroscopie cellulaire diélectrique) n’ayant pas recours à un prétraitement des cellules donnant ainsi des résultats plus précis. Cette technique a montré la présence des mêmes groupes fonctionnels identifiés auparavant par la technique d’AMPc. Le dysfonctionnement de la signalisation de la mélatonine est dû à une phosphorylation accrue des protéines G inhibitrices. Ce défaut pourrait être causé par un déséquilibre de l’activité des kinases et phosphatases capables de réguler la phosphorylation des protéines Gi. Parmi ces kinases, PKCd a suscité initialement notre intérêt vu qu’elle peut phosphoryler les protéines Gi. Nous avons démontré que cette kinase interagit avec le récepteur de la mélatonine MT2 et que cette interaction varie selon le groupe fonctionnel auquel un patient SIA appartient. Par la suite nos travaux se sont dirigés vers la découverte d’effecteurs cellulaires régulés par la mélatonine et plus spécifiquement l’ostéopontine (OPN), compte tenu de son rôle présumé comme mécanorécepteur et dans certaines structures jouant un rôle dans la proprioception, le contrôle postural et la fonction vestibulaire. L’OPN a été identifiée initialement par sa surexpression au niveau protéique et de l’ARNm dans la musculature paraspinale uniquement chez les poulets scoliotiques. Nous avons également utilisé un autre modèle animal, la souris C57Bl/6 naturellement déficiente en mélatonine. Nous avons généré des souris bipèdes en amputant les membres antérieurs de souris OPN KO, des souris CD44 KO ainsi que des souris contrôles C57Bl/6. Nos résultats ont montré qu’aucune souris OPN KO (n=50) ou CD44 KO (n=60) ne développe la maladie, contrairement aux souris contrôles C57Bl/6 (n=50) dont 45% deviennent scoliotiques. Ces résultats nous ont poussés à investiguer le rôle de cette protéine dans l’étiopathogenèse de la maladie chez l’humain. Nos résultats ont montré une augmentation des niveaux circulants d’OPN chez les patients atteints de la SIA et que l’élevation en OPN corrélait avec la sévérité de la maladie. Nos études chez les enfants asymptomatiques nés de parents scoliotiques et qui sont plus à risque de développer la maladie ont aussi démontré des différences significatives au niveau des concentrations en OPN en comparaison avec les sujets sains. En effet, plusieurs enfants à risque présentaient des niveaux d’OPN supérieurs à 800ng/ml suggérant un plus grand risque de développer une scoliose indiquant aussi que l’augmentation des niveaux en OPN précède le début de la maladie.

Regulation of HMG-CoA reductase, HSL and ACAT expression and activity in testicular cholesterol metabolism in mink and in mouse following experimental genetic deletion

Introduction: L'homéostasie du cholestérol est indispensable à la synthèse de la testostérone dans le tissu interstitiel et la production de gamètes mâles fertiles dans les tubules séminifères. Les facteurs enzymatiques contribuent au maintien de cet équilibre intracellulaire du cholestérol. L'absence d'un ou de plusieurs enzymes telles que la HMG-CoA réductase, la HSL et l'ACAT-1 a été associée à l'infertilité masculine. Toutefois, les facteurs enzymatiques qui contribuent au maintien de l'équilibre intra-tissulaire du cholestérol n'ont pas été étudiés. Cette étude a pour but de tester l'hypothèse que le maintien des taux de cholestérol compatibles avec la spermatogenèse nécessite une coordination de la fonction intracellulaire des enzymes HMG-CoA réductase, ACAT1 et ACAT2 et la HSL. Méthodes: Nous avons analysé l'expression de l’ARNm et de la protéine de ces enzymes dans les fractions enrichies en tubules séminifères (STf) de vison durant le développement postnatal et le cycle reproductif annuel et dans les fractions enrichies en tissu interstitiel (ITf) et de STf durant le développement postnatal chez la souris. Nous avons développé deux nouvelles techniques pour la mesure de l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de celle de l'ACAT1 et ACAT2. En outre, l'immunohistochimie a été utilisée pour localiser les enzymes dans le testicule. Enfin, les souris génétiquement déficientes en HSL, en SR-BI et en CD36 ont été utilisées pour élucider la contribution de la HMG-CoA réductase, l'ACAT1 et l'ACAT2 et la HSL à l'homéostasie du cholestérol. Résultats: 1) HMG-CoA réductase: (Vison) La variation du taux d’expression de l’ARNm de la HMG-CoA réductase était corrélée à celle de l'isoforme de 90 kDa de la protéine HMG-CoA réductase durant le développement postnatal et chez l'adulte durant le cycle reproductif saisonnier. L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase augmentait de façon concomitante avec le taux protéinique pour atteindre son niveau le plus élevé à 240 jours (3.6411e-7 mol/min/μg de protéines) au cours du développement et en Février (1.2132e-6 mol/min/μg de protéines) durant le cycle reproductif chez l’adulte. (Souris), Les niveaux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase étaient maximales à 42 jours. A l'opposé, le taux protéinique diminuait au cours du développement. 2) HSL: (Vison), l'expression de la protéine de 90 kDa de la HSL était élevée à 180- et 240 jours après la naissance, ainsi qu'en Janvier durant le cycle saisonnier chez l'adulte. L'activité enzymatique de la HSL augmentait durant le développement pour atteindre un pic à 270 jours (36,45 nM/min/μg). Chez l'adulte, l'activité enzymatique de la HSL était maximale en Février. (Souris) Le niveau d’expression de l'ARNm de la HSL augmentait significativement à 21-, 28- et 35 jours après la naissance concomitamment avec le taux d'expression protéinique. L'activité enzymatique de la HSL était maximale à 42 jours suivie d'une baisse significative chez l'adulte. 3) ACAT-1 et ACAT-2: Le présent rapport est le premier à identifier l’expression de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 dans les STf de visons et de souris. (Vison) L'activité enzymatique de l'ACAT-2 était maximale à la complétion du développement à 270 jour (1190.00 CPMB/200 μg de protéines) et en janvier (2643 CPMB/200 μg de protéines) chez l'adulte. En revanche, l'activité enzymatique de l'ACAT-1 piquait à 90 jours et en août respectivement durant le développement et chez l'adulte. (Souris) Les niveaux d'expression de l'ARNm et la protéine de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement. Le taux de l'ARNm de l'ACAT-2, à l’opposé du taux protéinique, augmentait au cours du développement. L'activité enzymatique de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement tandis que celle de l'ACAT-2 augmentait pour atteindre son niveau maximal à 42 jours. 4) Souris HSL-/ -: Le taux d’expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase diminuaient significativement dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+. Par contre, les taux de l'ARNm et les niveaux des activités enzymatiques de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 étaient significativement plus élevés dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+ 5) Souris SR-BI-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-1 étaient plus basses dans les STf de souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. A l'opposé, le taux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HSL étaient augmentées chez les souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. 6) Souris CD36-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-2 étaient significativement plus faibles tandis que celles de la HSL et de l'ACAT-1 étaient inchangées dans les STf de souris CD36-/- comparées aux souris CD36+/+. Conclusion: Nos résultats suggèrent que: 1) L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de la HSL sont associées à l'activité spermatogénétique et que ces activités ne seraient pas régulées au niveau transcriptionnel. 2) L'ACAT-1 et de l'ACAT-2 sont exprimées dans des cellules différentes au sein des tubules séminifères, suggérant des fonctions distinctes pour ces deux isoformes: l'estérification du cholestérol libre dans les cellules germinales pour l'ACAT-1 et l'efflux du cholestérol en excès dans les cellules de Sertoli au cours de la spermatogenèse pour l'ACAT-2. 3) La suppression génétique de la HSL diminuait la HMG-CoA réductase et augmentait les deux isoformes de l'ACAT, suggérant que ces enzymes jouent un rôle critique dans le métabolisme du cholestérol intratubulaire. 4) La suppression génétique des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI et CD36 affecte l'expression (ARNm et protéine) et l'activité des enzymes HMG-CoA réductase, HSL, ACAT-1 et ACAT-2, suggérant l'existence d’un effet compensatoire entre facteurs enzymatiques et non-enzymatiques du métabolisme du cholestérol dans les fractions tubulaires. Ensemble, les résultats de notre étude suggèrent que les enzymes impliquées dans la régulation du cholestérol intratubulaire agissent de concert avec les transporteurs sélectifs de cholestérol dans le but de maintenir l'homéostasie du cholestérol intra-tissulaire du testicule.

Modulation des réactions alloimmunitaires par les cytokines maîtresses IFN-γ et TGF-β

L’injection de cellules immunologiquement compétentes à un hôte histo-incompatible amène une réaction qui peut se traduire par la maladie du greffon-contre-l’hôte (GVHD). La GVHD demeure une barrière importante à une utilisation plus répandue de la greffe allogénique de cellules hématopoïétiques (AHCT), pourtant un traitement efficace pour traiter de nombreuses maladies. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent cette pathologie pourrait en faciliter le traitement et la prévention. L’Interféron-gamma (IFN-γ) et le Transforming Growth Factor-béta (TGF-β) sont deux cytokines maîtresses de l’immunité impliquées dans la fonction et l’homéostasie des cellules greffées. Nous démontrons chez la souris que l’IFN-γ limite la reconstitution lympho-hématopoïétique de façon dose-dépendante en mobilisant des mécanismes d’apoptose et en inhibant la prolifération cellulaire. Le TGF-β est quant à lui généralement connu comme un immunosuppresseur qui contrôle l’immunité en utilisant plusieurs voies de signalisation. Le rôle relatif de ces voies en AHCT est inconnu. Nous avons étudié une de ces voies en greffant des cellules provenant de donneurs déficients pour le gène SMAD3 (SMAD3-KO), un médiateur central de la voie canonique du TGF-β, à des souris histo-incompatibles. Bien que l’absence de SMAD3 ne cause aucune maladie chez nos souris donneuses, l’injection de cellules SMAD3-KO amène une GVHD du colon sévère chez le receveur. Cette atteinte est caractérisée par une différenciation Th1 et une infiltration massive de granulocytes témoignant d’un rôle central de SMAD3 dans la physiologie des lymphocytes T CD4 et des cellules myéloïdes. Nous avons focalisé ensuite nos efforts sur le rôle de SMAD3 chez les lymphocytes T CD4 en sachant que SMAD3 était actif chez les lymphocytes T CD4 tolérants. Nous avons découvert que SMAD3 était rapidement inactivé après une activation des cellules T, suggérant que l’inactivation de SMAD3 était fonctionnellement importante pour briser l’état de tolérance. Des études de micro-puces d’ADNc nous ont montré que SMAD3 contrôlait en effet l’expression de nombreux transcrits de gènes connus comme étant reliés à la tolérance et/ou à des processus biologiques dont les rôles dans le maintien de la tolérance sont plausibles.

Caractérisation de la voie d'activation des interférons de type I

Codirecteur de recherche: Dr Sylvain Meloche

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 in human disease

Les maladies cardiovasculaires (MCV) demeurent au tournant de ce siècle la principale cause de mortalité dans le monde. Parmi les facteurs de risque, l’hypercholestérolémie et l’obésité abdominale sont directement liées au développement précoce de l’athérosclérose. L’hypercholestérolémie familiale, communément associée à une déficience des récepteurs des lipoprotéines de basse densité (LDLR), est connue comme cause de maladie précoce d’athérosclérose et de calcification aortique chez l’humain. La subtilisine convertase proprotéine/kexine du type 9 (PCSK9), membre de la famille des proprotéines convertases, est trouvée indirectement associée aux MCV par son implication dans la dégradation du LDLR. Chez l'humain, des mutations du gène PCSK9 conduisent soit à une hypercholestérolémie familiale, soit à une hypocholestérolémie, selon que la mutation entraîne un gain ou une perte de fonction, respectivement. Il demeure incertain si les individus porteurs de mutations causant un gain de fonction de la PCSK9 développeront une calcification aortique ou si des mutations entraînant une perte de fonction provoqueront une obésité abdominale. Dans cette étude, nous avons examiné : 1) l’effet d’une surexpression de PCSK9 dans le foie de souris sur la calcification aortique ; 2) les conséquences d’une déficience en PCSK9 (Pcsk9 KO), mimant une inhibition pharmacologique, sur le tissu graisseux. Nous avons utilisé un modèle de souris transgénique (Tg) surexprimant le cDNA de PCSK9 de souris dans les hépatocytes de souris et démontrons par tomographie calculée qu’une calcification survient de façon moins étendue chez les souris PCSK9 Tg que chez les souris déficientes en LDLR. Alors que le PCSK9 Tg et la déficience en LDLR causaient tous deux une hypercholestérolémie familiale, les niveaux seuls de cholestérol circulant ne parvenaient pas à prédire le degré de calcification aortique. Dans une seconde étude, nous utilisions des souris génétiquement manipulées dépourvues de PSCK9 et démontrons que l’accumulation de graisses viscérales (adipogenèse) apparaît régulée par la PCSK9 circulante. Ainsi, en l’absence de PCSK9, l’adipogenèse viscérale augmente vraisemblablement par régulation post-traductionnelle des récepteurs à lipoprotéines de très basse densité (VLDLR) dans le tissu adipeux. Ces deux modèles mettent en évidence un équilibre dynamique de la PCSK9 dans des voies métaboliques différentes, réalisant un élément clé dans la santé cardiovasculaire. Par conséquent, les essais d’investigations et d’altérations biologiques de la PCSK9 devraient être pris en compte dans un modèle animal valide utilisant une méthode sensible et en portant une attention prudente aux effets secondaires de toute intervention.

Caractérisation du système des endocannabinoïdes au niveau de la rétine adulte et en développement

Le système endocannaboïde (eCB) est constitué des ligands, des récepteurs – les plus étudiés étant les récepteurs CB1 et CB2 – et les enzymes de synthèse et de dégradation. Les ligands étant lipophiles, ils ne sont pas encapsulés dans des vésicules, ce qui place les enzymes de synthèse et de dégradation dans une position de régulateurs clés. Plusieurs études démontrent une participation du système eCB à des processus de développement dans le système nerveux central (SNC). La rétine est un modèle important pour l’étude de ces processus car elle contient plusieurs types cellulaires bien connus, dont le patron de développement est clairement établi. Pour l’instant très peu est connu sur l’expression du système eCB durant le développement rétinien. C’est dans ce cadre que les patrons d’expression du récepteur CB1 et de l’enzyme de dégradation FAAH ont été étudiés pendant le développement rétinien postnatal chez le rat. Pour identifier les types cellulaires exprimant ces protéines, des co-marquages ont été accomplis pour le récepteur CB1 ou FAAH et des marqueurs des types cellulaires rétiniens. À P1, les cellules ganglionnaires, amacrines, horizontales et mitotiques expriment le récepteur CB1. Les cellules ganglionnaires et amacrines cholinergiques sont FAAH-positives. Au cours du développement, certains types cellulaires démontrent une expression transitoire de ces deux protéines, suggérant une implication du système eCB dans les processus de développement. Nos données démontrent également une importante expression du système eCB dans la rétine adulte, ce qui soutient l’hypothèse de son implication dans la réponse rétinienne. En bref, des études fonctionnelles in vitro sur des rétines de non-mammifères ont révélées que le récepteur CB1 modulait la réponse des cônes et des cellules bipolaires. Malgré la récente démonstration de sa présence dans la rétine, il n’existe pas de d’étude sur le rôle du récepteur CB2 dans la rétine. Dans cette thèse, les conséquences fonctionnelles de l’élimination des récepteurs CB1 ou CB2 ont été évaluées chez des souris transgéniques. Les réponses rétiniennes ont été enregistrées par électrorétinographie chez des souris cnr1-/- (CB1R-KO) et cnr2-/- (CB2R-KO). Nos données suggèrent une implication différente pour chaque récepteur dans la formation de la réponse rétinienne

Analyse cinématique de la marche de travailleurs exposés à une surcharge mécanique sur l’articulation fémoro-tibiale (AF-T)

De nombreuses études concluent que la charge mécanique supportée par le genou, qu’elle soit reliée à l’obésité, aux sports intenses, à une altération biomécanique des structures de l’articulation ou à une exposition à des charges lourdes durant les activités occupationnelles, est considérée comme un facteur de risque important au développement de la gonarthrose. La gonarthrose reliée au travail a été le sujet de nombreuses études et plusieurs d’entre elles ont rapporté une prévalence accrue de la gonarthrose chez les travailleurs de certains domaines en particulier, comme la construction, la pose de plancher, la peinture, l’exploitation minière, l’agriculture et le travail en atelier et en milieu de la santé. Les personnes qui travaillent dans ces métiers sont exposées à des positions ou des activités nuisibles, comme travailler à genoux ou accroupi, monter des escaliers ou des échelles, transporter des changes lourdes et marcher de façon prolongée. Ces gestes surchargent l’articulation du genou, ce qui cause des modifications aux structures de l’articulation du genou ou aux adaptations neuromusculaires de patron de mouvement du genou. Ces modifications structurelles et adaptations neuromusculaires peuvent apporter des changements cinématiques à la marche qui peuvent initier la gonarthrose ou contribuer à sa progression. L’objectif principal de la présente étude était d’analyser l’effet d’une surcharge mécanique sur l’articulation fémoro-tibiale (AF-T) subie au travail lors d’une tâche de marche et comparer le patron cinématique de l’articulation fémoro-tibiale des travailleurs exposés à une surcharge mécanique à celui des travailleurs non exposés. Vingt-quatre travailleurs exposés à une surcharge mécanique et neuf travailleurs non exposés ont participé à l’étude. Les données cinématiques de la marche ont été enregistrées au niveau du genou dans des conditions cliniques en utilisant un système de suivi du mouvement électromagnétique. Les paramètres suivant ont été extraits et utilisés pour la comparaison des groupes : l’angle maximum lors du contact initial, l’angle ii maximum de flexion durant la réponse à la charge, l’angle minimum au moment de l’appui unipodal et l’étendue max-min du cycle. La comparaison des groupes pour les variables cliniques et cinématiques a été effectué par l’utilisation de tests-t bilatéraux (« Student-t tests ») et de tests ANCOVA utilisant le poids et la vitesse comme covariables. Les travailleurs exposés à une surcharge mécanique présentaient un plus grand angle de flexion de l’articulation fémoro-tibiale au contact initial, durant la réponse au chargement et à la phase unipodale et ils ont démontré une étendue d’angle moindre que les travailleurs non exposés. Nous croyons que les données cinématiques de la marche peuvent donner des idées sur les facteurs biomécaniques qui pourraient prédisposer les travailleurs au développement ou à la progression de la gonarthrose. Une meilleure compréhension de ces facteurs pourrait être un premier pas vers le développement d’une intervention plus efficace pour cette population.

The role of PPARgamma in cartilage growth and development using cartilage-specific PPARgamma knockout mice

Le cartilage est un tissu conjonctif composé d’une seule sorte de cellule nommée chondrocytes. Ce tissu offre une fondation pour la formation des os. Les os longs se développent par l'ossification endochondral. Ce processus implique la coordination entre la prolifération, la différenciation et l'apoptose des chondrocytes, et résulte au remplacement du cartilage par l'os. Des anomalies au niveau du squelette et des défauts liés à l’âge tels que l’arthrose (OA) apparaissent lorsqu’il y a une perturbation dans l’équilibre du processus de développement. À ce jour, les mécanismes exacts contrôlant la fonction et le comportement des chondrocytes pendant la croissance et le développement du cartilage sont inconnus. Le récepteur activateur de la prolifération des peroxysomes (PPAR) gamma est un facteur de transcription impliqué dans l'homéostasie des lipides. Plus récemment, son implication a aussi été suggérée dans l'homéostasie osseuse. Cependant, le rôle de PPARγ in vivo dans la croissance et le développement du cartilage est inconnu. Donc, pour la première fois, cette étude examine le rôle spécifique de PPARγ in vivo dans la croissance et le développement du cartilage. Les souris utilisées pour l’étude avaient une délétion conditionnelle au cartilage du gène PPARγ. Ces dernières ont été générées en employant le système LoxP/Cre. Les analyses des souris ayant une délétion au PPARγ aux stades embryonnaire et adulte démontrent une réduction de la croissance des os longs, une diminution des dépôts de calcium dans l’os, de la densité osseuse et de la vascularisation, un délai dans l’ossification primaire et secondaire, une diminution cellulaire, une perte d’organisation colonnaire et une diminution des zones hypertrophiques, une désorganisation des plaques de croissance et des chondrocytes déformés. De plus, la prolifération et la différenciation des chondrocytes sont anormales. Les chondrocytes et les explants isolés du cartilage mutant démontrent une expression réduite du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF)-A et des éléments de production de la matrice extracellulaire. Une augmentation de l’expression de la métalloprotéinase matricielle (MMP)-13 est aussi observée. Dans les souris âgées ayant une délétion au PPARγ, y est aussi noté des phénotypes qui ressemblent à ceux de l’OA tel que la dégradation du cartilage et l'inflammation de la membrane synoviale, ainsi qu’une augmentation de l’expression de MMP-13 et des néoépitopes générés par les MMPs. Nos résultats démontrent que le PPARγ est nécessaire pour le développement et l’homéostasie du squelette. PPARγ est un régulateur essentiel pour la physiologie du cartilage durant les stades de croissance, de développement et de vieillissement.

Implications des canaux K+ sur la régulation génique du canal ENaC, et impact de l'hyperglycémie sur le transport ionique et la réparation de l'épithélium respiratoire

Dans mon projet de doctorat, j’ai étudié des fonctions primordiales de l’épithélium respiratoire telles que la régulation du transport ionique, la clairance liquidienne et la réparation épithéliale. J’ai particulièrement mis l’emphase sur le rôle des canaux potassiques qui interviennent dans ces trois fonctions de l’épithélium respiratoire. J’ai tout d’abord prouvé que la modulation des canaux potassiques régulait l’activité du promoteur de αENaC, en partie via la voie de signalisation ERK1/2, dans des cellules alvéolaires. Cette régulation entraîne une variation de l’expression génique et protéique du canal ENaC. Physiologiquement, il en résulte une augmentation du phénomène de clairance liquidienne suite à l’activation des canaux K+, tandis que l’inhibition de ces canaux la diminue sévèrement. J’ai aussi pu démontrer que l’absence de canal KvLQT1 entraînait une diminution du courant (ENaC) sensible à l’amiloride, dans les cellules de trachée en culture primaire, isolées de souris KO pour kcnq1. Dans la seconde partie de mon étude, j’ai évalué l’impact de l’hyperglycémie sur la capacité de transport ionique et de réparation de cellules épithéliales bronchiques saines ou Fibrose Kystique. Mes résultats montrent que l’hyperglycémie diminue le transport transépithélial de chlore et le transport basolatéral de potassium. Des études préalables du laboratoire ayant montré que les canaux K+ et Cl- contrôlent les processus de réparation, j’ai donc évalué si ceux-ci étaient modifiés par l’hyperglycémie. Et en effet, l’hyperglycémie ralentit la vitesse de réparation des cellules issues des voies aériennes (CFBE-wt et CFBE-ΔF508). J’ai donc démontré que le transport de potassium intervenait dans des fonctions clés de l’épithélium respiratoire, comme dans la régulation génique de canaux ioniques, le contrôle de la clairance liquidienne alvéolaire, et que l’hyperglycémie diminuait le transport ionique (K+ et Cl-) et la réparation épithéliale.

Mécanismes cellulaires de l'induction du facteur de transcription Nur77 après un traitement aux antipsychotiques

Les antipsychotiques sont utilisés en clinique depuis plus de 50 ans pour pallier aux symptômes de la schizophrénie. Malgré une recherche intensive, les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’effet clinique de cette médication demeurent encore nébuleux. Ces drogues sont reconnues comme des antagonistes des récepteurs D2 de la dopamine et peuvent moduler la transcription génique dans le striatum. Au cours des recherches qui ont mené à l'écriture de cette thèse, nous avons exploré l’expression de Nur77, un facteur de transcription de la famille des récepteurs nucléaires, afin de caractériser le rôle de la dopamine, la sérotonine, l’adénosine et le glutamate dans la régulation génique contrôlée par les antagonistes D2. En premier lieu, nous avons examiné l’impact de la co-administration d’agents sérotonergiques et adrénergiques sur l’expression de l’ARNm de Nur77 induite par l’halopéridol, un antipsychotique de première génération. Nous avons observé que le 8-OH-DPAT et le MDL11939 préviennent partiellement l’induction de Nur77 dans le striatum. Au contraire, l’idazoxan potentialise l’effet de l’halopéridol sur l’expression de Nur77 alors que le prazosin reste sans effet. Ces résultats démontrent que l’expression striatale de Nur77 induite par l’halopéridol peut être modulée à la baisse avec un agoniste 5-HT1A ou un antagoniste 5-HT2A. Par la suite, nous avons évalué dans divers paradigmes expérimentaux l’effet de l’éticlopride, un antagoniste spécifique D2, afin d’explorer davantage le mécanisme de l’effet transcriptionnel des antagonistes D2. Étonnamment, la suppression de l’isoforme D2L chez la souris D2L KO ne réduit pas la réponse de l’éticlopride dans le striatum. Par contre, une lésion corticale avec l’acide iboténique bloque l’effet de l’éticlopride sur la transcription de Nur77, suggérant un rôle du glutamate. La combinaison d’un antagoniste des récepteurs métabotropes du glutamate de types 5 (mGluR5) et d’un antagoniste des récepteurs de l’adénosine A2A abolit complètement l’augmentation de la transcription de Nur77 induit par l’éticlopride dans le striatum. La modulation directe de l’expression striatale de Nur77 par les récepteurs mGluR5 et A2A a été confirmée dans un modèle de cultures organotypiques de tranches cérébrales. Ces résultats démontrent clairement que la modulation de l’expression génique dans le striatum, à la suite d’un traitement avec un antagoniste D2 pourrait être indépendante d’une interaction directe avec les récepteurs D2 post-synaptiques, et reposerait plutôt sur son interaction avec les récepteurs D2 hétérosynaptiques des afférences corticostriées et l’activation subséquente des récepteurs post-synaptiques du glutamate et de l’adénosine. En résumé, nos résultats suggèrent que l’interaction des antipsychotiques atypiques avec les récepteurs 5-HT2A et 5-HT1A pourrait expliquer la différence dans le patron d’expression génique induit par ces drogues en comparaison avec les antipsychotiques typiques. De plus, nos résultats révèlent un nouveau mécanisme d’action des antagonistes D2 et supportent un rôle primordial du glutamate et de l’adénosine dans les effets des antipsychotiques de première génération.

Régulation de la fonction ovarienne par la voie de signalisation des WNTs

Les WNTs sont des glycoprotéines sécrétées impliquées dans plusieurs processus tels que la spécification cellulaire, la prolifération, la différenciation, et beaucoup d’autres. Pour transmettre leur signal, les WNTs se lient aux récepteurs Frizzled (FZD) et au co-récepteur « Low-density-lipoprotein receptor Related Protein » (LRP) 6 ou 5, activant ainsi l’une des trois principales voies de signalisation: la voie de signalisation WNT/β-caténine (voie canonique), la voie « Planar Cell Polarity » (PCP) et la voie WNT/Ca2+ (voies non-canoniques). Des antagonistes de cette voie, les « Secreted Frizzled Related Protein » (SFRPs), peuvent aussi se lier aux WNTs pour empêcher leur liaison aux récepteurs FZDs. Bien que des rôles importants aient été associés à plusieurs composants de la voie des WNTs lors de la régulation de l’ovaire adulte, le fonctionnement exact de cette signalisation reste nébuleux. L’objectif global de cette thèse visait donc à mieux comprendre la voie de signalisation des WNTs au niveau de l’ovaire adulte de souris, par la caractérisation de deux autres composants de cette voie, FZD1 et SFRP4. La création et l’analyse de souris Fzd1 et Sfrp4 KO ont démontré que FZD1 est nécessaire pour la régulation des gènes associés à l’expansion du cumulus, dans le complexe ovocyte-cumulus (COC). Nous avons aussi constaté que SFRP4 avait un rôle à jouer lors de la régulation des gènes associés à l’expansion du cumulus mais cette fois, au niveau des cellules de la granulosa. Finalement, les résultats in vivo et in vitro de cette étude ont suggéré que la voie PCP, contrairement à la voie canonique, pourrait être modulée dans les cellules de la granulosa des souris Sfrp4 KO, possiblement grâce au signal induit par WNT4 et WNT5a. Ces données ont permis de créer un modèle hypothétique représentant la régulation de la signalisation ovarienne par les WNTs. Ce modèle servira de base pour l’élaboration de futurs projets de recherche visant à comprendre davantage la signalisation ovarienne et les possibles effets de sa dérégulation lors de processus pathologiques. Ces connaissances pourront ensuite être appliquées chez l’humain afin de traiter plusieurs maladies ou dérèglements ovariens.

Effet de la transmission cholinergique sur la cartographie fonctionnelle du cortex visuel du rongeur

La transmission cholinergique, et notamment muscarinique, joue un rôle déterminant dans le système nerveux central au niveau de la modulation de la plasticité neuronale. La libération d'ACh dans le cortex visuel est concomitante à la présentation de stimuli visuels. Par son action sur la transmission neuronale corticale, l'ACh module à long terme les réponses à de nouveaux stimuli sensoriels. Dans la présente étude, l'implication du système cholinergique au niveau du développement cortical et de la plasticité inductible chez l'adulte a été étudiée par les techniques d'imagerie optique des signaux intrinsèques et d'immunohistochimie chez le rongeur. Ces deux techniques de cartographie de l'activité corticale nous ont permis d'évaluer, d'une part, l'impact modulatoire de l'acétylcholine (ACh) et de ses récepteurs muscariniques (mAChRs, M1 à M5) sur l'organisation fonctionnelle du cortex visuel chez des souris déficitaires pour les mAChRs et, d'autre part, l'impact de la libération d'ACh lors d'un entraînement visuel, sur le nombre, la nature neurochimique et la localisation au niveau des couches corticales des neurones corticaux activés. L'implication du système cholinergique sur la cartographie du cortex visuel primaire a été étudiée sur les souris génétiquement modifiées délétères (knock out : KO) pour différentes combinaisons de sous-types de mAChRs. L'imagerie des signaux intrinsèques, basée sur les changements de réflectance corticale de la lumière survenant lors de la consommation d'oxygène par les neurones activés, a permis de déterminer, lors de stimulations visuelles, les différentes composantes des propriétés des neurones du cortex visuel. La taille des champs récepteurs des neurones est diminuée lors de l'absence du récepteur M1 ou de la combinaison M1/M3. Le champ visuel apparent est augmenté chez les souris M2/M4-KO mais diminué chez les M1-KO. La finesse des connectivités neuronales (évaluée par la mesure du scatter du signal) est réduite lors de l'absence des récepteurs M2/M4. Finalement, chez les animaux M1/M3-KO, une diminution de l'acuité visuelle est observée. L'effet à long-terme d'un entraînement visuel couplé à une stimulation des neurones cholinergiques sur la distribution et la nature des neurones immunoréactifs au c-Fos, c'est-à-dire les neurones activés, a été évalué. Puisque cette stimulation combinée est en mesure de produire des modifications comportementales, notamment au niveau de l'acuité visuelle, il devenait intéressant de s'attarder aux modifications neuroanatomiques et de déterminer quels éléments de l'équilibre excitateur/inhibiteur sont compromis chez ces animaux. Les résultats obtenus démontrent que les animaux ayant reçu une combinaison de l'entraînement cholinergique et visuel présentent une augmentation du marquage c-Fos comparativement aux animaux n'ayant reçu que la stimulation cholinergique. D'autre part, chez ces animaux, il est possible d'observer des modifications de l'équilibre excitateur/inhibiteur qui correspond au potentiel plastique de la région. En conclusion, ces études démontrent un rôle important du système cholinergique dans le développement, la maturation et la plasticité du système visuel cérébral.

Impact of (pro)renin receptor deficiency in adipose tissue using a genetically engineered mouse model

La stimulation du récepteur de la rénine/prorénine [(P) RR], un membre récemment découvert du système rénine-angiotensine (SRA), augmente l'activité du SRA et des voies de signalisation angiotensine II-indépendante. Pour étudier l'impact potentiel du (P)RR dans le développement de l`obésité, nous avons émis l'hypothèse que les souris déficientes en (P)RR uniquement dans le tissus adipeux (KO) auront une diminution du poids corporel en ciblant le métabolisme du tissu adipeux, l'activité locomoteur et/ou la prise alimentaire. Ainsi, des souris KO ont été générées en utilisant la technologie Cre/Lox. Le gain de poids et la prise alimentaire ont été évalués hebdomadairement dans les mâles et femelles KO et de type sauvage (WT) pendant 4 semaines alors qu’ils étaient maintenu sur une diète normal. De plus, un groupe de femelles a été placé pour 6 semaines sur une diète riche en gras et en glucides (HF/HC). La composition corporelle et l'activité ambulatoire ont été évaluées par l’EchoMRI et à l’aide de cages Physioscan, respectivement. Les tissus adipeux ont été prélevés et pesés. De plus, les gras péri-gonadaux ont été utilisés pour le microarray. Finalement, le niveaux d'expression d'ARNm du (P)RR ont été évalués. Comme le gène du (P)RR est situé sur le chromosome X, les mâles étaient des KOs complets et les femelles étaient des KOs partielles. Les souris KO avaient un poids corporel significativement plus petit par rapport à WT, les différences étant plus prononcées chez les mâles. De plus, les femelles KOs étaient résistantes à l'obésité lorsqu'elles ont été placées sur la diète HF/HC et donc elles avaient significativement moins de masse grasse par rapport aux WTs. L’analyse histologique des gras péri-gonadaux des KOs nous ont dévoilés qu’il avait une réduction du nombre d'adipocytes mais de plus grande taille. Bien qu'il n'y ait eu aucun changement dans la consommation alimentaire, une augmentation de près de 3 fois de l'activité ambulatoire a été détectée chez les mâles. De plus, nous avons observé que leurs tibias étaient de longueur réduite ce qui suggère fortement l'affection de leur développement. Les gras péri-gonadaux des souris KO avaient une expression réduite de l`ABLIM2 (Actin binding LIM protein family, member 2) qui est associé avec le diabète de type II chez l'humain. Ainsi, les données recueillies suggèrent fortement que le (P)RR est impliquée dans la régulation du poids corporelle.

The role of EphB6 and ephrinbs in blood pressure regulation

L’hypertension artérielle est le facteur de risque le plus important dans les maladies cardiovasculaires (MCV) et les accidents vasculaires cérébraux (AVC). L’hypertension artérielle essentielle est une maladie complexe, multifactorielle et polygénique. Même si on a identifié de nombreux facteurs de risque de l’hypertension artérielle, on ne comprend pas encore clairement les mécanismes qui la régissent. Les kinases hépatocytes produisant l’érythropoïétine (Eph) constituent la plus grande famille des récepteurs tyrosine kinase qui se lient à des ligands de surface cellulaire appelés éphrines sur les cellules avoisinantes. On sait que les interactions de Eph et des éphrines sont essentielles aussi bien dans les processus de développement que dans le fonctionnement des organes et des tissus adultes. Cependant on n’a pas encore étudié la relation entre Eph/éphrines et l’hypertension artérielle. Nous avons créé des modèles de souris knockout (K.O.) Ephb6-/-, Efnb1-/- et Efnb3-/- pour cette étude. Dans le modèle EphB6-/-, nous avons observé que les souris K.O. Ephb6 castrées, mais pas les femelles, ainsi que les souris mâles non castrées présentaient une tension artérielle élevée (TA) par rapport à leurs homologues de type sauvage (TS). Ceci suggère que Ephb6 doit agir de concert avec l’hormone sexuelle mâle pour réguler la TA. Les petites artères des mâles castrés Ephb6-/- présentaient une augmentation de la contractilité, une activation de RhoA et une phosphorylation constitutive de la chaîne légère de la myosine (CLM) lorsque comparées à celles de leurs homologues TS. Ces deux derniers résultats indiquent que la phosphorylation de CLM et de RhoA passe par la voie de signalisation de Ephb6 dans les cellules du muscle lisse de la paroi vasculaire (CMLV). Nous avons démontré que la réticulation de Efnbs mais non celle de Ephb6 aboutit à une réduction de la contractilité des CMLV. Ceci montre que l’effet de Ephb6 passe par la signalisation inversée à travers Efnb. Dans le modèle Efnb1-/- conditionnel spécifique au muscle lisse, nous n’avons observé aucune différence entre Efnb1-/- et les souris de TS concernant la mesure de la TA dans des conditions normales. Cependant, la TA des souris K.O. Efnb1 lors d’un stress d’immobilisation est supérieure à celle des souris de TS. Dans les petites artères des souris K.O. Efnb1, le rétrécissement et la phosphorylation de CLM étaient élevés. In vitro, la contractilité et l’activation RhoA de la CMLV des souris TS étaient augmentées quand leur Efnb1 était réticulé. Ces résultats corroborent ceux des souris KO Ephb6 et prouvent que l’effet de Ephb6 dans le contrôle de la TA se produit au moins par l’intermédiaire d’un de ses ligands Efnb1 dans les CMLV. Dans le modèle Efnb3-/-, on a observé une augmentation de la TA et du rétrécissement des vaisseaux chez les femelles Efnb3-/-, mais non chez les mâles; l’échographie a aussi révélé une résistance accrue au débit sanguin des souris K.O. femelles. Cependant la mutation de Efnb3 ne modifie pas la phosphorylation de la CLM ou l’activation de RhoA in vivo. Dans l’expérience in vitro, les CMLV des souris femelles Efnb3-/- ont présenté une augmentation de la contractilité mais pas celle des souris mâles Efnb3-/-. La réticulation des CMLV chez les mâles ou les femelles de TS avec solide anti-Efnb3 Ab peut réduire leur contractilité. Notre étude est la première à évaluer le rôle de Eph/éphrines dans la régulation de la TA. Elle montre que les signalisations Eph/éphrines sont impliquées dans le contrôle de la TA. La signalisation inverse est principalement responsable du phénotype élevé de la TA. Bien que les Efnb1, Efnb3 appartiennent à la même famille, leur fonction et leur efficacité dans la régulation de la TA pourraient être différentes. La découverte de Eph/Efnb nous permet d’explorer plus avant les mécanismes qui gouvernent la TA.